Abstract
Polietilenglikol blok -polylactic asit (PLA b- PEG) gibi bir amfifilik blok kopolimerleri, sulu ortamlarda hidrofilik kabuğuyla çevrelenmiş hidrofobik çekirdekler oluşturulmasını kritik misel konsantrasyonunun üzerinde miseller halinde kendi kendine birleşebilen olabilir. Bu misellerin çekirdek dosetaksel (DTX) ve everolimus (EVR) gibi hidrofobik, suda çözünürlüğü zayıf olan ilaçların yüklemek için kullanılabilir. Misel yapısı ve ilaç yükleme özellikleri sistematik karakterizasyonu yapılabilir in vitro ve in vivo çalışmalar önce önemlidir. Bu tarifnamede tarif edilen protokol amacı standart misel ürünler elde etmek için gerekli olan karakterizasyon adımları sağlamaktır. DTX ve EVR, sırasıyla, bu misellerin hazırlanışı, sırasıyla 1.86 ve 1.85 mg / ml için DTX ve EVR suda çözünürlüğünü arttırır solvent döküm yoluyla elde edilebilir ml / 1.9 ve 9.6 ug içsel çözünürlüklere sahiptir. Eval miseller ilaç stabilitesi48 saat boyunca oda sıcaklığında değerlendirmeler yapılmıştır ilaçların% 97 ya da daha fazla çözelti içinde muhafaza ettiğini göstermektedir. Misel boyutu, dinamik ışık saçılması ile değerlendirildi ve bu misellerin büyüklüğü 50 nm'nin altında ve polimerin molekül ağırlığına bağlı olduğu belirtilmiştir. Misellerin gelen ilaç salım 48 saat içinde 37 o C'de pH 7.4'te lavabo koşullarında diyaliz kullanılarak değerlendirildi. Eğri uydurma sonuçlar ilaç salım difüzyon tahrik belirten birinci dereceden bir işlem tarafından tahrik edilir olduğunu göstermektedir.
Introduction
Hidrofilik ve hidrofobik alanlardan oluşur yinelenen yapısına Amfifilik blok kopolimerleri kendiliğinden polimerik miseller olarak bilinen üç boyutlu bir makro-moleküler derlemeleri oluşturmak üzere kendi kendine birleşebilen olabilir. Bu yapılar, bir hidrofilik kabuk tarafından çevrelenmiş bir iç hidrofobik bir çekirdeğe sahiptir. Hidrofobik merkez fiziksel olarak yakalanmalarında hidrofobik etkileşimler yoluyla ya da polimer omurgasına kimyasal konjügasyon yoluyla hidrofobik ilaçların da kapsama alınması için yeteneği vardır. 1 Bir çok avantajı, ilacın verilmesi için miselleri meydana getirmek üzere, bu blok kopolimerleri kullanarak bulunmaktadır. Bu polimerlerin az çözünen ilaçların birleşme, dahil ilaçların farmakokinetik özelliklerini iyileştirmek ve biyo-uyumluluk ve / veya biyo-bozunabilirlik içerir olanağına klasik çözünür hale güvenli bir alternatif yapar. 2, polimerik miseller kullanmanın bir diğer avantajı 15- arasında kendi kolloidal parçacık büyüklüğü olan pa için onları çekici hale 150 nm 3,eksipiyanlar teslimat. Bu nedenle, son 20 yılda, polimerik miseller, özellikle kanser terapisi için suda zayıf çözünür ilaçlar için uygun bir ilaç verme sistemleri olarak ortaya çıkmıştır. 3,4
Son polietilenoksit içeren bir üç bloklu kopolimer ise şu anda klinik denemeler geçiren kanser tedavisi. Klinik çalışmalarda misellerin 4 Four için beş polimerik misel formülasyonları PEG-bazlı çift bloklu kopolimerleri bulunması halinde. Bu misellerin büyüklüğü 20 nm ila 85 nm için değiştirilebilir. PEG bazlı polimerlerin kullanılmasının avantajı, bunların biyolojik uyumluluk ve ikinci blokta bağlı olarak biyo-bozunabilir de olabilir. Polietilenglikol blok -polylactic asit (-PLA b PEG), polimerik miseller göre en son yeni ilaç verme sistemleri birden fazla anti-kanser ilaçları eş zamanlı verilmesi için geliştirilmiştir. PEG-PLA b- misellerin bir biyouyumlu ve biyobozunur her ikisi de. Yüklenen miseller olarak göstermiştir bu çoklu ilaçynergistic vitro ve in vivo 2,5,6 farklı kanser modelleri önlenmesi ve direncini önleme kemoterapide birden fazla ilaç kullanan ve toksisiteyi düşürmek mevcut paradigma uyum sağlar. Bu nedenle, hazırlanması ve kanser ve diğer hastalık durumlarında kullanılmak üzere bu misel ilaç taşıyıcı sistemleri karakterize bir ilgi çok şey var.
Çalışmada bu tür misel hazırlanmış ve ilgi hastalık durumlarında onları değerlendirilmeden önce karakterize edilebilir bir adım-adım süreci ana hatlarıyla aşağıda. Bu çalışmanın amacı için iki zayıf çözünen anti-kanser ajanları, dosetaksel (DTX) ve everolimus (EVR) seçilmiştir. DTX ve EVR Hem sırasıyla ml / 1.9 ve 9.6 ug içsel su çözünürlük ile suda az çözünen bileşiklerdir. Farklı moleküler ağırlıklara sahip 7,8 İki PEG b -PLA polimerler formüle polimer yapı taşları olarak bu protokolü kullanılmıştır miseller,-PLA 1800 (3800 Da) ve PEG 4000 b - - -PLA 2200 (6200 Da) b bu polimerler PEG 2000 bulunmaktadır. PEG-b -PLA miseller, bu nedenle DTX ve EVR tek tek ve kombinasyon halinde bir nanocarrier olarak benzersiz bir platform sağlar. Gerekli Reaktifler / Malzeme ve Ekipmanları hazırlamak ve bu misel Tablo 1'de belirtilmiştir karakterize gerekiyordu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Çözücü döküm yöntemiyle ayrı ayrı ve Çok-ilaç yüklü misellerin hazırlanması 1.
- Çift ilaç miselleri için 1 mg her (DDM) de DTX 1 mg veya EVR 1 mg veya her ikisi ilaçlar tartılır.
- PEG 2000 15 mg tartılır - -PLA 1800 veya PEG 4000 b - b -PLA 2200 bireysel ya da DDM biri için.
- Ilaç / uyuşturucu ve bir 5 ml'lik yuvarlak dipli bir şişeye asetonitril ve yerine 0.5 ml içindeki polimeri ayrıştırın.
- Bir döner buharlaştırıcı kullanılarak indirgenmiş basınç altında ilaç (lar)-polimer asetonitril çözeltiyi buharlaştırarak ince ilaç dağıtılmış polimer film oluşturmak. 100 rpm, 40 o C su banyosu sıcaklığında ve 3 dakika daha 100 mbar, bir redüksiyon sonrasında 5 dakika boyunca 260 mbar'lık bir vakum basıncı döner bir buharlaştıncı ayarlayın.
- 50 ° C'de iyonu giderilmiş su, 0.5 ml ilaç polimer film rehidrate ve yavaşça miseller oluşturmak için çalkalanır.
- Filtre sonucu0.2 um naylon filtre vasıtasıyla misel çözeltisi ing 1,5 ml santrifüj tüpüne bir Erimemiş ilaç veya kirleri çıkarmak için.
Ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi (RP-HPLC) kullanarak Değerlendirme miseller ilaç yükleme ve stabilitesi 2.
- 1 ml / dk'lık bir akış oranında, bir cep asetonitril / su fazı (62/38)% 0.1 fosforik asit,% 1 metanol ile izokratik modda, 40 ° C'de equilibriated bir C8 sütunu ile RP-HPLC analizi gerçekleştirmek ve 10 ul bir enjeksiyon hacmi.
- Önceden ilk ilaç yükleme belirlemek için RP-HPLC ile analiz mobil faz: 100 taze hazırlanmış miseller (bölüm 1) 1 seyreltin. RP-HPLC ile tekrar değerlendirilmesi ve 24 saat boyunca miselleri içine ilaç (lar) dengesini belirlemek için mobil faz olarak 100 seyreltilmiş örnekleri: Mağaza seyreltilmemiş bağımsız miselleri ve 48 st için oda sıcaklığında (25 ° C) de DDM ve taze 1 hazırlar.
- Sırasıyla 227 ve 279 nm DTX ve EVR doruklarına Monitörsırasıyla 1.7 ve 5.7 dakika tutma süreleri ile. Üçlü olarak tüm ölçümleri yapın. Ortalama ± SD ilaç yüklemesi olarak mevcut veriler.
Dinamik ışık saçılımı ile misel Partikül Boyutu 3. Değerlendirmesi (DLS)
- 1.5 mg / ml'lik nihai bir polimer konsantrasyonuna vermek üzere 1:20 oranında iyonu giderilmiş su içinde (bölüm 1 'de tarif edildiği gibi), taze hazırlanmış miseller seyreltilir.
- Saçılma belirlemek için 173 ° He-Ne lazer (633 nm) yoğunluğunu ölçün. 2 dakika süresince ön-dengeyi takiben 25 ° C 'de, tüm ölçümler gerçekleştirmek.
- Üçlü olarak tüm ölçümleri yapın. Dağıtım polidispersite indeksi (PDI) ile birlikte SD ± Ortalama Z-ortalama boyutu olarak mevcut veriler.
Bireysel miselleri ve DDM 4. Değerlendirme In Vitro İlaç Yayın
- 3 ml diyaliz kaseti içine bölüm 1. Yük misellerin 2.5 ml açıklandığı gibi bireysel miseller ve DDM hazırlayın7000 g / mol bir molekül ağırlığı kesme değeri (MWCO).
Not: Bu MWCO kaset dışına serbestçe yaygın ve böylece lavabo koşulları sağlamak için ilişkilendirilmemiş polimer molekülleri ile birlikte ücretsiz ilaç (lar) etkinleştirmek için seçildi. - (Stok 200 mM'lik çözelti seyreltilerek hazırlandı), 10 mM pH 7.4 fosfat tampon maddesi 2.5 L, kasetler yerleştirin ve lavabo koşulları temin etmek üzere bir tampon her 3 saat değiştirin. Deney süresi boyunca 37 o C tampon sıcaklığını muhafaza.
- 'De 0, 0.5, 1, 2, 3, 6, 9, 12, 24, ve 48 saat, kasetlerinde çözeltisi 150 ul çekme ve taze tampon 150 ul ile değiştirin.
- Ilaç konsantrasyonu belirlemek için 2. bölümünde kurulan RP-HPLC kullanılarak numunelerin analiz. Stastitical yazılımını kullanarak bir fazlı üstel dernek ile basit difüzyon modeline dayalı ilaç (lar) salım verileri Eğrisi-uyacak.
- E ilaç salımı% 50 ulaşmak için gereken süreyi hesaplayın (t 1/2)eğri dayanan bireysel miseller veya DDM olarak ach uyuşturucu. Dördüzden tüm ölçümleri yapın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bireysel DTX veya EVR miselleri ve miseller başarıyla PEG 4000 ya formüle edilir -PLA b PEG içinde DTX ve EVR DDM - b -PLA 2200 veya PEG 2000 - b -PLA 1800 (Şekil 1).
DTX EVR ve DDM PEG 4000 içindeki kararlılık göstermiştir - 48 saatten fazla bir -PLA 1800 b (Şekil 2) - -PLA 2200 veya PEG 2000, b. -PLA 2200, b ve PEG 2000 - - -PLA 1800 1.86 ve 1.87 mg b / ml PEG 4000 yılında EVR başlangıç ilaç yüklemesi. -PLA 2200 b ve PEG 2000 - - PEG 4000 yılında ilk DTX yükleme yaparken -PLA 1800 b 1.85 ve 1.78 mg / ml. Polimerlerin her biri kullanılarak DDM miselleri içine DTX ve EVR her iki başlangıç yükleme bağımsız miseller benzer. Tüm miseller ilk yükleme% 97 veya daha fazla muhafazaOda sıcaklığında 48 saat sonra.
Misel boyutu, tüm miseller 0.2 den daha az KAE değerleri ile unimodal dağılım gösteren sonuçları DLS ile değerlendirilmiş ve dayanır. PEG 2000 DTX, EVR ve DDM z-ortalama ortalama boyutları - -PLA 1800 b yaklaşık 18.05 ± 0.06 nm (PDI = 0.079 ± 0.013) PEG 4000 iken - b -PLA 2200 boyutu yaklaşık 34,09 ± 0,24 olduğu nm (Şekil 3) (PDI 0.137 ± 0.004 =).
EVR miseller veya DDM ve PEG 2000 -PLA 2200 b - - -PLA 1800 b DTX misellerin sürüm deneyleri PEG 4000 kullanılarak gerçekleştirilen her iki polimerler kullanılarak yararını temsil etmek. Miseller in vitro ilaç (lar) yayın 48 saat süre ile, çökelme koşulları altında diyaliz ile 37 ° C'de pH 7.4 tampon maddesi içinde değerlendirilir. Veriler, bireysel miseller ve DDM gelen DTX salınımı dayanarak yakl olduğunuoximately% 60 48 üzerinde saat (Şekil 4). Bireysel misellerin ve DDM den EVR bırakma% 60 ve% 50 sırasıyla (Şekil 4). Bireysel miseller ve DDM ve uyum verilerinin iyiliği her bir ilaç için t 1/2, Tablo 2 içinde sunulmaktadır. Varsayımı anlamına gelir eğri uydurma (r2) EVR bağımsız miseller dışındaki tüm miseller için yukarıda 0,950 olan iyiliğini birinci dereceden bir salınma bağımsız miseller ve DDM ilaç salımını açıklamak için iyi bir tahmindir.
Şekil 1: DTX ve EVR yüklü bireysel DTX veya EVR PEG b- PLA miseller ve DDM şematik gösterimi.
Şekil 2:B -PLA 2200 (B) - -PLA 1800 (A) ya da PEG 4000 b - PEG 2000 İlaç (lar) yükleme ve DTX ve EVR bağımsız miseller ve DDM kararlılığı. Miseller ilaç konsantrasyonu 0, 24 ve 48 saat sonra RP-HPLC ile belirlenir. Üçlü çalışır ortalama ± SD olarak temsil veriler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: PEG 2000 DLS tarafından bireysel misel ve DDM boyutu tayini - b -PLA 2200 (B) - -PLA 1800 (A) veya PEG 4000, b. Misel boyutu Dinamik ışık saçılımı ile değerlendirilir. Elde edilen sonuçlar, bir t dağılımının bir temsiliİki polimerlerde o bireysel miseller ve DDM. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: tek tek miseller ve DDM (C) den DTX (A) ve EVR (B) İlaç (lar) serbest bırakma. 37 o C de sisteme eğer sıcaklık korunurken ilaç salım çalışmaları diyaliz ve lavabo şartlarında yapılır Sunulan veriler 4 çoğaltır ± SD Ortalama İlaç Release olduğunu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Misel | t 1/2 (saat) | r 2 |
| DTX | 10 | 0,986 |
| EVR | 35 | 0.82 |
| DDM | DTX - 8.86 | DTX - 0.987 |
| EVR - 48 | EVR - 0.955 |
Tablo 2: in vitro salım çalışma 50% ilaç salımının (t 1/2) ve eğri uydurma iyilik (r2) için gereken zaman.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PEG2000-b-PLA1800 | Advanced Polymer Materials, Inc | 6-01- PLA/2000 | PLA MW can be specified on ordering |
| PEG4000-b-PLA2200 | Advanced Polymer Materials, Inc | 6-01- PLA/4000 | PLA MW can be specified on ordering |
| Docetaxel | LC Laboratories | D-1000 | 100 mg |
| Everolimus | LC Laboratories | E-4040 | 100 mg |
| Acetonitrile | EMD/VWR | EM-AX0145-1 | HPLC grade; 4 L |
| Round bottom flask | Glassco/VWR | 89426-496 | 5 ml |
| RV 10 Control Rotary Evaporators | IKA Works | 8025001 | Rotoevaporator |
| Shimadzhu HPLC with DAD detector | Shimadzhu | RP-HPLC | |
| Slide-a-lyzer dialysis casette MWCO 7000 | Thermo Scientific, Inc | 66370 | 3 ml |
| Phosphate buffer pH 7.4, 200 mM | VWR | 100190-870 | 500 ml |
| Malvern NanoZS | Malvern Instruments, UK | DLS | |
| Nylon filter | Acrodisc/VWR | 28143-242 | 13 mm; 0.2µM |
| Phosphoric acid, NF | Spectrum Chemical/VWR | 700000-626 | 100 ml |
| GraphPad Prism | www.graphpad.com | Analysis software | |
| Zorbax SB-C8 Rapid Resolution cartridge | Agilent Technologies | 866953-906 | 4.6 ×75 mm, 3.5 μm |
References
- Yokoyama, M. Polymeric micelles as a new drug carrier system and their required considerations for clinical trials. Expert Opin Drug Deliv. 7, 145-158 (2010).
- Shin, H. C., Alani, A. W., Rao, D. A., Rockich, N. C., Kwon, G. S. Multi-drug loaded polymeric micelles for simultaneous delivery of poorly soluble anticancer drugs. J Control Release. 140, 294-300 (2009).
- Adams, M. L., Lavasanifar, A., Kwon, G. S. Amphiphilic block copolymers for drug delivery. J Pharm Sci. 92, 1343-1355 (2003).
- Oerlemans, C., et al. Polymeric micelles in anticancer therapy: targeting, imaging and triggered release. Pharm Res. 27, 2569-2589 (2010).
- Shin, H. C., et al. A 3-in-1 polymeric micelle nanocontainer for poorly water-soluble drugs. Mol Pharm. 8, 1257-1265 (2011).
- Hasenstein, J. R., et al. Antitumor activity of Triolimus: a novel multidrug-loaded micelle containing Paclitaxel Rapamycin, and 17-AAG. Mol Cancer Ther. 11, 2233-2242 (2012).
- Mazzaferro, S., et al. Bivalent sequential binding of docetaxel to methyl-beta-cyclodextrin. Int J Pharm. 416, 171-180 (2011).
- Iwase, Y., Maitani, Y. Preparation and in vivo evaluation of liposomal everolimus for lung carcinoma and thyroid carcinoma. Biol Pharm Bull. 35, 975-979 (2012).
- Mishra, G. P., Doddapaneni, B. S., Nguyen, D., Alani, A. W. Antiangiogenic effect of docetaxel and everolimus as individual and dual-drug-loaded micellar nanocarriers. Pharm Res. 31, 660-669 (2014).
- Xu, W., Ling, P., Zhang, T. Polymeric micelles, a promising drug delivery system to enhance bioavailability of poorly water-soluble drugs. J Drug Deliv. 2013, 340315 (2013).
- Lavasanifar, A., Samuel, J., Kwon, G. S. Poly(ethylene oxide)-block-poly(L-amino acid) micelles for drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 54, 169-190 (2002).
