Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Фотодинамическая терапия с Смешанное проводящий полимер / фуллерен наночастиц фотосенсибилизаторов

doi: 10.3791/53038 Published: October 28, 2015

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

В фотодинамической терапии (PDT) фотосенсибилизаторов вводят целевой ткани, и при воздействии на свет фотосенсибилизатора генерирует активные формы кислорода (АФК). Виды ROS, такие как синглетный кислород и супероксид может вызвать окислительный стресс и последующее повреждение конструкции клеток и тканей 1-4. Благодаря простоте применения этот метод активно исследуются и клинические испытания были проведены 5,6. Тем не менее, существенные вопросы, такие как темно-токсичности сенсибилизаторов, чувствительность пациента к свету (в связи с неизбирательным распределением сенсибилизатора), и гидрофобность сенсибилизаторов (что приводит к снижению биодоступности и потенциальной токсичности) острой остается.

Здесь мы приводим метод для изготовления и экстракорпоральное оценки проведения полимерные наночастицы, смешанные с фуллерена в качестве следующего поколения фотосенсибилизаторов для ФДТ. Наночастицы образованы себе агрегацииполупроводниковый полимер MEH-PPV (поли [2-метокси-5- (2-этилгексилокси) -1,4-фениленвинилен]) с фуллерена PCBM (фенил-С 61 кислоты метиловый эфир масляной), когда эти материалы, растворенное в совместимом растворитель быстро вводят в не-совместимым растворителем (рис 1А). Выбор MEH-PPV в полимере мотивируется его высоким коэффициентом экстинкции, что приводит к высоким темпам формирования триплетного и эффективной и сверхбыстрой зарядки и передачи энергии в фуллерена PCBM 7. Эти свойства идеально подходят для сенсибилизации синглетного кислорода и супероксида в формировании PDT.

Фуллерены, по сути, был применен в PDT и в молекулярной и наночастиц форме 8-13. Тем не менее, тяжелые цитотоксичность препятствует дальнейшему развитию 12. Здесь мы показываем, что инкапсуляции фуллерен в принимающей матрицы MEH-PPV с получением композитных наночастиц MEH-PPV / PCBM результаты в сенсибилизирующего материала PDT, что яS сути не цитотоксические, показывает специфику по отношению к раковым клеткам в связи с размера наночастиц и поверхностного заряда, а урожайность высоко эффективное лечение PDT при низких дозах из-за света с вышеупомянутыми фотофизических свойств.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Культивирование клеточных линий

  1. Оттепель TE 71 (Mouse тимуса эпителиальные клетки), MDA-MB-231 (клетки рака молочной железы клетки), А549 (клетки рака легкого человека) и OVCAR3 (Human яичников опухолевые клетки) путем проведения криогенной флаконов в теплой воде в течение менее 2 мин , Добавьте 10 мл DMEM, дополненной 10% FBS в каждую клеточную линию и центрифуги в течение 6 мин при 106 х г в.
  2. Аспирируйте подвеску и добавить 3 мл средства массовой информации к осадку. Смешайте клетки должным образом с помощью пипетки несколько раз. Добавить эту ячейку решение подогретого 7 мл DMEM, дополненной 10% FBS в колбы Т75 и держать колбы в увлажненной атмосфере 95% воздуха / 5% CO 2 при 37 ° С. Добавьте описание этого колбу проходом 0.
  3. Когда конфлюентности клеток достигает 80%, сбора клеток путем инкубации их с 0,05% трипсина в течение 10 мин. Нейтрализовать трипсина путем добавления равного количества средств массовой информации. Центрифуга это решение в течение 6 мин при 106 х г в. Снимите подвеску и добавить 3 мл свежей среды к нему. Смешайте WELл и передавать небольшое количество (100 мкл) в культуральную колбу, содержащую 7 мл среды. Выдержите колбу культуры в инкубатор. Этикетка колбу проходом 1.
  4. Культура клеточные линии до прохода 11 или 12.

2. Изготовление наночастиц

  1. Подготовка ~ 10 -6 М (скорректированного) неразбавленного MEH-PPV раствора
    1. В пробирку добавляют 1 мг поли [2-метокси-5- (2-этилгексилокси) -1,4-фениленвинилен] (MEH-PPV) с молекулярной массой (средняя Mn) 150,000-250,000 г / моль и 3 мл тетрагидрофуран (ТГФ) , Смесь перемешивают в течение 2 ч при нагревании при 80 ° С на горячей плите.
    2. Фильтр вышеуказанного раствора в новый флакон с помощью шприца 0,2 мкм фильтр. Добавьте это решение как «неразбавленном MEH-PPV раствора». Это решение будет принимать участие в подготовке наночастиц после тонкой настройки концентрации, как описано в шагах 2.1.3 и 2.1.4.
    3. Добавить 50 мкл неразбавленного MEH-PPV маточного раствора в 3 мл ТГФ, Добавьте это решение как «разбавляют MEH-PPV раствора». Трансфер в 1 см кварцевой кювете и измеряют поглощение при 495 нм с помощью УФ-спектроскопии по отношению.
    4. Если поглощение разбавленного MEH-PPV раствора выше, чем 0,17, разбавить в неразбавленном MEH-PPV маточного раствора, добавляя больше 1 мл ТГФ, в то время, и повторите шаг 2.1.3 до тех пор, измеряется оптическая плотность при 495 нм не в в диапазоне 0.13-0.17.
    5. Рассчитать молярность разбавленной MEH-PPV маточного раствора с помощью закона Ламберта-Бера, как показано ниже. Вот 0,15 поглощение используется в качестве примера для остальной части протокола (т.е.., Отрегулируйте все следующие расчеты основаны на наблюдаемой оптической плотности), то MEH-PPV коэффициент поглощения используется 10 7 М -1 см -1, а длина пути используется 1 см.
      А = ε xbxc (уравнение 1)
      (ε - молярный коэффициент экстинкции, А - оптическая плотность, б - длина пути, с - концентрация раствора)
      0.15 = 10 7 М -1 см -1 х 1 см хс (уравнение 2)
      с = 1,5 х 10 -8 М (уравнение 3)
      Использование этой концентрации, чтобы найти концентрацию неразбавленного MEH-PPV маточного раствора следующим образом:
      М 1 V 1 = М 2 V 2 (уравнение 4)
      0,15 х 10 -7 М х 3050 мкл = М 2 х 50 мкл (уравнение 5)
      М 2 = 9,15 х 10 -7 М (уравнение 6)
      Это концентрация 'скорректированной неразбавленной MEH-PPV маточного раствора ".
  2. Расчет массы MEH-PPV в скорректированной неразбавленного MEH-PPV раствора
    1. Рассчитывают массу MEH-PPV в 1 мл скорректированного неразбавленного раствора, как показано ниже с помощью молярность полученной в разделе 2.1.4, а молекулярная масса (M w) от MEH-PPV, который 10 6 г / моль.
      М = N / V (п -. Не родинок, В - объем в л) (уравнение 7)
      Таким образом, масса MEH-PPV в 1 мл регулировать ундiluted раствор является 9,15 х 10 -4 г.
  3. Смешивание PCBM в MEH-PPV
    1. Рассчитайте массу фенил-C 61 масляной кислоты метилового эфира (PCBM), которые будут добавлены в фондовый MEH-PPV решения, чтобы сделать 50 мас% PCBM легированного решение MEH-PPV, где 50 мас% PCBM определяется по отношению к массе из MEH-PPV (т.е. половина масса MEH-PPV). При использовании вес MEH-PPV, полученного в разделе 2.2.
      Масса PCBM / 9.15 х 10 -4 г MEH-PPV х 100% = 50% мас PCBM (уравнение 8)
      Масса PCBM = 4,57 х 10 -4 г (уравнение 9)
    2. Взвесьте 1 мг PCBM в пробирке и добавить 500 мкл ТГФ. Рассчитать концентрацию PCBM в этом растворе с использованием молекулярного веса, как PCBM 910,88 г / моль
      Молярность раствора PCBM = 0,001 г / (910,88 г / моль * 500 мкл) (уравнение 10)
      Молярность раствора PCBM = 2.19 х 10 -9 моль / мкл (уравнение 11)
    3. Рассчитайте объем раствора PCBM нужно добавить к скорректированы в неразбавленном виде MEН-PPV раствор, чтобы получить 50 мас% PCBM легированного MEH-PPV раствор в ТГФ с помощью молярность рассчитывается в шаге 2.3.2
      4.57 х 10 -4 г PCBM х 1 моль / 910,88 GX 1 мкл / 2,19 х 10 -9 моль = 229 мкл (уравнение 12)
      Добавить 229 мкл раствора в PCBM 1 мл неразбавленной скорректированной MEH-PPV раствора и хорошо перемешать.
  4. Приготовление наночастиц методом переосаждение
    1. Передача 1 мл смешанного MEH-PPV / PCBM раствора в 1 мл шприц с иглой, прикрепленной к нему.
    2. Быстро придать 1 мл смешанного раствора MEH-PPV / PCBM в 4 мл дистиллированной воды при перемешивании 1200 оборотов в минуту. Остановка перемешивании сразу же после инъекции. С помощью этих наночастиц без дальнейшей обработки.

3. Инкубация клеточных линий с наночастицами для визуализации

ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты изображений были завершены в 35 мм чашках Петри

  1. Поглощение nanopartiциклы в клеточных линиях
    1. Культура клеток линии до 12-го прохода. На 12-й проезд культуры клеток в 35 мм чашки Петри. Регулировка концентрации клеток, добавленных к 35 мм чашки Петри таким, что после 24 ч клетки 40% сплошности.
    2. На этом этапе удалить носитель DMEM с добавлением 10% FBS из чашек Петри, промыть клетки с 1x ДЗФР дважды, и добавьте 100 мкл суспензии наночастиц в 2 мл DMEM с чашки Петри.
    3. После 24 часов удалить DMEM / наночастиц суспензии из чашек Петри и мыть клетки с 1x DPBS 3 раза. Затем зафиксировать клетки путем инкубации 4% параформальдегидом в течение 10 мин. Вымойте дважды DPBS. Пятно клеток с 300 нм DAPI путем инкубации с красителем в течение 2 мин. Вымойте дважды DPBS. Тогда держите клеток в DPBS для визуализации.
  2. Обнаружение АФК
    1. Культура А549 и OVCAR3 клеточные линии в чашках Петри, 6 в клеточной линии, как объяснено в разделе 3.1.1. ЭтикеткеЧашки Петри, как показано в таблице 1.
    2. Добавить 100 мкл суспензии наночастиц в 2 мл DMEM до трех чашек Петри, как показано в таблице 1, и инкубируют в течение 24 ч. Для чашек Петри, которые будут получать доз света, омывающих клетки после 24 часов и приостановить клеток в HBSS (Хэнка сбалансированный солевой раствор) окрашивают свободных средств массовой информации.
    3. Разминка лампы солнечного симулятора в течение 15 мин. Поместите УФ-фильтр перед лампой, чтобы отфильтровать УФ-светом. Калибровка лампы с опорной солнечной батареи, регулируя мощность лампы, чтобы получить 0,5 солнце (50 мВт / см 2) интенсивности на поверхности чашки Петри. В данном конкретном установки, что состояние было достигнуто при 218 Вт мощности, подводимой к лампе.
    4. Поместите чашки Петри под лампой (открытой крышкой) в течение 60 мин, в результате чего светло дозе 180 Дж / ​​см 2, как показано в приведенных ниже расчетов:
      50 мВт / см 2 х 3600 сек / 1000 = 180 Дж / ​​см 2
    5. Удалить HBSS и без стирки дополнительно добавляют 2 мл DMEM, дополненной 10% FBS в чашках Петри. Инкубируйте клетки в течение еще 2 ч.
    6. Для положительного контроля инкубировать клетки с 100 мкМ перекиси водорода (H 2 O 2) в течение 30 мин.
    7. Пятно клетки во всех чашках Петри с конечной концентрации 5 мкМ обнаружения реагента ROS инкубацией клеток с красителем в течение 30 мин при 37 ° С.
    8. Зафиксировать клетки путем инкубации 4% параформальдегидом в течение 10 мин. Вымойте дважды DPBS. Пятно клеток с 300 нм DAPI путем инкубации с красителем в течение 2 мин. Вымойте дважды DPBS. Тогда держите клеток в DPBS для визуализации.
  3. Апоптоз и некроз П. И. и аннексином V FITC
    1. Культура каждого клеточной линии в 5 чашках Петри. Три из этих чашках Петри будет для эксперимента, а оставшиеся 2 чашки Петри будет контрольные образцы. Инкубируйте 3 чашки Петри для эксперимента с наночастицами, как еxplained в разделе 3.1.2. Контрольные образцы не инкубировали с наночастицами.
    2. После 24 ч инкубации следовать шаг 3.2.3.
    3. Поместите 3 экспериментальные чашки Петри под лампой (открытой крышкой) и снимите один на 20 мин, один на 40 мин и один в 60 мин. Это дает три образца, которые были под воздействием света доз 60, 120 и 180 Дж / ​​см 2, соответственно (расчета в разделе 3.2.4). Далее, управлять 180 Дж / ​​см 2 света дозировку на одну из управления чашках Петри. Это управление с легкой дозы, применяемой в отсутствие наночастиц. Не применять легкую дозу оставшихся контрольного образца (нет наночастиц и свет дозу прилагается).
    4. Заменить HBSS с DMEM среде с 10% FBS и держать чашки Петри в инкубаторе в течение 4 час.
    5. Пятно клетки в экспериментальных и контрольных чашках Петри с 20 мкл аннексина V FITC путем инкубации клеток с красителем в течение 15 мин. Вымойте дважды DPBS. Пятно Cлоктей с 300 нм DAPI, а также 300 нМ PI (пропидийиодидом) путем инкубации с красителями в течение 2 мин. Вымойте дважды DPBS. Тогда держите клеток в DPBS для визуализации.

4. Внутренняя цитотоксичность наночастиц

  1. Подсчет клеток и культивирование в 96-луночных планшетах
    1. Сбора клеток из колбы с культурой, удаляя материал и промывки клеток дважды DPBS последующей инкубацией клеток с 0,05% трипсина в течение 10 мин. Добавить 2 мл DMEM, дополненной 10% FBS к полученному раствору клеток. Смешайте раствор правильно разделить ячейки кластеров в синглеты.
    2. Возьмем 100 мкл клеточной суспензии и добавить к 900 мкл DMEM среде с 10% FBS. Хорошо перемешать. Поместите 10 мкл этой суспензии на гемоцитометре. Граф клеток с использованием гемоцитометра и регулировать концентрацию суспензии клеток в 4.1.1 до 5 х 10 4 клеток / мл.
    3. Возьмите 5 96-луночных планшетах помечены как 0 ч, 24 чг, 48 ч, 72 ч и 96 ч. Добавьте 50 мкл 5 х 10 4 клеток / мл растворов клеточных (TE 71 и А549) в лунки, как показано в таблице 2, при этом посев 2500 клеток / лунку. Сделайте ту же процедуру для OVCAR3 и MDA-MB-231 клеточных линий.
    4. Через 24 часа мыть скважин с 1x DPBS и добавить 50 мкл возрастающих концентраций наночастиц в скважинах, как показано в таблице 2. Подготовьте различные концентрации наночастиц путем добавления 20, 100 и 180 мкл суспензии наночастиц из 2.4.2 DMEM к получения конечного объема 2 мл, что дает концентрации наночастиц 0,4 х 10 -4 мг / мл, 2,0 х 10 -4 мг / мл и 3,6 х 10 -4 мг / мл, соответственно. Каждая ячейка имеет трех повторах линия для каждой концентрации наночастиц.
  2. Измерение жизнеспособности клеток в темно-
    1. Добавить 10 мкл МТТ в 0 ч пластины сразу после добавления наночастиц. Инкубируйте планшет в течение 4 часов для формазанового CrystALS, чтобы сформировать. Добавить 50 мкл раствора солюбилизации в лунки. Инкубируйте планшет в течение 6 ч, чтобы растворить кристаллы формазана.
    2. Измерить клеток жизнеспособности 0 ч пластине путем записи оптической плотности при 570 нм микропланшет-ридере с.
    3. В течение 24 часов пластины, мыть клетки с 1x DPBS и добавить 50 мкл средств массовой информации в каждую лунку после 24 ч инкубации с наночастицами. Добавить МТТ и прочитать табличку, как это описывается в 4.2.1 и 4.2.2.
    4. В течение 48 ч, 72 ч и 96 ч пластин, промыть клетки 1х DPBS и добавить 50 мкл среды в лунки после 24 ч инкубации с наночастицами. Инкубируйте клетки для остальных периодов времени.
    5. 4.2.5) Измерьте жизнеспособность клеток в определенных точках времени, как описано в 4.2.1 и 4.2.2.
    6. Повторите эксперимент полный 3 раза (п = 3)

5. Измерение Жизнеспособность После PDT

  1. Подсчет клеток и культивирование в 96-луночных планшетах.
    1. Этикетка набор 96-луночные планшеты, как показано в таблице 3, как для ТЕ 71 + A549 пластин и OVCAR3 + MDA-MB-231 пластинах. Компоновка пластин будет таким же, как показано на 4.1.3.
    2. Семенной 96-луночных планшетах с, как описано в разделе 4.1 с же виде, как показано в таблице 2, в разделе 4.1.2.
    3. После 24 ч добавить наночастиц на пластины, как описано в разделе 4.1.4.
    4. 24 ч после добавления наночастиц промыть клетки 1х DPBS и добавить 50 мкл HBSS в каждую лунку.
    5. Облучают пластины с соответствующими световых дозах, как описано в пункте 3.2.3.
    6. Заменить HBSS с 50 мкл DMEM среде с 10% FBS и инкубировать пластины для соответствующих периодов времени после ФДТ.
    7. После каждого периода времени определения жизнеспособности клеток, как описано в 4.2.1 и 4.2.2.

6. флуоресцентной микроскопии

  1. Поглощение наночастиц
    1. Включите фонарей микроскопомй лазер 30 мин до визуализации. Поставьте чашку Петри, содержащую фиксированные клетки (как описано в разделе 3.1) на столик микроскопа.
    2. Сбор флуоресценции от наночастиц и DAPI, используя фильтры, как показано в таблице 4. Перекрытие фазового контраста, наночастицы и DAPI изображения в программном обеспечении ImageJ.
  2. Обнаружение АФК
    1. Включите ламп микроскопа 30 мин до визуализации. Поставьте чашку Петри, содержащую клетки (как описано в разделе 3.2) на столик микроскопа.
    2. Сбор флуоресценции от наночастиц, DAPI, и АФК обнаружения реагента с помощью фильтров, как показано в таблице 4. Наложение фазового контраста, наночастицы, DAPI и ROS обнаруживая реагентов изображения в программном обеспечении ImageJ.
  3. Апоптоз и некроз П. И. и аннексином V FITC
    1. Включите ламп микроскопа 30 мин до визуализации. Поместите чашку Петри, содержащую клетки (как описано враздел 3.3) на столик микроскопа.
    2. Сбор флуоресценции от наночастиц, DAPI, PI, и Аннексином V FITC, используя фильтры, как показано в таблице 4. Наложение фазового контраста, наночастицы, DAPI, PI и Аннексин V FITC изображения в программном обеспечении ImageJ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Поглощение и внутренняя цитотоксичность наночастиц

В 50 мас% смешанные наночастицы MEH-PPV / PCBM инкубировали с 71 ТЕ, MDA-MB-231, 549 и клеточные линии OVCAR3. Уровень PCBM смешивания была выбрана в качестве 50% по весу PCBM, который, как было показано, чтобы обеспечить идеальную переноса заряда и энергии между свойствами сопряженных полимеров и фуллеренов 14. Флуоресцентные изображения взаимодействие наночастиц показаны на рисунке 1В. Клетки инкубировали в течение 24 ч с наночастицами, чтобы обеспечить взаимодействие наночастиц. Затем клетки фиксировали 4% параформальдегидом, прежде изображений, и окрашивали DAPI для обнаружения клеток и расположение ядра. Для того, чтобы изображения достаточно разделенных клеток 40% слияния была сохранена. Флуоресцентные изображения с контрастными изображениями соответствующих фазовых показать, что есть льготный поглощение наночастиц в А549 и OVCAR3 клеточных линий рака. Без заметного флуоресценции можно увидеть в ТЕ 71 управленияи MDA-MB-231 линии раковых клеток, что указывает на ограниченный поглощение. С другой стороны, А549 и OVCAR3 линии раковых клеток демонстрируют значительное взаимодействие наночастиц. Внутренняя цитотоксичность (темно-токсичность) оценивали по инкубации 50 мас% смешанных наночастиц MEH-PPV / PCBM с ТЕ 71, MDA-MB-231, 549 и клеточные линии OVCAR3 и количественной оценки жизнеспособности клеток по МТТ. Данные МТТ на рисунке 1c показывают нормальную пролиферацию клеточных линий.

Наночастицы в качестве источника АФК

Чтобы убедиться, что наночастицы являются источником АФК, и только после воздействия света, формирование АФК оценивали с обнаружения набора реагентов ROS. Данные для OVCAR3 показаны на рис 2 Отсутствие зеленой эмиссии на рисунке - С. Указывает ROS не образуются для контрольных образцов. Ярко-зеленый излучение от обнаружения реагента АФК наблюдается для образцов, обработанных наночастиц и подвергаютсяк свету, как показано на рисунках 2D и E (сразу после PDT и 2 ч после ФДТ), подтверждающее, что ROS генерируются при ФДТ.

Тихоокеанское летнее время

Производительность MEH-PPV / PCBM наночастицы в ФДТ количественно МТТ сразу после PDT, и после периодов после инкубации 4 и 12 ч. Данные показаны на рисунке 3 для 4 ч периода после инкубации. В А549 и OVCAR3 линии раковых клеток проявляют значительную гибель клеток после лечения PDT: до 60% для А549 и 100% для OVCAR-3. Контроль ТЕ 71 и MDA-MB-231 раковых клеток линии показывают ограниченный эффект. TE71 является нормальным линии контрольных клеток, и не ожидается усвоить наночастиц. Только легкий неспецифического поглощения наночастиц TE-71 наблюдается экспериментально. Низкий взаимодействие наночастиц наблюдается для MDA-MB-231, который в этом случае из-за низкой скорости обмена веществ по сравнению с другими клеточных линий рака. Устройство PDT данные показываютчто наночастицы MEH-PPV / PCBM высокоэффективны PDT сенсибилизаторы, и, что эффективность ФДТ весы с взаимодействие наночастиц. Различия в результатах ФДТ между линий раковых клеток, рассматриваемых здесь из-за разницы в агрессивности (метаболизм и скорость эндоцитоза) между этими клеточными линиями.

Прогрессирование PDT гибели клеток

Live / мертвых двойного окрашивания с PI и Аннексином V FITC предоставляет информацию о некротических и апоптотических механизмов клеточной смерти. Эта схема окрашивания наносили на клетки линии учился здесь после ФДТ, чтобы узнать больше о PDT-индуцированных путей клеточной гибели. Рисунок 4 показывает epiluminescence изображения ТЕ 71and OVCAR3 клеточных линий, окрашенных Аннексином V FITC, PI и DAPI. Данные показывают, что нет эффект ФДТ на ТЕ 71 линии управления клеток, в соответствии с незначительным поглощением наночастиц. То же наблюдение было сделано для MDA-MB-231 (данные не показаны). Когда О.В.CAR3 прошли PDT на 60 и наблюдался 120 Дж / ​​см 2 двойного окрашивания PI (фиолетовый) и Аннексин V FITC (зеленый). В 180 Дж / ​​см 2 только ПИ пятно наблюдается, предполагая, острый некротический смерть клеток в рамках этого состояния.

фигура 1
Рисунок 1. (А) Изготовление наночастиц методом переосаждение, (В) Т. 71, MDA-MB-231, А549 и OVCAR3 клеточные линии инкубируют с наночастицами. Наночастицы показаны зеленым цветом, ядро ​​показан синим цветом. Флуоресцентные изображения накладываются с контрастных изображений фазовых, масштабную линейку = 20 мкм, (C) Внутренняя цитотоксичность наночастиц оценивали путем измерения жизнеспособности клеток для каждой клеточной линии вплоть до 96 часов. Клеточные viabilities сравнивают с контрольной дозы наночастиц (0 мг / мл), установив жизнеспособность ContrОбразцы ол при 100% (не показано). Усы являются стандартные отклонения для результатов от 3 ​​отдельных экспериментов (п = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. Обнаружение АФК в OVCAR3 клеточной линии с АФК обнаружения реагента. (А) не наночастицы, нет освещенность, (B) не наночастицы, открытые до 180 Дж / ​​см 2 света (С) 2 х 10 -4 мг / мл наночастиц, нет освещенность (D) с наночастицами и воздействия 180 Дж / ​​см 2 света, принято сразу же после лечения (E) 2 ч после ФДТ, (F) с 100 мкл H 2 O 2 в качестве положительного контроля. Яркий зеленый выбросов в DF I с от ROS обнаружения реагента, подтверждающего образование АФК. Масштаб бар = 30 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Сотовые viabilities ТЕ 71, MDA-MB-231, А549, и OVCAR3 клеточные линии, вводимые с увеличением дозы наночастиц и облученных 120 Дж / ​​см 2 света дозы. Инкубационный период после ФДТ 4 ч. Дозы наночастиц в легенде в 10 -4 мг / мл. Усы являются стандартные отклонения для результатов от 3 ​​отдельных экспериментов (п = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

igure 4 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 53038 / 53038fig4.jpg "/>
Рисунок 4. Live / мертвых окрашивания TE 71 и OVCAR3 клеточные линии с аннексин V FITC и PI. Зеленый выбросов соответствует аннексином V FITC, фиолетовый выбросов соответствует PI (красный, смешанный с синим излучением DAPI), а синее излучение соответствует DAPI ядерная пятно. Изображения наложение фазового контраста и epiluminescence изображений. Масштаб бар = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5
5. Солнечная установка тренажер для воздействия на клетки с калиброванного рис. Был использован ссылка солнечных батарей для калибровки, как показано на вставке регистрирующего 0,5 солнце интенсивность света (50 мВт / см 2)./53038/53038fig5large.jpg "Целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Отрицательные контроли Нет НЧ, без света Нет НЧ, с учетом Нет света, с НП
Положительный контроль 100 мкл Н 2 О 2 (не НЧ, ни света) --- ---
Экспериментальный 0 ч после ФДТ (ИГ и свет) 2 ч после ФДТ (ИГ и свет) ---

Таблица 1: Экспериментальный дизайн для обнаружения ROS.

0 ч пластины СМИ TE 71 549 СМИ
Нет лечения
0 мг / мл
0,4 х 10 -4 мг / мл
2,0 х 10 -4 мг / мл
3,6 х 10 -4 мг / мл

Таблица 2: Схема 96-луночный планшет для инкубации наночастиц оценить внутреннюю цитотоксичность наночастиц / Эффект ФДТ

Пластина нет. Свет доза (Дж / см 2) Сообщение PDT время (час)
1 60 0
2 60 4
3 60 12
4 120 0
5 120 4
6 120 12
7 180 0
8 180 4
9 180 12

Таблица 3: Маркировка 96-луночных планшетах в течение PDT оценки.

Флуорофорные Возбуждение фильтр Зеркальные Фильтр выбросов Микроскопия Источник возбуждения
Наночастиц 488/10 500 LP 510 LP Конфокальный Ионный лазер Ар-Кр
Д.ПИ 350/52 405 LP 450/20 Epiluminescence Ртутной лампы
ПИ 543/22 562 592/40 Epiluminescence Ртутной лампы
Аннексин V FITC 483/30 505 LP 535/40 Epiluminescence Ртутной лампы
АФК обнаружения реагента 491/10 510 DCLP 525/50 Epiluminescence Ртутной лампы

Таблица 4. микроскопия конфигурации для экспериментов изображений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Для достижения поглощение наночастиц было необходимо для поддержания некоторые критические меры, а изготовления наночастиц. 10 -6 М MEH-PPV раствор (смешивается с 50% мас PCBM) в ТГФ был готов впрыснуть в деионизированной воде, как это было отмечено, что концентрация этого раствора играет важную роль в определении размера наночастиц формируется. Концентрация была проверена UV-VIS-спектроскопии. Обратите внимание, что в шаге протокола 2.1.3 нужно было разбавлять первоначально приготовленный раствор MEH-PPV (в неразбавленном виде MEH-PPV маточного раствора) прежде чем принимать UV-VIS спектры с этого решения имеет намного большую оптическую плотность, чем 1. Скорость впрыска также играет важную роль в решении вопроса о размерах наночастиц, и должен быть как можно быстрее при интенсивном перемешивании ди воды. Медленное введение приведет к более крупных наночастиц. Кроме того, перемешивание должно быть прекращено сразу после инъекции, чтобы избежать дальнейшего агрегирования. При введенииВодный раствор, необходимо, чтобы иглы вблизи внутренней поверхности флакона при вставке иглы полностью в раствор, чтобы избежать образования пузырьков, которые будут влиять на размер наночастиц. В наших экспериментах размеров наночастиц, полученных были 61,5 ± 23,3 нм, как измерено DLS. DLS был выбран вместо ПЭМ, как это быстрый, недорогой, надежный для такого размера и легко доступны. Был найден дзета-потенциал на этих наночастиц быть -9,66 ± 8,12 мВ, т.е., слегка отрицательной на нейтральную поверхностного заряда.

Важно, чтобы подсчитать клетки, оценивая внутреннюю цитотоксичность наночастиц и количественно результаты PDT, так как эти методы основаны на МТТ, который обеспечивает количественное измерение жизнеспособности клеток. Важно, чтобы начать эксперимент с тем же числом элементов в каждую лунку 96-луночного планшета, что позволяет для сравнения жизнеспособности клеток по отношению к дозе нанoparticles и свет, а также контрольные эксперименты.

Солнечная тренажер используется для облучения образцов. Установка показана на рисунке 5, и состоит из источника света, УФ-фильтра, и опорной солнечного элемента. С этой схемой освещения высокая степень контроля спектральных свойств и интенсивности источника света может быть достигнуто, в результате чего с высокой воспроизводимостью результатов. Это очень важно понимать, что большинство источников света не обеспечивают равномерный профиль интенсивности. Солнечная тренажера, однако, могут быть выровнены для достижения равномерного около интенсивности в области освещения. Это было проверено с помощью эталонного солнечного элемента в различных регионах освещенной области. Мы также позаботились, чтобы всегда поместить пластины в той же области светового пятна и в той же ориентации для дальнейшей минимизации последствий изменения в интенсивности. В качестве источника света в образец расстояние, указанное на рисунке 5, при условии нас с 50мВт / см 2 (0,5 солнце) интенсивности при электрической мощности лампы 218 Вт в этих экспериментов ССРХ краситель свободные средства массовой информации был использован, чтобы избежать поглощения света индикаторов красителей. После ФДТ, клетки снова инкубируют в течение определенных периодов времени при 37 ° С (после ФДТ инкубации), чтобы наблюдать за ходом PDT.

Окрашивание клеток требуется некоторое проб и ошибок, чтобы найти правильный концентрации соответствующего красителя. Это достигается путем повторения эксперимента при увеличении концентрации красителя постепенно до тех пор, пока соответствующие результаты были достигнуты.

Способ также имеет несколько ограничений, особенно в отношении системы наночастиц и ФДТ. Так наночастицы получают по методу переосаждение есть некоторые изменения в полученном размера наночастиц от партии к партии, а некоторые полидисперсности размера наночастиц существует, что не может контролироваться. Он также не было возможности сделать nanoparticles менее 20 нм по размеру. Эти ограничения могут быть проблемы в развитии малого размера монодисперсных наночастиц, которые могут быть применены в естественных условиях. Кроме того, PDT эксперимент в пробирке требует клеток, чтобы быть вне инкубатора в течение длительного периода времени, который может ввести некоторое напряжение на клетки.

Метод обсуждается здесь для ФДТ является существенным по отношению к текущим подходами. PDT с использованием малых сенсибилизаторов молекулы и сенсибилизирующим легированных наночастицы видел ограниченное клиническое применение из-за значительных проблем с темной токсичности сенсибилизаторов, чувствительность пациента к свету (в связи с неизбирательным распределением сенсибилизатора), и гидрофобность сенсибилизаторов (что приводит к снижается биодоступность и потенциал острая токсичность). В операции, даже если опухоль удаляется из организма, несколько раковых клеток остаются и могут привести к ремиссии. В лучевой терапии и химиотерапии нормальной ткани влияет также.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly[2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)-1,4-phenylenevinylene] (MEH-PPV) Sigma Aidrich 536512-1G average Mn 150,000-250,000
[6,6]-Phenyl C61 butyric acid methyl ester (PCBM) Sigma Aidrich 684449-500MG >99.5%
Tetrahydrofuran (THF) EMD TX0284-6 Drisolv
1 ml syringe National Scientific Company 37510-1 For filtration of MEH-PPV solution
Syringe filter VWR 28145-495 25 mm, 0.2 µm, PTFE
1 ml syringe Hamilton Company 81320 For injection of MEH-PPV solution into water to make nanoparticles
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium/Ham's F-12 50/50 Mix (DMEM) Corning (VWR) 45000-350
Hank's Balanced Salt Solution without phenol red (HBSS) Quality Biological (VWR) 10128-740
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x without calcium and magnesium (DPBS) Corning (VWR) 45000-436
Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated) (FBS) Corning (VWR) 45000-736
Trypsin EDTA 1x 0.25% Corning (VWR) 45000-664 Trypsin/2.21 mM EDTA in HBSS without sodium bicarbonate, calcium and magnesium Porcine Parvovirus Tested
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences  15710 16% paraformaldehyde is diluted to 4% by adding PBS
DAPI  Biotium VWR 89139-054 Nuclear stain
5 ml pipettes VWR 82050-478
75 cm2 culture flask VWR 82050-856 for culturing cells
96-well plates VWR 82050-771 for MTT assays
Tissue Culture Dishes with Vents Greiner Bio-One (VWR) 82050-538
Propidium iodide Molecular probes P3566
Annexin V FITC Invitrogen A13199 dye for apoptosis
Celltiter 96 non-R 1000 assays Promega (VWR) PAG4000 MTT
CellROX Green Reagent, for oxidative stress detection Invitrogen C10444 For ROS detection
UV-vis spectrometer Agilent 8453
Fluorescence spectrometer NanoLog HoribaJobin Yvon
Dynamic light scattering PD2000DLS, Precision detector
Incubator NuAir DH Autoflow
Confocal microscope Zeiss Axioskop2 63X oil immersion objective lens
Epiluminescence microscope Olympus IX71 60X water immersion objective lens, Andor Zyla sCMOS camera
Solar Simulator Newport 67005 Oriel Instruments
Reference solar cell Oriel  VLSI Standards Incorporated
Microplate reader BioTek Ex808
Hemocytometer Hausser Scientific Partnership 3200 For counting cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dolmans, D., Fukumura, D., Jain, R. K. Photodynamic therapy for cancer. Nat Rev Cancer. 3, (5), 380-387 (2003).
  2. Dougherty, T. J., et al. Photodynamic therapy. J Natl Cancer Inst. 90, (12), 889-905 (1998).
  3. Ferrari, M. Cancer nanotechnology: Opportunities and challenges. Nat Rev Cancer. 5, (3), 161-171 (2005).
  4. Oleinick, N. L., Morris, R. L., Belichenko, T. The role of apoptosis in response to photodynamic therapy: what, where, why, and how. Photochem Photobiol Sci. 1, (1), 1-21 (2002).
  5. Ormond, A., Freeman, H. Dye Sensitizers for Photodynamic Therapy. Materials. 6, (3), 817-840 (2013).
  6. Pass, H. I. Photodynamic Therapy in Oncology - Mechanisms and Clinical Use. J Natl Cancer Inst. 85, (6), 443-456 (1993).
  7. Sariciftci, N. S., Smilowitz, L., Heeger, A. J., Wudl, F. Photoinduced electron transfer from a conducting polymer to buckminsterfullerene. Science. 258, (5087), 1474-1476 (1992).
  8. Sperandio, F. F., et al. Photoinduced electron-transfer mechanisms for radical-enhanced photodynamic therapy mediated by water-soluble decacationic C-70 and C84O2 Fullerene Derivatives. Nanomed-Nanotechnol. 9, (4), 570-579 (2013).
  9. Fan, J. Q., Fang, G., Zeng, F., Wang, X. D., Wu, S. Z. Water-Dispersible Fullerene Aggregates as a Targeted Anticancer Prodrug with both Chemo- and Photodynamic Therapeutic Actions. Small. 9, (4), 613-621 (2013).
  10. Grynyuk, I., et al. Photoexcited fullerene C-60 disturbs prooxidant-antioxidant balance in leukemic L1210 cells. Materialwiss Werkstofftech. 44, (2-3), 139-143 (2013).
  11. Liu, X. M., et al. Separately doped upconversion-C-60 nanoplatform for NIR imaging-guided photodynamic therapy of cancer cells. Chem Commun. 49, (31), 3224-3226 (2013).
  12. Trpkovic, A., Todorovic-Markovic, B., Trajkovic, V. Toxicity of pristine versus functionalized fullerenes: mechanisms of cell damage and the role of oxidative stress. Arch Toxicol. 86, (12), 1809-1827 (2012).
  13. Chen, Z. Y., MA, L. J., Liu, Y., Chen, C. Y. Applications of Functionalized Fullerenes in Tumor Theranostics. Theranostics. 2, (3), 238-250 (2012).
  14. Park, S. H., et al. Bulk heterojunction solar cells with internal quantum efficiency approaching 100%. Nat Photonics. 3, (5), 297-302 (2009).
Фотодинамическая терапия с Смешанное проводящий полимер / фуллерен наночастиц фотосенсибилизаторов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Doshi, M., Gesquiere, A. J. Photodynamic Therapy with Blended Conducting Polymer/Fullerene Nanoparticle Photosensitizers. J. Vis. Exp. (104), e53038, doi:10.3791/53038 (2015).More

Doshi, M., Gesquiere, A. J. Photodynamic Therapy with Blended Conducting Polymer/Fullerene Nanoparticle Photosensitizers. J. Vis. Exp. (104), e53038, doi:10.3791/53038 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter