Abstract
Amfifile blokcopolymerer som polyethyleneglycol- blok -polylactic syre (PEG b- PLA) kan selv samle ind miceller over deres kritiske micellekoncentration danner hydrofobe kerner omgivet af hydrofile skaller i vandige miljøer. Kernen i disse miceller kan anvendes til at indlæse hydrofobe, dårligt vandopløselige stoffer som docetaxel (DTX) og everolimus (EVR). Systematisk karakterisering af micelle struktur og medikamentloading kapaciteter er vigtigt, før in vitro og in vivo studier kan udføres. Målet med den protokol, der er beskrevet heri, er at tilvejebringe de nødvendige karakterisering skridt til at opnå standardiserede micellare produkter. DTX og EVR har iboende opløseligheder 1,9 og 9,6 ug / ml Fremstilling af disse miceller kan opnås gennem opløsningsmiddel støbning som forøger den vandige opløselighed DTX og EVR til 1,86 og 1,85 mg / ml. Drug stabilitet i miceller evaluated ved stuetemperatur over 48 timer angiver, at 97% eller flere af lægemidlerne opbevares i opløsning. Micelle størrelse blev vurderet ved anvendelse dynamisk lysspredning og anført, at størrelsen af disse miceller var under 50 nm og afhang af molekylvægten af polymeren. Lægemiddelfrigivelse fra micellerne blev vurderet med dialyse under vasken betingelser ved pH 7,4 ved 37 ° C i løbet af 48 timer. Kurvetilpasning resultater viser, at lægemiddelfrigivelse drives ved en første ordens proces angiver, at det er diffusion drives.
Introduction
Amfifile blokcopolymerer med gentagne struktur bestående af hydrofile og hydrofobe domæner kan spontant samles for at danne tredimensionale makromolekylære aggregater kendt som polymermiceller. Disse strukturer har en indre hydrofob kerne omgivet af en hydrofil skal. Den hydrofobe kerne har evnen til at inkorporere hydrofobe lægemidler enten ved fysisk indfangning via hydrofobe interaktioner eller ved kemisk konjugering på polymerrygraden. 1 Mange fordele eksisterer for at bruge disse blokcopolymerer til dannelse af miceller til lægemiddeladministration. Disse omfatter inkorporering af dårligt opløselige lægemidler, forbedre farmakokinetikken af de inkorporerede lægemidler, og biokompatibilitet og / eller bionedbrydelighed af polymererne gør dem et sikkert alternativ til konventionelle solubiliseringsmidler. 2 En anden fordel ved anvendelse af polymere miceller er deres kolloid partikelstørrelse mellem 15- 150 nm 3, hvilket gør dem attraktive for parenteral levering. Derfor i løbet af de sidste 20 år polymermiceller er dukket op som levedygtige systemer til dårligt vandopløselige lægemidler, især til cancerterapi drug delivery. 3,4
I øjeblikket er der fem polymere micelleformuleringer til cancerterapi undergår kliniske forsøg. 4 Fire af micellerne i de kliniske forsøg er PEG-baserede diblokcopolymerer mens den sidste er en triblok-copolymer indeholdende polyethylenoxid. Størrelsen af disse miceller varierede fra 20 nm til 85 nm. Fordelen ved at anvende PEG-baserede polymerer er deres biokompatibilitet og afhængig af den anden blok kan også være biologisk nedbrydeligt. De nyeste systemer nye drug delivery baseret på polyethyleneglycol- blok -polylactic syre (PEG- b -PLA) polymermiceller er blevet udviklet til den samtidige levering af flere anticancerlægemidler. De PEG- b- PLA miceller er både biokompatible og bionedbrydelige. Disse multi-drug indlæst miceller har vist somynergistic inhibering af forskellige kræftformer modeller in vitro og in vivo 2,5,6 og passer ind i nuværende paradigme for at anvende flere lægemidler i kemoterapi for at forhindre resistens og sænke toksicitet. Der er derfor en stor interesse i fremstilling og karakterisering af disse micellære lægemiddeltilførselssystemer til anvendelse i cancer og andre sygdomstilstande.
I arbejdet nedenfor har vi skitseret en trin-for-trin proces, hvor sådanne miceller kan tilberedes og karakteriseret før evaluere dem i sygdomstilstande af interesse. I forbindelse med dette arbejde to dårligt opløselige anticancer-midler, har docetaxel (DTX) og everolimus (EVR) er valgt. Både DTX og EVR er dårligt vandopløselige forbindelser med iboende vandopløseligheder på 1,9 og 9,6 pg / ml. 7,8 To PEG b -PLA polymerer med forskellige molekylvægte blev anvendt i denne protokol som byggestenene til den formulerede polymere miceller,Disse polymerer er PEG 2000 - b -PLA 1800 (3.800 Da) og PEG 4000 - b -PLA 2200 (6.200 Da). PEG b -PLA miceller kan derfor levere en unik platform som en Nanobærer for DTX og EVR individuelt og i kombination. De nødvendige reagenser / materialer og udstyr nødvendig for at forberede og karakterisere disse miceller er anført i tabel 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Udarbejdelse af Individuelle og Multi-drug Loaded Miceller af opløsningsmiddel Casting Metode
- Afvejes DTX 1 mg eller EVR 1 mg eller begge lægemidler på 1 mg hver for de dobbelte narkotika miceller (DDM).
- Afvejes 15 mg af PEG 2000 - b -PLA 1800 eller PEG 4000 - b -PLA 2200 til enten individuelt eller DDM.
- Opløs lægemiddel / lægemidler og polymeren i 0,5 ml acetonitril og sted i en 5 ml rundbundet kolbe.
- Danne en tynd stof fordelt polymerfilm ved afdampning af lægemiddel (r) -polymer acetonitrilopløsning under reduceret tryk under anvendelse af en rotationsfordamper. Indstil rotationsfordamper til 100 rpm vandbadstemperatur på 40 ° C og et vakuumtryk på 260 mbar i 5 minutter efterfulgt af en reduktion til 100 mbar i endnu 3 min.
- Rehydrere lægemiddel-polymerfilm med 0,5 ml deioniseret vand ved 50 ° C og rystes kolben til dannelse af micellerne.
- Filtrer resultateting micelleopløsning gennem et 0,2 um nylonfilter til fjernelse af eventuelt ikke-opløst lægemiddel eller forurenende stoffer i et 1,5 ml centrifugerør.
2. Vurdering af lægemiddelladning og Stabilitet i Miceller Brug Reverse-fase højtryksvæskekromatografi (RP-HPLC)
- Udfør RP-HPLC-analyse med en C8-søjle equilibriated ved 40 ° C i et isokratisk tilstand med en mobil fase af acetonitril / vand (62/38) indeholdende 0,1% phosphorsyre og 1% methanol ved en strømningshastighed på 1 ml / min og et injektionsvolumen på 10 pi.
- Fortynd frisklavede miceller (afsnit 1) 1: 100 i mobil fase forud for analyse ved RP-HPLC til at bestemme indledende lægemiddelladning. Opbevar ufortyndede individuelle miceller og DDM ved stuetemperatur (25 ° C) i 48 timer og forberede friske 1: 100 fortyndede prøver i mobil fase til at re-vurdere ved RP-HPLC og bestemme lægemiddel (er) stabilitet i miceller i løbet 24 timer.
- Overvåg DTX og EVR toppe på 227 og 279 nmmed retentionstider på 1,7 og 5,7 minutter hhv. Udfør alle målinger i tre eksemplarer. Præsentere data som gennemsnit ± SD lægemiddelladning.
3. Vurdering af micelle Particle Size ved dynamisk lysspredning (DLS)
- Fortynd frisklavet miceller (som beskrevet i afsnit 1) i deioniseret vand i et forhold på 1:20 til opnåelse af en endelig polymerkoncentration på 1,5 mg / ml.
- Måle intensiteten af He-Ne laser (633 nm) ved 173 ° for at bestemme spredning. Udfør alle målinger ved 25 ° C efter pre-ligevægt i 2 min.
- Udfør alle målinger i tre eksemplarer. Nuværende data som den gennemsnitlige Z-gennemsnitlig størrelse ± SD sammen med polydispersitetsindeks (PDI) af distributionen.
4. Vurdering af In Vitro Drug Frigivelse fra individuelle miceller og DDM
- Forbered enkelte miceller og DDM som beskrevet i afsnit 1. Læg 2,5 ml af miceller i en 3 ml dialyse kassette meden molekylvægt cut-off (MWCO) på 7.000 g / mol.
BEMÆRK: Denne MWCO blev valgt til at gøre det muligt for det frie lægemiddel (e) sammen med de ikke-tilknyttede polymermolekyler at diffundere frit ud af kassetten og dermed sikre vask betingelser. - Placer kassetterne i 2,5 liter 10 mM pH 7,4 phosphatbuffer (fremstillet ved at fortynde lager 200 mM opløsning) og ændre puffer hver 3 timer for at sikre sænkevilkår. Holde temperaturen af bufferen ved 37 ° C under hele forsøgets varighed.
- Ved 0, 0,5, 1, 2, 3, 6, 9, 12, 24 og 48 timer, trække 150 pi af opløsning i kassetterne og erstat med 150 pi frisk buffer.
- Analyser prøverne ved hjælp af RP-HPLC som fastsat i afsnit 2 at bestemme koncentrationen lægemidlet. Kurve-passer stof (r) release data baseret på en simpel diffusion model med en en fase eksponentiel forening hjælp stastitical software.
- Beregn den nødvendige tid til at nå 50% af lægemiddelfrigivelse (t 1/2) for eACH lægemiddel i individuelle miceller eller DDM baseret på kurvetilpasning. Udfør alle målinger i firling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Individuel DTX eller EVR miceller og DTX og EVR DDM i PEG b -PLA miceller med succes er formuleret i enten PEG 4000 - b -PLA 2200 eller PEG 2000 - b -PLA 1800 (figur 1).
DTX, EVR, og DDM viste lignende stabilitet i PEG 4000 - b -PLA 2200 eller PEG 2000 - b -PLA 1800 over 48 timer (figur 2). Initial lastning stof EVR i PEG 4000 - b -PLA 2200 og PEG 2000 - b -PLA 1800 er 1,86 og 1,87 mg / ml. Mens indledende DTX lastning i PEG 4000 - b -PLA 2200 og PEG 2000 - b -PLA 1800 er 1,85 og 1,78 mg / ml. Den indledende belastning af både DTX og EVR i DDM miceller anvendelse af hver af polymererne ligner individuelle miceller. Alle micellerne beholdt 97% eller mere af den oprindelige loadingved 48 timer ved stuetemperatur.
Micelle størrelse vurderes ved DLS og baseret på resultaterne alle miceller viste en unimodal fordeling med PDI-værdier på mindre end 0,2. Z-gennemsnittet gennemsnitlige størrelser til DTX, EVR og DDM i PEG 2000 - b -PLA 1800 er ca. 18.05 ± 0,06 nm (PDI = 0,079 ± 0,013), mens i PEG 4000 - b -PLA 2200 størrelsen er cirka 34,09 ± 0,24 nm (PDI = 0,137 ± 0,004) (Figur 3).
At repræsentere nytten af at bruge begge polymerer release eksperimenter udføres ved hjælp af PEG 4000 - b -PLA 2200 for EVR miceller eller DDM og PEG 2000 - b -PLA 1800 for de DTX miceller. In vitro drug (s) frigivelse fra miceller vurderes i pH 7,4 puffer ved 37 ° C ved dialyse under vasken betingelser i 48 timer. På baggrund af de data, DTX frigivelse fra individuelle miceller og DDM er ca.oximately 60% i løbet af 48 timer (figur 4). EVR frigivelse fra individuelle miceller og DDM var 60% og 50% (figur 4). T 1/2 for hvert lægemiddel fra individuelle miceller og DDM og goodness of fit data præsenteres i tabel 2. Godhed kurvetilpasning (R2) for alle miceller undtagen EVR individuelle miceller er over 0.950, hvilket betyder, at antagelsen af første-ordens frigivelse er en god tilnærmelse at forklare lægemiddelfrigivelse fra individuelle miceller og DDM.
Figur 1: Skematisk fremstilling af individuelle DTX eller EVR PEG b- PLA miceller og DDM fyldt med DTX og EVR.
Figur 2:Drug (s) lastning og stabilitet DTX og EVR individuelle miceller og DDM i PEG 2000 - b -PLA 1800 (A) eller PEG 4000 - b -PLA 2200 (B). Koncentrationen af lægemiddel i micellerne kvantificeres ved RP-HPLC ved 0, 24 og 48 timer. Data, der er repræsenteret som gennemsnit ± SD af tredobbelte kørsler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Individuel micelle og DDM størrelse bestemmelse ved DLS i PEG 2000 - b -PLA 1800 (A) eller PEG 4000 - b -PLA 2200 (B). Micellen størrelse vurderes ved dynamisk lysspredning. Dataene præsenteres er en repræsentant for distributionen til than enkelte miceller og DDM i de to polymerer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Drug (s) frigivelse af DTX (A) og EVR (B) ud fra individuelle miceller og DDM (C). Undersøgelser lægemiddelfrigivelse udføres ved dialyse og under vasken betingelser, idet temperaturen holdes hvis systemet ved 37 ° C. De viste data er Mean Drug Frigivelse ± SD af 4 replikater. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Micelle | t 1/2 (hr) | R2 |
| DTX | 10 | 0,986 |
| EVR | 35 | 0,82 |
| DDM | DTX - 8,86 | DTX - 0,987 |
| EVR - 48 | EVR - 0,955 |
Tabel 2: Den nødvendige tid for 50% lægemiddelfrigivelse (t 1/2) og godhed kurvetilpasning (R2) fra in vitro frigivelse undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PEG2000-b-PLA1800 | Advanced Polymer Materials, Inc | 6-01- PLA/2000 | PLA MW can be specified on ordering |
| PEG4000-b-PLA2200 | Advanced Polymer Materials, Inc | 6-01- PLA/4000 | PLA MW can be specified on ordering |
| Docetaxel | LC Laboratories | D-1000 | 100 mg |
| Everolimus | LC Laboratories | E-4040 | 100 mg |
| Acetonitrile | EMD/VWR | EM-AX0145-1 | HPLC grade; 4 L |
| Round bottom flask | Glassco/VWR | 89426-496 | 5 ml |
| RV 10 Control Rotary Evaporators | IKA Works | 8025001 | Rotoevaporator |
| Shimadzhu HPLC with DAD detector | Shimadzhu | RP-HPLC | |
| Slide-a-lyzer dialysis casette MWCO 7000 | Thermo Scientific, Inc | 66370 | 3 ml |
| Phosphate buffer pH 7.4, 200 mM | VWR | 100190-870 | 500 ml |
| Malvern NanoZS | Malvern Instruments, UK | DLS | |
| Nylon filter | Acrodisc/VWR | 28143-242 | 13 mm; 0.2µM |
| Phosphoric acid, NF | Spectrum Chemical/VWR | 700000-626 | 100 ml |
| GraphPad Prism | www.graphpad.com | Analysis software | |
| Zorbax SB-C8 Rapid Resolution cartridge | Agilent Technologies | 866953-906 | 4.6 ×75 mm, 3.5 μm |
References
- Yokoyama, M. Polymeric micelles as a new drug carrier system and their required considerations for clinical trials. Expert Opin Drug Deliv. 7, 145-158 (2010).
- Shin, H. C., Alani, A. W., Rao, D. A., Rockich, N. C., Kwon, G. S. Multi-drug loaded polymeric micelles for simultaneous delivery of poorly soluble anticancer drugs. J Control Release. 140, 294-300 (2009).
- Adams, M. L., Lavasanifar, A., Kwon, G. S. Amphiphilic block copolymers for drug delivery. J Pharm Sci. 92, 1343-1355 (2003).
- Oerlemans, C., et al. Polymeric micelles in anticancer therapy: targeting, imaging and triggered release. Pharm Res. 27, 2569-2589 (2010).
- Shin, H. C., et al. A 3-in-1 polymeric micelle nanocontainer for poorly water-soluble drugs. Mol Pharm. 8, 1257-1265 (2011).
- Hasenstein, J. R., et al. Antitumor activity of Triolimus: a novel multidrug-loaded micelle containing Paclitaxel Rapamycin, and 17-AAG. Mol Cancer Ther. 11, 2233-2242 (2012).
- Mazzaferro, S., et al. Bivalent sequential binding of docetaxel to methyl-beta-cyclodextrin. Int J Pharm. 416, 171-180 (2011).
- Iwase, Y., Maitani, Y. Preparation and in vivo evaluation of liposomal everolimus for lung carcinoma and thyroid carcinoma. Biol Pharm Bull. 35, 975-979 (2012).
- Mishra, G. P., Doddapaneni, B. S., Nguyen, D., Alani, A. W. Antiangiogenic effect of docetaxel and everolimus as individual and dual-drug-loaded micellar nanocarriers. Pharm Res. 31, 660-669 (2014).
- Xu, W., Ling, P., Zhang, T. Polymeric micelles, a promising drug delivery system to enhance bioavailability of poorly water-soluble drugs. J Drug Deliv. 2013, 340315 (2013).
- Lavasanifar, A., Samuel, J., Kwon, G. S. Poly(ethylene oxide)-block-poly(L-amino acid) micelles for drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 54, 169-190 (2002).
