Abstract
Амфифильные блок-сополимеры, такие как блок-polyethyleneglycol- -polylactic кислоты (ПЭГ B- PLA) может самосборке в мицеллах выше их критической концентрации мицеллярной образующих гидрофобные ядра, окруженные гидрофильными оболочек в водных средах. Ядро этих мицелл может быть использован для загрузки гидрофобными, плохо растворимых в воде лекарственных средств, как доцетаксел (DTX) и эверолимусом (EVR). Систематическое характеристика структуры мицелл и погрузки препарат возможностей важны прежде, в пробирке и в естественных условиях исследования могут быть проведены. Цель протокола, описанного в настоящем документе, чтобы обеспечить необходимые меры по обеспечению характеризации стандартизированных продуктов мицеллярные. DTX и РВО имеют собственные растворимости 1,9 и 9,6 мкг / мл, соответственно Приготовление этих мицелл может быть достигнуто путем литья растворителя, который увеличивает растворимость в воде и DTX РВО 1,86 и 1,85 мг / мл, соответственно. Стабильность лекарственного в мицеллы Evalкой из при комнатной температуре в течение 48 ч, что свидетельствует о 97% или более лекарственных средств, сохраняются в растворе. Размера мицелл оценивали с помощью динамического светорассеяния и указал, что размер этих мицелл была ниже 50 нм и зависит от молекулярной массы полимера. Высвобождение лекарственного средства из мицелл оценивали с помощью диализа в условиях погружения при рН 7,4 при 37 ° С в течение 48 ч. Аппроксимации кривой результаты показывают, что высвобождение лекарственного препарата приводится в действие первого процесса порядка, указывающую, что им движет диффузии.
Introduction
Амфифильные блок-сополимеры с повторяющимися структура, состоящая из гидрофильных и гидрофобных доменов может самопроизвольно самосборке с образованием трехмерных макромолекулярных ансамблей, известные как полимерные мицеллы. Эти структуры имеют внутреннюю гидрофобную сердцевину, окруженную гидрофильной оболочки. Гидрофобный сердечник имеет возможность включить гидрофобные препараты либо через физический захват гидрофобных взаимодействий, или химической конъюгации по к основной цепи полимера. 1 Многие преимущества существуют, чтобы с помощью этих блок-сополимеров образовывать мицеллы для доставки лекарственных средств. Они включают введение плохо растворимых лекарственных препаратов, улучшение фармакокинетики объединенных препаратов, и биологическую совместимость и / или способность к биологическому разложению полимеров делает их безопасным чередуются с обычными солюбилизаторов. 2 Другим преимуществом использования полимерных мицелл их коллоидного размера частиц, между 15- 150 нм 3, что делает их привлекательными для годовыхrenteral доставки. Таким образом, за последние 20 лет полимерные мицеллы появились как жизнеспособных систем доставки лекарств для плохо растворимых в воде лекарственных средств, особенно для лечения рака. 3,4
В настоящее время существует пять полимерные мицеллярные составы для лечения рака проходит клинические испытания. 4 четвертой мицелл в клинических испытаниях диблок-сополимеры на основе ПЭГ а последний является триблок-сополимер, содержащий полиэтиленоксид. Размер этих мицелл варьировалась от 20 нм до 85 нм. Преимущество использования полимеров на основе ПЭГ их биосовместимость и в зависимости от второго блока также может быть биоразлагаемыми. Недавно новые системы доставки лекарств на основе polyethyleneglycol- блока -polylactic кислоты (ПЭГ б -PLA) полимерные мицеллы были разработаны для одновременной доставки нескольких противоопухолевых препаратов. В ПЭГ B- PLA мицеллы являются биологически совместимыми и биологически. Они множественной лекарственной загруженные мицеллы показали, какynergistic ингибирование различных раковых моделей в пробирке и в естественных условиях 2,5,6 и нужным в текущем парадигмы использования нескольких препаратов в химиотерапии для предотвращения сопротивления и снижения токсичности. Таким образом, существует большой интерес в подготовке и характеризующие эти мицеллярные системы доставки лекарств для использования в рак и других болезненных состояний.
В работе ниже мы наметили шаг за шагом процесс, с помощью которого такие мицеллы могут быть получены и охарактеризованы прежде чем давать оценку их болезненных состояний, представляющих интерес. Для этой работы два плохо растворимые противораковые агенты, доцетаксел (DTX) и эверолимус (EVR) были выбраны. Оба DTX и EVR плохо растворимые в воде соединения с внутренними растворимость в воде при 1,9 и 9,6 мкг / мл, соответственно. 7,8 Два ПЭГ б -PLA полимеры с различными молекулярными массами были использованы в этом протоколе как строительные блоки для сформулированной полимерных мицеллы,эти полимеры ПЭГ 2000 - Ь -PLA 1800 (3800 Да) и ПЭГ 4000 - Ь -PLA 2200 (6200) Да. Поэтому ПЭГ-б -PLA мицеллы могут обеспечить уникальную платформу как nanocarrier для DTX и EVR отдельности и в сочетании. Требуемые реагенты / Материалы и оборудование, необходимое для подготовки и характеризуют эти мицеллы, перечислены в таблице 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка индивидуальных и нескольких наркотиков загруженных мицелл растворителем методом литья
- Взвесить DTX 1 мг или 1 мг EVR или обоих препаратов на 1 мг каждый для двойной мицеллы наркотиков (DDM).
- Взвесить 15 мг ПЭГ 2000 - Ь -PLA 1800 или ПЭГ 4000 - Ь -PLA 2200 для индивидуального или DDM.
- Растворите наркотиков / лекарства и полимера в 0,5 мл ацетонитрила и место в 5 мл круглодонную колбу.
- Образуют тонкий наркотиков распределены полимерную пленку путем выпаривания препарата (ов) -полимер ацетонитрил раствора при пониженном давлении с использованием роторного испарителя. Установите роторном испарителе до 100 оборотов в минуту, температура воды ванны 40 о С и вакуумной давлением 260 мбар в течение 5 мин с последующим восстановлением до 100 мбар в течение еще 3 мин.
- Увлажняет наркотиков полимерную пленку с 0,5 мл деионизированной воды при 50 ° С и осторожно встряхнуть флакон для формирования мицелл.
- Фильтр результатIng мицеллярного раствора через нейлоновый фильтр 0,2 мкм для удаления нерастворенные лекарственное средство или загрязнений в 1,5 мл центрифужную пробирку.
2. Оценка загрузки лекарственного и стабильности в мицеллах, используя обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ)
- Выполнить анализ RP-HPLC на колонке С8 equilibriated при 40 ° С в режиме изократического с подвижной фазой ацетонитрил / вода (62/38), содержащей 0,1% фосфорной кислоты и 1% метанола при скорости потока 1 мл / мин и вводимый объем 10 мкл.
- Развести свежеприготовленные мицеллы (раздел 1) 1: 100 в подвижной фазе до анализа с помощью ОФ-ВЭЖХ для определения начальной загрузки наркотиков. Магазин неразбавленный отдельные мицеллы и DDM при комнатной температуре (25 ° С) в течение 48 ч и подготовить свежие 1: 100 разбавленных образцов в подвижной фазе, чтобы повторно оценивать с помощью ОФ-ВЭЖХ и определяют препарата (ов) в мицеллах стабильность в течение 24 часов.
- Монитор DTX и EVR пики при 227 нм и 279 соответственнос временами удерживания 1,7 и 5,7 мин соответственно. Выполните все измерения в трех экземплярах. Представление данных как загрузка Среднее ± SD наркотиков.
3. Оценка Размер мицеллы частиц методом динамического рассеяния света (DLS)
- Развести свежеприготовленные мицеллы (как описано в разделе 1) в деионизированной воде в соотношении 1:20 с получением конечной концентрации полимера от 1,5 мг / мл.
- Измерьте интенсивность He-Ne лазера (633 нм) на 173 °, чтобы определить рассеяние. Выполнение всех измерений при 25 ° C после предварительной уравновешивания в течение 2 мин.
- Выполните все измерения в трех экземплярах. Представление данных в виде среднего Z-среднего размера ± SD вместе с показателем полидисперсности (PDI) распределения.
4. Оценка In Vitro наркотиков релиз от индивидуальных мицелл и DDM
- Подготовка индивидуальных мицеллы и DDM, как описано в разделе 1. Загрузите 2,5 мл мицелл в 3 мл диализа кассеты смолекулярная масса отсечки (MWCO) из 7000 г / моль.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот MWCO был выбран для того, чтобы бесплатно препарат (ы) вместе с несвязанных молекул полимера свободно диффундировать из кассеты и тем самым обеспечить условия погружения. - Поместите кассеты в 2,5 л 10 мМ рН 7,4 фосфатного буфера (полученного путем разбавления акции 200 мМ раствора) и измените буфер каждый 3 ч, чтобы обеспечить условия погружения. Поддерживают температуру буфера при 37 о С в течение всего срока эксперимента.
- В 0, 0,5, 1, 2, 3, 6, 9, 12, 24, 48 и ч, вывести 150 мкл раствора в кассетах и заменить 150 мкл свежего буфера.
- Анализ образцов, используя RP-HPLC, как установлено в разделе 2 для определения концентрации наркотиков. Кривая-согласуется с данными о выпуске препарата (ов) основанные на простом диффузионной модели с однофазной экспоненциальным ассоциации с использованием stastitical программного обеспечения.
- Рассчитайте время, необходимое для достижения 50% высвобождения лекарственного (т 1/2) еACH препарат в отдельных мицелл или DDM на основе аппроксимации кривой. Выполните все измерения в четверке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Индивидуальный DTX или EVR мицеллы и DTX и EVR DDM в ПЭГ-б -PLA мицеллы успешно сформулированы в любом ПЭГ 4000 - B -PLA 2200 или ПЭГ 2000 - B -PLA 1800 (Рисунок 1).
DTX, EVR, и РГМ показали аналогичную стабильность в ПЭГ 4000 - Ь -PLA 2200 или ПЭГ 2000 - Ь -PLA 1800 по 48 часов (рис 2). Первоначальная загрузка препарат EVR в ПЭГ 4000 - B -PLA 2200 и ПЭГ 2000 - Ь -PLA 1800 1,86 1,87 мг / мл соответственно. В то время как начальная загрузка DTX в ПЭГ 4000 - B -PLA 2200 и в 2000 PEG - б -PLA 1800 составляет 1,85 и 1,78 мг / мл. Первоначальной загрузки как DTX и РВО в DDM мицелл с использованием каждого из полимеров аналогична отдельных мицелл. Все мицеллы сохранил 97% и более от первоначальной загрузкина 48 ч при комнатной температуре.
Размера мицелл оценивается DLS и по результатам всех мицеллы показали унимодальное распределение со значениями PDI менее 0,2. Z-средняя средние размеры для DTX, EVR и DDM в ПЭГ 2000 - Ь -PLA 1800 примерно 18.05 ± 0.06 нм (PDI = 0,079 ± 0,013), а в 4000 PEG - б -PLA 2200 размер примерно 34,09 ± 0,24 нм (PDI = 0,137 ± 0,004) (рисунок 3).
Представлять полезность использования как полимеры эксперименты релиз выполняются с помощью ПЭГ 4000 - B -PLA 2200 для EVR мицеллы или DDM и ПЭГ 2000 - Ь -PLA 1800 для DTX мицеллы. Препарат в пробирке (ы) освобождение от мицелл оценивается в 7,4 буфере рН при 37 ° С с помощью диализа в условиях погружения в течение 48 ч. На основании данных, DTX выхода из отдельных мицелл и DDM составляет примерноoximately 60% по сравнению с 48 ч (фиг.4). РВО освобождение от отдельных мицелл и DDM составила 60% и 50% соответственно (фиг.4). Трет 1/2 для каждого лекарства из отдельных мицелл и DDM и доброте подходят данные представлены в таблице 2. Благости построения кривой (R 2) для всех мицелл кроме EVR отдельных мицелл выше 0,950, что означает, что в предположении выпуска первого порядка является хорошим приближением объяснить релиз наркотиков из отдельных мицелл и DDM.
Рисунок 1: Схематическое представление индивидуального DTX или EVR ПЭГ B- мицеллы НОАК и DDM загруженной с DTX и EVR.
Рисунок 2:Наркотиков (ы) погрузки и стабильность DTX и EVR отдельных мицелл и DDM в ПЭГ 2000 - B -PLA 1800 (A) или ПЭГ 4000 - Ь -PLA 2200 (B). Концентрацию лекарственного средства в мицеллах можно измерить с помощью ОФ-ВЭЖХ при 0, 24, и 48 ч. Данные, представленные в виде средних ± SD для трех прогонов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Индивидуальный мицеллы и DDM определения размера по DLS в ПЭГ 2000 - Ь -PLA 1800 (A) или ПЭГ 4000 - Ь -PLA 2200 (B). Размер мицелл оценивается Dynamic рассеяния света. Данные представлены является представителем распределения для тон отдельные мицеллы и DDM в двух полимеров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: наркотиками (ы) выпуск DTX (A) и (B EVR) от отдельных мицелл и DDM (C). Исследования высвобождения лекарственного средства выполнены с помощью диализа и в условиях погружения при поддержании температуры Если система при 37 о С. Данные, представленные в Среднее выпуска наркотиками ± SD 4 повторов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Мицелла | T 1/2 (ч) | R 2 |
| DTX | 10 | 0.986 |
| EVR | 35 | 0.82 |
| DDM | DTX - 8,86 | DTX - 0,987 |
| EVR - 48 | EVR - 0,955 |
Таблица 2: Время, необходимое для 50% высвобождения лекарственного (T 1/2) и благости построения кривой (R 2) от в пробирке исследования релиза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PEG2000-b-PLA1800 | Advanced Polymer Materials, Inc | 6-01- PLA/2000 | PLA MW can be specified on ordering |
| PEG4000-b-PLA2200 | Advanced Polymer Materials, Inc | 6-01- PLA/4000 | PLA MW can be specified on ordering |
| Docetaxel | LC Laboratories | D-1000 | 100 mg |
| Everolimus | LC Laboratories | E-4040 | 100 mg |
| Acetonitrile | EMD/VWR | EM-AX0145-1 | HPLC grade; 4 L |
| Round bottom flask | Glassco/VWR | 89426-496 | 5 ml |
| RV 10 Control Rotary Evaporators | IKA Works | 8025001 | Rotoevaporator |
| Shimadzhu HPLC with DAD detector | Shimadzhu | RP-HPLC | |
| Slide-a-lyzer dialysis casette MWCO 7000 | Thermo Scientific, Inc | 66370 | 3 ml |
| Phosphate buffer pH 7.4, 200 mM | VWR | 100190-870 | 500 ml |
| Malvern NanoZS | Malvern Instruments, UK | DLS | |
| Nylon filter | Acrodisc/VWR | 28143-242 | 13 mm; 0.2µM |
| Phosphoric acid, NF | Spectrum Chemical/VWR | 700000-626 | 100 ml |
| GraphPad Prism | www.graphpad.com | Analysis software | |
| Zorbax SB-C8 Rapid Resolution cartridge | Agilent Technologies | 866953-906 | 4.6 ×75 mm, 3.5 μm |
References
- Yokoyama, M. Polymeric micelles as a new drug carrier system and their required considerations for clinical trials. Expert Opin Drug Deliv. 7, 145-158 (2010).
- Shin, H. C., Alani, A. W., Rao, D. A., Rockich, N. C., Kwon, G. S. Multi-drug loaded polymeric micelles for simultaneous delivery of poorly soluble anticancer drugs. J Control Release. 140, 294-300 (2009).
- Adams, M. L., Lavasanifar, A., Kwon, G. S. Amphiphilic block copolymers for drug delivery. J Pharm Sci. 92, 1343-1355 (2003).
- Oerlemans, C., et al. Polymeric micelles in anticancer therapy: targeting, imaging and triggered release. Pharm Res. 27, 2569-2589 (2010).
- Shin, H. C., et al. A 3-in-1 polymeric micelle nanocontainer for poorly water-soluble drugs. Mol Pharm. 8, 1257-1265 (2011).
- Hasenstein, J. R., et al. Antitumor activity of Triolimus: a novel multidrug-loaded micelle containing Paclitaxel Rapamycin, and 17-AAG. Mol Cancer Ther. 11, 2233-2242 (2012).
- Mazzaferro, S., et al. Bivalent sequential binding of docetaxel to methyl-beta-cyclodextrin. Int J Pharm. 416, 171-180 (2011).
- Iwase, Y., Maitani, Y. Preparation and in vivo evaluation of liposomal everolimus for lung carcinoma and thyroid carcinoma. Biol Pharm Bull. 35, 975-979 (2012).
- Mishra, G. P., Doddapaneni, B. S., Nguyen, D., Alani, A. W. Antiangiogenic effect of docetaxel and everolimus as individual and dual-drug-loaded micellar nanocarriers. Pharm Res. 31, 660-669 (2014).
- Xu, W., Ling, P., Zhang, T. Polymeric micelles, a promising drug delivery system to enhance bioavailability of poorly water-soluble drugs. J Drug Deliv. 2013, 340315 (2013).
- Lavasanifar, A., Samuel, J., Kwon, G. S. Poly(ethylene oxide)-block-poly(L-amino acid) micelles for drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 54, 169-190 (2002).
