Abstract
Copolimeri a blocchi anfifilici come blocco polyethyleneglycol- acido -polylactic (PEG-b- PLA) possono auto-assemblarsi in micelle di sopra del loro concentrazione micellare critica che formano nuclei idrofobici circondati da gusci idrofili in ambienti acquosi. Il nucleo di queste micelle può essere utilizzato per caricare farmaci idrofobici, scarsamente idrosolubili come docetaxel (DTX) e everolimus (EVR). Caratterizzazione sistematica delle capacità della struttura micelle e droga di carico sono importanti prima in vitro e in vivo può essere effettuata. L'obiettivo del protocollo qui descritto è quello di fornire le misure di caratterizzazione necessari per realizzare prodotti micellari standardizzati. DTX e EVR hanno solubilità intrinseca di 1,9 e 9,6 mg / ml Preparazione di queste micelle può essere realizzato per fusione solvente che aumenta la solubilità in acqua di DTX e EVR a 1,86 e 1,85 mg / ml, rispettivamente. Stabilità droga in micelle evalranea a temperatura ambiente per 48 ore indica che il 97% o più dei farmaci sono mantenuti in soluzione. Dimensioni micella è stata valutata utilizzando light scattering dinamico e indicato che la dimensione di queste micelle era inferiore a 50 nm e dipendeva dal peso molecolare del polimero. Rilascio del farmaco da parte delle micelle è stata valutata utilizzando la dialisi, in condizioni sink a pH 7,4 a 37 ° C oltre 48 ore. Curve risultati adatti indicano che il rilascio del farmaco è guidato da un processo di primo ordine che indica che è guidato diffusione.
Introduction
Copolimeri a blocchi anfifilici con struttura ripetendo composta da domini idrofili e idrofobi possono spontaneamente auto-assemblano a formare tre assemblee macromolecolari tridimensionali conosciuti come micelle polimeriche. Queste strutture hanno un core idrofobico interno circondato da un guscio idrofilo. Il core idrofobico ha la capacità di incorporare farmaci idrofobici mediante intrappolamento fisico attraverso interazioni idrofobiche o mediante coniugazione chimica a catena polimerica. 1 Molti vantaggi esistono per utilizzare questi copolimeri a blocchi per formare micelle per il drug delivery. Questi includono l'incorporazione di farmaci scarsamente solubili, migliorando farmacocinetica dei farmaci incorporati, e la biocompatibilità e / o biodegradabilità dei polimeri li rende un sostituto sicuro per solubilizzanti convenzionali. 2 Un altro vantaggio dell'utilizzo di micelle polimeriche è la loro granulometria colloidale, tra 15- 150 nm 3, che li rende attraenti per paconsegna renteral. Pertanto, nel corso degli ultimi 20 anni micelle polimeriche sono emersi come sistemi di drug delivery vitali per farmaci scarsamente solubili in acqua soprattutto per la terapia del cancro. 3,4
Attualmente ci sono cinque formulazioni micellari polimerici per la terapia del cancro in fase di sperimentazione clinica. 4 Quattro delle micelle negli studi clinici sono copolimeri a base di PEG diblock mentre l'ultimo è un copolimero a tre blocchi contenente polietilenossido. La dimensione di queste micelle variava da 20 nm a 85 nm. Il vantaggio di usare polimeri a base di PEG è la loro biocompatibilità e in funzione del secondo blocco può anche essere biodegradabili. Recentemente nuovi sistemi di somministrazione dei farmaci a base di acido -polylactic blocco polyethyleneglycol- (PEG-b -PLA) micelle polimeriche sono stati sviluppati per la consegna contemporanea di più farmaci antitumorali. Le micelle PEG-b- PLA sono sia biocompatibile e biodegradabile. Questi multi-farmaco micelle caricati hanno dimostrato comeinibizione ynergistic di diversi modelli di tumori in vitro e in vivo e in forma 2,5,6 nella corrente paradigma di utilizzare più farmaci in chemioterapia per prevenire la resistenza e ridurre la tossicità. Pertanto, non vi è un grande interesse per la preparazione e la caratterizzazione di questi sistemi di drug delivery micellari per l'uso nel cancro e altre malattie.
Nel lavoro di seguito abbiamo delineato un processo step-by-step per cui tali micelle possono essere preparati e caratterizzati prima di valutare negli stati di malattia d'interesse. Ai fini di questo lavoro, docetaxel (DTX) e everolimus (EVR) sono stati scelti due agenti anti-tumorali scarsamente solubili. Sia DTX e EVR sono composti scarsamente solubili in acqua con solubilità in acqua intrinseche a 1,9 e 9,6 mg / ml. 7,8 Due PEG-polimeri b -PLA con diversi pesi molecolari sono stati utilizzati in questo protocollo, come i mattoni per la polimerico formulato micelle,questi polimeri sono PEG 2000 - b -PLA 1800 (3.800 Da) e PEG 4000 - b -PLA 2200 (6.200 Da). PEG micelle b -PLA possono quindi fornire una piattaforma unica come nanocarrier per DTX e EVR individualmente e in combinazione. Le richieste Reagenti / Materiali e attrezzature necessarie per preparare e caratterizzare queste micelle sono elencati nella tabella 1.
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Protocol
1. Preparazione di singoli e multi-droga Micelle caricate da solvente Metodo Casting
- Pesare DTX 1 mg o EVR 1 mg o di entrambi i farmaci a 1 mg ciascuna per le micelle doppio farmaco (DDM).
- Pesare 15 mg di PEG 2000 - b -PLA 1800 e PEG 4000 - b -PLA 2200 sia per individuali o DDM.
- Sciogliere le droghe / farmaci e il polimero in 0,5 ml di acetonitrile e posto in un pallone a fondo tondo da 5 ml.
- Forma un film polimerico farmaco distribuito sottile facendo evaporare il farmaco (s) soluzione acetonitrile -polymer sotto pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante. Impostare l'evaporatore rotante a 100 rpm, la temperatura dell'acqua di 40 vasca o C e una pressione di 260 mbar di vuoto per 5 minuti, seguito da una riduzione a 100 mbar per ulteriori 3 min.
- Reidratare il film di droga-polimero con 0,5 ml di acqua deionizzata a 50 ° C e scuotere delicatamente il pallone per formare le micelle.
- Filtrare il risultatoing soluzione micellare attraverso un filtro di nylon 0,2 micron per rimuovere qualsiasi farmaco o contaminanti un-dissolto in una provetta da centrifuga da 1,5 ml.
2. Valutazione di droga Caricamento e alla stabilità nel Micelle Utilizzando Reverse-fase ad alte prestazioni cromatografia liquida (RP-HPLC)
- Effettuare analisi RP-HPLC con una colonna C8 equilibriated a 40 ° C in una modalità isocratica con una fase mobile di acetonitrile / acqua (62/38) contenente 0,1% di acido fosforico e 1% di metanolo ad una portata di 1 ml / min e un volume di iniezione di 10 ml.
- Diluire micelle preparati al momento (sezione 1) 1: 100 in fase mobile prima di analizzare da RP-HPLC per determinare caricamento iniziale della droga. Conservare diluiti individuali micelle e DDM a temperatura ambiente (25 ° C) per 48 ore e si preparano freschi 1: 100 campioni diluiti in fase mobile di rivalutare da RP-HPLC e determinare droga (s) stabilità in micelle oltre 24 ore.
- Monitorare DTX e EVR picchi a 227 e 279 nm, rispettivamentecon tempi di ritenzione di 1,7 e 5,7 minuti rispettivamente. Eseguire tutte le misurazioni in triplice copia. Presentare i dati come media ± SD droga carico.
3. valutazione delle dimensioni delle particelle micelle da Dynamic Light Scattering (DLS)
- Diluire micelle preparate (come descritto nella sezione 1) in acqua deionizzata a rapporto 1:20 per ottenere una concentrazione finale di 1,5 mg di polimero / ml.
- Misurare l'intensità del laser He-Ne (633 nm) a 173 ° per determinare dispersione. Eseguire tutte le misurazioni a 25 ° C dopo un pre-equilibrazione per 2 minuti.
- Eseguire tutte le misurazioni in triplice copia. Dati presente come dimensione media Z-media ± SD insieme con l'indice di polidispersità (PDI) della distribuzione.
4. Valutazione in vitro Drug uscita da Micelle individuali e DDM
- Preparare i singoli micelle e DDM come descritto nella sezione 1. Caricare 2,5 ml di micelle in una cassetta da 3 ml con dialisiun peso molecolare di cut-off (MWCO) di 7000 g / mol.
NOTA: Questo MWCO stato scelto per consentire al farmaco libero (s) insieme con le molecole di polimero non associate a diffondere liberamente dalla cassetta e quindi garantire condizioni sink. - Posizionare le cassette in 2,5 L di 10 mM pH 7,4 tampone fosfato (diluire soluzione madre 200 mm) e modificare il buffer ogni 3 ore per garantire condizioni di sink. Mantenere la temperatura del tampone a 37 ° C per tutta la durata dell'esperimento.
- A 0, 0,5, 1, 2, 3, 6, 9, 12, 24, e 48 ore, prelevare 150 microlitri della soluzione in cassette e sostituire con 150 ml di tampone fresco.
- Analizzare i campioni utilizzando RP-HPLC previste nella sezione 2 per determinare la concentrazione del farmaco. Curve-fit dei dati di rilascio del farmaco (s) sulla base di un modello di diffusione semplice con un'associazione esponenziale una fase utilizzando il software stastitical.
- Calcolare il tempo necessario per raggiungere il 50% di rilascio di farmaci (t 1/2) edroga ach in singoli micelle o DDM in base alla curva raccordo. Eseguire tutte le misure in quaterna.
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Representative Results
DTX individuali o micelle EVR e DTX e EVR DDM in PEG b -PLA micelle sono formulati con successo in entrambi i PEG 4000 - b -PLA 2200 o PEG 2000 - b -PLA 1800 (Figura 1).
DTX, EVR, e il DDM ha mostrato stabilità simile a PEG 4000 - b -PLA 2200 o PEG 2000 - b -PLA 1800 più di 48 ore (Figura 2). Caricamento farmacologica iniziale di EVR in PEG 4000 - b -PLA 2200 e PEG 2000 - b -PLA 1800 è 1.86 e 1.87 mg / ml. Mentre iniziale DTX carico nel PEG 4000 - b -PLA 2200 e nel PEG 2000 - b -PLA 1800 è 1,85 e 1,78 mg / ml. Il caricamento iniziale sia DTX e EVR in micelle DDM utilizzando ciascuno dei polimeri è simile a singoli micelle. Tutte le micelle mantenuti 97% o più del caricamento inizialea 48 ore a temperatura ambiente.
Dimensioni micella è valutata DLS e basa sui risultati tutti micelle hanno mostrato una distribuzione unimodale con valori di PDI inferiori a 0,2. Le dimensioni medie z-media per DTX, EVR e DDM in PEG 2000 - b -PLA 1800 è di circa 18,05 ± 0,06 nm (PDI = 0,079 ± 0.013), mentre nel PEG 4000 - b -PLA 2200 la dimensione è di circa 34.09 ± 0.24 nm (PDI = 0,137 ± 0,004) (Figura 3).
Per rappresentare l'utilità di usare sia polimeri gli esperimenti di rilascio vengono eseguite con PEG 4000 - b -PLA 2200 per micelle EVR o DDM e PEG 2000 - b -PLA 1800 micelle DTX. Il farmaco in vitro (s) liberazione da micelle è valutata in pH 7,4 tampone a 37 ° C mediante dialisi in condizioni sink per 48 ore. Sulla base dei dati, il rilascio DTX dai singoli micelle e DDM è approximately 60% in 48 ore (Figura 4). EVR rilascio da singoli micelle e DDM era del 60% e del 50% rispettivamente (Figura 4). Il t 1/2 per ogni farmaco da singoli micelle e DDM e la bontà di adattamento dati è presentata nella Tabella 2. La bontà di curva-montaggio (r 2) per tutte le micelle tranne EVR singoli micelle è sopra 0.950 che significa che l'assunzione del rilascio del primo ordine è una buona approssimazione di spiegare rilascio del farmaco da singoli micelle e DDM.
Figura 1: Rappresentazione schematica di DTX individuo o EVR PEG-b- PLA micelle e DDM caricato con DTX e EVR.
Figura 2:Droga (s) carico e stabilità di DTX e EVR individuali micelle e DDM in PEG 2000 - b -PLA 1800 (A) o PEG 4000 - b -PLA 2200 (B). La concentrazione del farmaco in micelle viene quantificato RP-HPLC a 0, 24, e 48 ore. I dati rappresentati come media ± DS di piste triplicato. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: micelle individuale e DDM determinazione dimensioni di DLS in PEG 2000 - b -PLA 1800 (A) o PEG 4000 - b -PLA 2200 (B). La dimensione delle micelle è valutata con Dynamic Light Scattering. Dati viene presentato è un rappresentante della distribuzione per tegli micelle individuali e DDM nei due polimeri. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Drug (s) rilascio di DTX (A) ed EVR (B) da singoli micelle e DDM (C). Studi rilascio del farmaco vengono eseguite da dialisi ed in condizioni sink mantenendo la temperatura se il sistema a 37 ° C. I dati presentati sono Media Drug uscita ± DS di 4 repliche. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Micelle | t 1/2 (hr) | r 2 |
| DTX | 10 | 0,986 |
| EVR | 35 | 0.82 |
| DDM | DTX - 8.86 | DTX - 0.987 |
| EVR - 48 | EVR - 0,955 |
Tabella 2: Il tempo necessario per il rilascio il 50% della droga (t 1/2) e la bontà della curva di raccordo (r 2) da studio in vitro rilascio in.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PEG2000-b-PLA1800 | Advanced Polymer Materials, Inc | 6-01- PLA/2000 | PLA MW can be specified on ordering |
| PEG4000-b-PLA2200 | Advanced Polymer Materials, Inc | 6-01- PLA/4000 | PLA MW can be specified on ordering |
| Docetaxel | LC Laboratories | D-1000 | 100 mg |
| Everolimus | LC Laboratories | E-4040 | 100 mg |
| Acetonitrile | EMD/VWR | EM-AX0145-1 | HPLC grade; 4 L |
| Round bottom flask | Glassco/VWR | 89426-496 | 5 ml |
| RV 10 Control Rotary Evaporators | IKA Works | 8025001 | Rotoevaporator |
| Shimadzhu HPLC with DAD detector | Shimadzhu | RP-HPLC | |
| Slide-a-lyzer dialysis casette MWCO 7000 | Thermo Scientific, Inc | 66370 | 3 ml |
| Phosphate buffer pH 7.4, 200 mM | VWR | 100190-870 | 500 ml |
| Malvern NanoZS | Malvern Instruments, UK | DLS | |
| Nylon filter | Acrodisc/VWR | 28143-242 | 13 mm; 0.2µM |
| Phosphoric acid, NF | Spectrum Chemical/VWR | 700000-626 | 100 ml |
| GraphPad Prism | www.graphpad.com | Analysis software | |
| Zorbax SB-C8 Rapid Resolution cartridge | Agilent Technologies | 866953-906 | 4.6 ×75 mm, 3.5 μm |
References
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