Abstract
Amfifiliske blokkopolymerer som polyethyleneglycol- blokk -polylactic syre (PEG- b- PLA) kan selv montere inn miceller ovenfor deres kritiske micelle konsentrasjon danner hydrofobe kjerner omgitt av hydrofile skjell i vandige miljøer. Kjernen i disse miceller kan benyttes til å laste hydrofobe, dårlig vannløselige legemidler som docetaxel (DTX) og everolimus (EVR). Systematisk karakterisering av micelle struktur og narkotika lasting evner er viktig før in vitro og in vivo studier kan gjennomføres. Målet med protokollen beskrevet her er å gi de nødvendige karakterisering skritt for å oppnå standardiserte micellære produkter. DTX og EVR har iboende løselighet på 1,9 og 9,6 ug / ml henholdsvis Fremstilling av slike miceller kan oppnås ved løsningsmiddelstøping som øker den vandige løseligheten av DTX og EVR til 1,86 og 1,85 mg / ml, henholdsvis. Drug stabilitet i miceller evallene evalueres ved romtemperatur i løpet av 48 timer angir at 97% eller flere av de stoffer beholdes i oppløsning. Micelle størrelse ble vurdert ved hjelp av dynamisk lysspredning, og indikerte at størrelsen av disse miceller var under 50 nm og avhengig av molekylvekten av polymeren. Drug utgivelse fra miceller ble vurdert ved hjelp av dialyse under vasken forholdene på pH 7,4 ved 37 o C i løpet av 48 timer. Kurvetilpasning resultater indikerer at legemiddelfrigjørelse drives av en første ordens prosess som indikerer at den er diffusjon drevet.
Introduction
Amfifile blokk-kopolymerer med repeterende struktur bestående av hydrofile og hydrofobe domener kan spontant selv montere for å danne tredimensjonale makromolekylære sammenstillinger som er kjent som polymere miceller. Disse strukturene har en indre hydrofob kjerne omgitt av et hydrofilt skall. Den hydrofobe kjernen har evnen til å innarbeide hydrofobe medikamenter, enten ved fysisk innesperring ved hydrofobe interaksjoner eller ved kjemisk konjugering til polymerryggraden. 1 mange fordeler eksisterer for å bruke disse blokk-kopolymerer for å danne miceller for medikamentlevering. Disse omfatter inkorporering av dårlig oppløselige medikamenter, forbedre farmakokinetikken til de inkorporerte medikamenter, og det biologiske forenelighetsmiddel og / eller biologiske nedbrytbarhet for polymerene gjør dem til et sikkert alternativ til konvensjonelle oppløseliggjørende midler. 2. En annen fordel ved å anvende polymere micellene er deres kolloidal partikkelstørrelse, mellom 15- 150 nm 3, noe som gjør dem attraktive for parenteral levering. Derfor, i løpet av de siste 20 årene polymere micellene har dukket opp som levedyktige legemiddelleveringssystemer for dårlig vannoppløselige medikamenter, spesielt for behandling av kreft. 3,4
For tiden er det fem polymere micellære formuleringer for kreftbehandling omgår kliniske studier. 4 Fire av miceller i de kliniske studiene er PEG-baserte diblokk kopolymerer mens den siste er en triblokk copolymer inneholder polyetylenoksyd. Størrelsen på disse miceller varierte fra 20 nm til 85 nm. Fordelen med å bruke PEG baserte polymerer er deres biokompatibilitet og avhengig av den andre blokken kan også være biologisk nedbrytbart. Nylig nye stoffet leveringssystemer basert på polyethyleneglycol- blokk -polylactic syre (PEG- b -PLA) polymere miceller er utviklet for samtidig levering av flere kreft narkotika. De PEG- b- PLA miceller er både biokompatible og biologisk nedbrytbare. Disse multi-medikament lastede miceller har vistynergistic hemming av forskjellige kreftformer modeller in vitro og in vivo 2,5,6 og passer inn i det aktuelle paradigme av å utnytte flere legemidler i kjemoterapi for å unngå motstand og senking toksisitet. Derfor er det en stor interesse i å forberede og karakterisere disse micellære stoffet leveringssystemer for bruk i kreft og andre sykdomstilstander.
I arbeidet nedenfor har vi skissert en steg-for-steg prosess der slike miceller kan være forberedt og preget før evaluere dem i sykdomstilstander av interesse. For formålet med denne arbeids to dårlig oppløselige anticancermidler, docetaxel (DTX) og everolimus (EVR) har blitt valgt. Både DTX og EVR er dårlig vannløselige forbindelser med iboende vannoppløseligheter på 1,9 og 9,6 ug / ml. 7,8 To PEG- b -PLA polymerer med forskjellig molekylvekt ble anvendt i denne protokollen som byggesteiner for det formulerte polymere miceller,Disse polymerer er PEG 2000 - b -PLA 1800 (3800 Da) og PEG 4000 - b -PLA 2200 (6200 Da). PEG- b -PLA miceller kan derfor gi en unik plattform som nanocarrier for DTX og EVR enkeltvis og i kombinasjon. De nødvendige reagenser / Materialer og utstyr som trengs for å forberede og karakterisere disse miceller er oppført i tabell 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av individuelle og Multi-narkotika Loaded Miceller av Solvent Casting Metode
- Vei ut DTX 1 mg eller EVR 1 mg eller begge legemidlene på 1 mg hver for de to narkotika miceller (DDM).
- Vei opp 15 mg av PEG 2000 - b -PLA 1800 eller PEG 4000 - b -PLA 2 200 for enten individuelt eller DDM.
- Oppløs stoffet / stoffene og polymeren i 0,5 ml acetonitril, og plasser i en 5 ml rundbunnet kolbe.
- Danner en tynn medikament fordelt polymer film ved fordampning av medikament (er) -polymer acetonitril-løsning under redusert trykk under anvendelse av en rotasjonsfordamper. Innstill rotasjonsfordamper til 100 rpm, vann badtemperatur på 40 ° C og et vakuumtrykk på 260 mbar i 5 minutter etterfulgt av en reduksjon til 100 mbar for tre flere min.
- Rehydrere legemiddel-polymer-film med 0,5 ml avionisert vann ved 50 o C og rist kolben for å danne miceller.
- Filtrere resultateting micellar løsningen gjennom et 0,2 pm nylonfilter for å fjerne eventuelle un-oppløst legemiddel eller forurensninger inn i et 1,5 ml sentrifugerør.
2. Vurdering av Drug Lasting og stabilitet i Miceller Bruke omvendt-fase HPLC (RP-HPLC)
- RP-HPLC-analyse utføre med en C8-kolonne equilibriated ved 40 ° C i en modus med en isokratisk mobil fase av acetonitril / vann (62/38) inneholdende 0,1% fosforsyre og 1% metanol ved en strømningshastighet på 1 ml / min og et injeksjonsvolum på 10 pl.
- Fortynne nylagde miceller (seksjon 1) 1: 100 i mobilfase før analyse av RP-HPLC for å bestemme innledende stoffet lasting. Oppbevar ufortynnet individuelle miceller og DDM ved romtemperatur (25 ° C) i 48 timer og fremstille nye 1: 100 fortynnede prøver i mobil fase til å re-evaluere ved RP-HPLC og bestemme medikament (er) stabilitet i miceller i løpet av 24 timer.
- Overvåke DTX og EVR topper ved 227 og 279 nm henholdsvismed retensjonstider på 1,7 og 5,7 min hhv. Utføre alle målinger i tre eksemplarer. Presentere data som gjennomsnitt ± SD narkotika lasting.
3. Vurdering av micelle Particle Size av Dynamisk lysspredning (DLS)
- Fortynn nylagede miceller (som beskrevet i avsnitt 1) i deionisert vann i et forhold på 1:20 for å gi en endelig polymerkonsentrasjon på 1,5 mg / ml.
- Måle intensiteten av He-Ne-laser (633 nm) ved 173 ° for å bestemme spredning. Utføre alle målinger ved 25 ° C etter pre-likevekt i 2 min.
- Utføre alle målinger i tre eksemplarer. Presentere data som gjennomsnittlig Z-midlere størrelse ± SD sammen med polydispersitetsindeksen (PDI) av fordelingen.
4. Vurdering av In Vitro Drug Løslatelse fra Individuelle Miceller og DDM
- Utarbeide individuelle miceller og DDM som beskrevet i punkt 1. Legg 2,5 ml av miceller i en 3 ml dialyse kassett meden molekylvekt cut-off (MWCO) på 7000 g / mol.
MERK: Denne MWCO ble valgt for å gjøre det mulig for fritt medikament (er) sammen med ikke er tilknyttet, polymermolekylene til å diffundere fritt ut av kassetten, og derved sørge for vask betingelser. - Plassere kassettene i 2,5 liter 10 mM pH 7,4 fosfatbuffer (fremstilt ved å fortynne lager 200 mM løsning) og forandre bufferen hver 3 timer for å sikre synkeforhold. Opprettholde temperaturen i bufferen ved 37 ° C i løpet av varigheten av forsøket.
- På 0, 0,5, 1, 2, 3, 6, 9, 12, 24, og 48 timer, ta ut 150 ul av oppløsningen i kassettene og erstatt med 150 ul friskt buffer.
- Analysere prøvene ved hjelp av RP-HPLC som lagt i seksjon 2 for å bestemme medikamentkonsentrasjonen. Kurve passe medikament (er) slipper data basert på en enkel diffusjon modell med en fase eksponensiell foreningen bruker stastitical programvare.
- Beregn nødvendig tid for å nå 50% av medikamentfrigjøring (t 1/2) av each medikamentet i individuelle miceller eller DDM basert på det kurvetilpasning. Utføre alle målinger i quadruplet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Individuell DTX eller EVR miceller og DTX og EVR DDM i PEG- b -PLA miceller er vellykket formulert i enten PEG 4000 - b -PLA 2 200 eller PEG 2000 - b -PLA 1800 (figur 1).
DTX, EVR, og DDM viste tilsvarende stabilitet i PEG 4000 - b -PLA 2200 eller PEG 2000 - b -PLA 1 800 i løpet av 48 timer (figur 2). Initial narkotika lasting av EVR i PEG 4000 - b -PLA 2200 og PEG 2000 - b -PLA 1800 er 1,86 og 1,87 mg / ml. Mens første DTX lasting i PEG 4000 - b -PLA 2200 og i PEG 2000 - b -PLA 1800 er 1,85 og 1,78 mg / ml. Den innledende lasting av både DTX og EVR i DDM miceller ved hjelp av hver av polymerene er lik den enkelte miceller. Alle micellene beholdt 97% eller mer av den opprinnelige lasteved 48 timer ved romtemperatur.
Micelle størrelse bedømmes ved DLS og basert på resultatene alle micellene viste en unimodal fordeling med PDI-verdier på mindre enn 0,2. Z-gjennomsnittet gjennomsnittsstørrelser for DTX, EVR og DDM i PEG 2000 - b -PLA 1800 er ca 18,05 ± 0,06 nm (PDI = 0,079 ± 0,013), mens i PEG 4000 - b -PLA 2 200 størrelsen er ca 34,09 ± 0,24 nm (PDI = 0,137 ± 0,004) (figur 3).
Å representere nytten av å bruke både polymerer frigjøringsforsøk utføres med PEG 4000 - b -PLA 2200 for EVR miceller eller DDM og PEG 2000 - b -PLA 1800 for DTX miceller. Den in vitro medikament (er) frigjøring fra miceller blir vurdert i pH 7,4 buffer ved 37 ° C ved hjelp av dialyse under vasken betingelser i 48 timer. Basert på data, DTX utgivelsen fra individuelle miceller og DDM er ca.oximately 60% over 48 timer (figur 4). EVR utgivelsen fra individuelle miceller og DDM var henholdsvis 60% og 50% (figur 4). T 1/2 for hvert legemiddel fra individuelle miceller og DDM og godheten av tilpasning av data er presentert i tabell 2. Den godhet kurvetilpasning (r 2) for alle unntatt miceller evr individuelle miceller er over 0.950 som betyr at antagelsen av første orden utgivelsen er en god tilnærming for å forklare stoffet utgivelsen fra individuelle miceller og DDM.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av enkelte DTX eller EVR PEG- b- PLA miceller og DDM lastet med DTX og EVR.
Figur 2:Drug (e) lasting og stabilitet av DTX og EVR individuelle miceller og DDM i PEG 2000 - b -PLA 1800 (A) eller PEG 4000 - b -PLA 2200 (B). Medikamentkonsentrasjonen i micellene er kvantifisert ved RP-HPLC på 0, 24 og 48 timer. Data representeres som Mean ± SD av tredoble runs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Individuell micelle og DDM størrelse bestemmelse av DLS i PEG 2000 - b -PLA 1800 (A) eller PEG 4000 - b -PLA 2 200 (B). Micellen størrelse er bestemt ved dynamisk lysspredning. Dataene er presentert er en representativ for fordelingen for than individuelle miceller og DDM i de to polymerer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Drug (e) frigjøring av DTX (A) og EVR (B) fra individuelle miceller og DDM (C). Medikamentfrigjøringsstudier utføres ved dialyse og under vasken betingelser under opprettholdelse av temperaturen dersom systemet ved 37 o C Dataene som presenteres er Mean Drug Slipp ± SD av 4 replikater. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Micelle | t 1/2 (hr) | r 2 |
| DTX | 10 | 0,986 |
| EVR | 35 | 0,82 |
| DDM | DTX - 8.86 | DTX - 0,987 |
| EVR - 48 | EVR - 0,955 |
Tabell 2: Den tiden som trengs for 50% av narkotika utgivelse (t 1/2) og godhet av kurvetilpasning (r 2) fra in vitro utgivelsen studien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PEG2000-b-PLA1800 | Advanced Polymer Materials, Inc | 6-01- PLA/2000 | PLA MW can be specified on ordering |
| PEG4000-b-PLA2200 | Advanced Polymer Materials, Inc | 6-01- PLA/4000 | PLA MW can be specified on ordering |
| Docetaxel | LC Laboratories | D-1000 | 100 mg |
| Everolimus | LC Laboratories | E-4040 | 100 mg |
| Acetonitrile | EMD/VWR | EM-AX0145-1 | HPLC grade; 4 L |
| Round bottom flask | Glassco/VWR | 89426-496 | 5 ml |
| RV 10 Control Rotary Evaporators | IKA Works | 8025001 | Rotoevaporator |
| Shimadzhu HPLC with DAD detector | Shimadzhu | RP-HPLC | |
| Slide-a-lyzer dialysis casette MWCO 7000 | Thermo Scientific, Inc | 66370 | 3 ml |
| Phosphate buffer pH 7.4, 200 mM | VWR | 100190-870 | 500 ml |
| Malvern NanoZS | Malvern Instruments, UK | DLS | |
| Nylon filter | Acrodisc/VWR | 28143-242 | 13 mm; 0.2µM |
| Phosphoric acid, NF | Spectrum Chemical/VWR | 700000-626 | 100 ml |
| GraphPad Prism | www.graphpad.com | Analysis software | |
| Zorbax SB-C8 Rapid Resolution cartridge | Agilent Technologies | 866953-906 | 4.6 ×75 mm, 3.5 μm |
References
- Yokoyama, M. Polymeric micelles as a new drug carrier system and their required considerations for clinical trials. Expert Opin Drug Deliv. 7, 145-158 (2010).
- Shin, H. C., Alani, A. W., Rao, D. A., Rockich, N. C., Kwon, G. S. Multi-drug loaded polymeric micelles for simultaneous delivery of poorly soluble anticancer drugs. J Control Release. 140, 294-300 (2009).
- Adams, M. L., Lavasanifar, A., Kwon, G. S. Amphiphilic block copolymers for drug delivery. J Pharm Sci. 92, 1343-1355 (2003).
- Oerlemans, C., et al. Polymeric micelles in anticancer therapy: targeting, imaging and triggered release. Pharm Res. 27, 2569-2589 (2010).
- Shin, H. C., et al. A 3-in-1 polymeric micelle nanocontainer for poorly water-soluble drugs. Mol Pharm. 8, 1257-1265 (2011).
- Hasenstein, J. R., et al. Antitumor activity of Triolimus: a novel multidrug-loaded micelle containing Paclitaxel Rapamycin, and 17-AAG. Mol Cancer Ther. 11, 2233-2242 (2012).
- Mazzaferro, S., et al. Bivalent sequential binding of docetaxel to methyl-beta-cyclodextrin. Int J Pharm. 416, 171-180 (2011).
- Iwase, Y., Maitani, Y. Preparation and in vivo evaluation of liposomal everolimus for lung carcinoma and thyroid carcinoma. Biol Pharm Bull. 35, 975-979 (2012).
- Mishra, G. P., Doddapaneni, B. S., Nguyen, D., Alani, A. W. Antiangiogenic effect of docetaxel and everolimus as individual and dual-drug-loaded micellar nanocarriers. Pharm Res. 31, 660-669 (2014).
- Xu, W., Ling, P., Zhang, T. Polymeric micelles, a promising drug delivery system to enhance bioavailability of poorly water-soluble drugs. J Drug Deliv. 2013, 340315 (2013).
- Lavasanifar, A., Samuel, J., Kwon, G. S. Poly(ethylene oxide)-block-poly(L-amino acid) micelles for drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 54, 169-190 (2002).
