Abstract
Amphiphile Blockcopolymere wie Polyethylenglykol- Block -Polymilchsäure (PEG-b-PLA) können durch Selbstorganisation Micellen oberhalb ihrer kritischen Mizellenkonzentration bilden hydrophobe Kerne durch hydrophile Schale in wässrigen Umgebungen umgeben. Der Kern dieser Mizellen können genutzt werden, um hydrophobe, schlecht wasserlöslichen Medikamenten wie Docetaxel (DTX) und Everolimus (EVR) zu laden. Systematische Charakterisierung der Mizellen-Struktur und Wirkstoffbeladung Fähigkeiten sind wichtig, vor der in vitro und in vivo-Studien durchgeführt werden. Das Ziel des hierin beschriebenen Protokolls ist es, die notwendigen Schritte zur Charakterisierung standardisierten micellare Produkte erzielen. DTX EVR intrinsische Löslichkeiten von 1,9 und 9,6 ug / ml Die Herstellung dieser Mizellen kann durch Lösungsmittelgießen, welche die Wasserlöslichkeit des DTX EVR bis 1,86 und 1,85 mg / ml erhöht erreicht werden. Arzneimittelstabilität in Mizellen evalüber 48 Stunden bei Raumtemperatur ausgewertet zeigt an, dass 97% oder mehr der Arzneimittel in Lösung gehalten wird. Mizellengröße wurde unter Verwendung der dynamischen Lichtstreuung bewertet und zeigte, daß die Größe dieser Micellen unter 50 nm und hing von dem Molekulargewicht des Polymers. Wirkstofffreisetzung aus den Micellen wurde mittels Dialyse unter Sink-Bedingungen bei pH 7,4 bei 37 ° C über 48 Stunden beurteilt. Kurvenanpassung Ergebnisse zeigen, dass Wirkstofffreisetzung ist von einem Prozess erster Ordnung anzeigt, dass sie die Diffusion angetrieben.
Introduction
Amphiphilen Blockcopolymeren mit sich wiederholenden Struktur aus hydrophilen und hydrophoben Domänen spontan selbstorganisieren, um dreidimensionale makromolekularen Anordnungen als polymere Mizellen zu bilden. Diese Strukturen haben eine innere hydrophobe Kern, der von einer hydrophilen Schale umgeben ist. Der hydrophobe Kern hat die Fähigkeit, hydrophobe Arzneimittel entweder durch physikalischen Einschluß durch hydrophobe Wechselwirkungen oder durch chemische Konjugation an das Polymergerüst einzubauen. 1 Viele Vorteile bestehen bei der Verwendung dieser Blockcopolymere Micellen zur Arzneimittelabgabe zu bilden. Diese umfassen den Einbau von schlecht löslichen Arzneimitteln, die Verbesserung der pharmakokinetischen Eigenschaften der eingearbeiteten Arzneimittel und die Biokompatibilität und / oder die biologische Abbaubarkeit der Polymeren macht sie eine sichere Alternative zu herkömmlichen Lösungsvermittlern. 2 Ein weiterer Vorteil der Verwendung von polymeren Mizellen ist ihre kolloidale Teilchengröße zwischen 15- 150 nm 3, so dass sie für pa attraktivrenteral Lieferung. Deshalb in den letzten 20 Jahren polymere Mizellen wurden als lebensfähig Drug Delivery-Systemen für schlecht wasserlösliche Arzneimittel vor allem für die Krebstherapie 3,4 entstand.
Derzeit gibt es fünf polymere mizellaren Formulierungen für die Krebstherapie in der klinischen Erprobung. 4 Vier der Mizellen in klinischen Studien sind auf PEG-Basis Diblockcopolymere während das letzte ein Triblockcopolymer Polyethylenoxid enthält. Die Größe dieser Micellen variiert von 20 nm bis 85 nm. Der Vorteil der Verwendung von PEG basierenden Polymere ist ihre Biokompatibilität und abhängig vom zweiten Block kann auch biologisch abbaubar sein. Kürzlich neuen Drug Delivery-Systemen auf Basis von Polyethylenglykol- Block -Polymilchsäure (PEG-b -PLA) polymere Mizellen sind für die gleichzeitige Bereitstellung von mehreren Krebsmedikamente entwickelt. Die PEG-b- PLA Mizellen sind sowohl biokompatibel und biologisch abbaubar. Diese Mehr Arzneimittel beladene Mizellen wie gezeigtynergistic Hemmung von verschiedenen Krebsmodellen in vitro und in vivo 2,5,6 und passen in die aktuelle Paradigma unter Verwendung mehrerer Chemotherapeutika, um Widerstand zu verhindern und Absenken Toxizität. Daher gibt es ein großes Interesse in der Herstellung und Charakterisierung dieser mizellaren Arzneistoffabgabesysteme zur Verwendung bei Krebs und anderen Krankheitszuständen.
In der Arbeit unten haben wir einen Schritt-für-Schritt-Verfahren, mit denen solche Mizellen können hergestellt und charakterisiert, bevor sie in die Bewertung von Krankheitszuständen von Interesse werden skizziert. Für den Zweck dieser Arbeit zwei schlecht löslichen Antikrebsmitteln, Docetaxel (DTX) und Everolimus (EVR) wurden ausgewählt. Sowohl DTX und EVR sind schlecht wasserlösliche Verbindungen mit intrinsischen Wasserlöslichkeit bei 1,9 und 9,6 & mgr; g / ml. 7,8 zwei PEG-b -PLA Polymeren mit unterschiedlichen Molekulargewichten wurden in diesem Protokoll als Bausteine für die formulierten polymeren verwendet Micellendiese Polymere PEG 2000 - b -PLA 1800 (3800 Da) und PEG 4000 - b -PLA 2200 (6200 Da). PEG-b -PLA Mizellen kann deshalb eine einzigartige Plattform als Nanotransporter für DTX und EVR einzeln und in Kombination. Die benötigten Reagenzien / Erforderliche Materialien und Geräte für die Vorbereitung und charakterisieren diese Mizellen sind in Tabelle 1 aufgeführt.
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Protocol
1. Herstellung von Einzel- und Multi-Drogen-Loaded Mizellen durch Lösungsmittelgießen Methode
- Abwiegen DTX 1 mg oder EVR 1 mg oder beide Medikamente bei 1 mg jeweils für die Dual-Drogen Mizellen (DDM).
- Man wiegt 15 mg PEG 2000 - b -PLA 1800 oder PEG 4000 - b -PLA 2200 für individuelle oder DDM.
- Lösen die Arzneimittel / Drogen und das Polymer in 0,5 ml Acetonitril und in eine 5 ml-Rundkolben.
- Bilden eine dünne Arzneimittelpolymerschicht verteilt durch Verdampfen des Arzneimittel (s) -Polymer Acetonitril-Lösung unter vermindertem Druck unter Verwendung eines Rotationsverdampfers. Den Drehverdampfer auf 100 Upm, die Wasserbadtemperatur von 40 ° C und einem Unterdruck von 260 mbar für 5 min, gefolgt von einer Reduktion auf 100 mbar für weitere 3 min.
- Rehydrieren die Wirkstoff-Polymer-Film mit 0,5 ml deionisiertem Wasser bei 50 ° C und die Flasche schütteln, um die Mizellen zu bilden.
- Filtern Sie die Ergebnisseing micellare Lösung durch ein 0,2 um Nylon-Filter, um jede nicht gelösten Arzneimittels oder Verunreinigungen in einem 1,5 ml Zentrifugenröhrchen zu entfernen.
2. Bewertung der Wirkstoffbeladung und Stabilität in Mizellen mit Reverse-Phase-Hochleistungsflüssigchromatographie (RP-HPLC)
- Zuführen RP-HPLC-Analyse mit einer C8-Säule bei 40ºC mit einer mobilen Phase aus Acetonitril / Wasser (62/38), das 0,1% Phosphorsäure und 1% Methanol bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml / min equilibriert in einem isokratischen Modus und einem Injektionsvolumen von 10 ul.
- Verdünnen Sie frisch zubereitete Mizellen (Abschnitt 1) 1: 100 in der mobilen Phase vor der Analyse durch RP-HPLC, um anfängliche Wirkstoffbeladung zu bestimmen. Shop unverwässerte einzelnen Mizellen und DDM bei Raumtemperatur (25 ° C) für 48 Stunden und bereiten frische 1: 100 verdünnten Proben in der mobilen Phase neu zu bewerten durch RP-HPLC und Drug (s) Stabilität in Mizellen bestimmen, über 24 Stunden.
- Überwachen DTX und EVR Peaks bei 227 und 279 nm bzw.mit Retentionszeiten von 1,7 und 5,7 min auf. Führen Sie alle Messungen in dreifacher Ausfertigung. Vorliegenden Daten als Mittelwert ± SD Wirkstoffbeladung.
3. Bewertung der Mizellen Partikelgröße mittels dynamischer Lichtstreuung (DLS)
- Verdünnter frisch hergestellten Mizellen in entionisiertem Wasser in einem Verhältnis von 1:20 (wie in Abschnitt 1 beschrieben), um eine endgültige Polymerkonzentration von 1,5 mg / ml zu ergeben.
- Messen der Intensität des He-Ne-Laser (633 nm) bei 173 ° bis Streuung zu bestimmen. Führen Sie alle Messungen bei 25 ° C folgende pre-Äquilibrierung für 2 min.
- Führen Sie alle Messungen in dreifacher Ausfertigung. Vorhandenen Daten als Mittelwert Z-durchschnittliche Größe ± SA zusammen mit der Polydispersitätsindex (PDI) der Verteilung.
4. Bewertung der In-vitro-Wirkstofffreisetzung aus Einzel Mizellen und DDM
- Bereiten einzelnen Mizellen und DDM, wie in Abschnitt 1. Legen Sie 2,5 ml der Mizellen in einen 3 ml Dialysekassette mit beschriebenein Molekulargewicht-Cut-off (MWCO) von 7.000 g / mol.
ANMERKUNG: Diese MWCO wurde gewählt, um das freie Arzneimittel (n) zusammen mit den nicht-assoziierten Polymermoleküle zu ermöglichen, sich frei aus der Kassette diffundieren und dadurch sicherzustellen Sinkbedingungen. - Legen Sie die Kassetten in 2,5 l 10 mM pH 7,4 Phosphatpuffer (durch Verdünnen Lager 200 mM Lösung hergestellt), und ändern Sie den Puffer alle 3 Stunden, um Sink-Bedingungen zu gewährleisten. Aufrechterhaltung der Temperatur des Puffers bei 37 ° C während der gesamten Dauer des Experiments.
- Bei 0, 0,5, 1, 2, 3, 6, 9, 12, 24 und 48 Stunden, zurückzutreten 150 ul der Lösung in den Kassetten und ersetzen mit 150 ul frischem Puffer.
- Analysieren Sie die Proben unter Verwendung von RP-HPLC, wie in Kapitel 2 festgelegt, um die Arzneimittelkonzentration zu bestimmen. Kurvenanpassung die Drug (s) Release-Daten auf der Basis einer einfachen Diffusionsmodell mit einer Phase exponentiellen Verband mit stastitical Software.
- Berechnet die benötigte Zeit, bis 50% Wirkstofffreisetzung erreicht (t 1/2) each Medikament in einzelnen Mizellen oder DDM basierend auf der Kurvenanpassung. Führen Sie alle Messungen in Vierergruppe.
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Representative Results
Einzelne DTX oder EVR Mizellen und DTX und EVR DDM in PEG-b -PLA Mizellen erfolgreich entweder in PEG 4000 formuliert - b -PLA 2200 oder PEG 2000 - b -PLA 1800 (Abbildung 1).
DTX EVR und DDM zeigten ähnliche Stabilität in PEG 4000 - b -PLA 2200 oder PEG 2000 - b -PLA 1800 über 48 Stunden (Abbildung 2). Anfängliche Wirkstoffbeladung der EVR in PEG 4000 - 2200 und b -PLA PEG 2000 - b -PLA 1800 1,86 und 1,87 mg / ml. Während erste DTX Belastung in PEG 4000 - b -PLA 2200 und in PEG 2000 - b -PLA 1800 1,85 und 1,78 mg / ml. Die anfängliche Belastung beider DTX EVR in DDM Mizellen unter Verwendung jedes der Polymere ist ähnlich einzelnen Mizellen. Alle Micellen gehalten 97% oder mehr des anfänglichen Ladenach 48 h bei Raumtemperatur.
Mizellengröße durch DLS bewertet und basierend auf den Ergebnissen aller Mizellen zeigte eine unimodale Verteilung mit PDI-Werte von weniger als 0,2. Das Z-gemittelte Durchschnittsgrößen für DTX EVR und DDM in PEG 2000 - b -PLA 1800 etwa 18,05 ± 0,06 nm (PDI = 0,079 ± 0,013), während bei den PEG-4000 - b -PLA 2200 und die Größe ist ungefähr 34,09 ± 0,24 nm (PDI = 0,137 ± 0,004) (Abbildung 3).
Für EVR Mizellen oder DDM und PEG 2000 b -PLA 2200 - - für die DTX Mizellen b -PLA 1800 bis den Nutzen der mit beiden Polymeren die Freisetzungsversuche werden mit PEG 4000 durchgeführt zu vertreten. Die in vitro-Arzneistoff (en) Wirkstoff-Freisetzung in Puffer pH 7,4 bei 37 ° C durch Dialyse unter Sink-Bedingungen für 48 Stunden beurteilt. Basierend auf den Daten, DTX-Freisetzung aus einzelnen Mizellen und DDM ist ca.oximately 60% über 48 Stunden (Abbildung 4). EVR-Freisetzung aus einzelnen Mizellen und DDM betrug 60% bzw. 50% (Abbildung 4). Die t 1/2 für jedes Medikament aus einzelnen Mizellen und DDM und die Güte der Anpassung Daten werden in Tabelle 2 dargestellt. Die Güte der Kurvenanpassung (r 2) für alle Mizellen außer EVR einzelnen Mizellen liegt über 0.950, die, dass die Übernahme bedeutet, erster Ordnung Mitteilung ist eine gute Annäherung an Wirkstofffreisetzung aus einzelnen Mizellen und DDM erklären.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der einzelnen DTX oder EVR PEG-b- PLA Mizellen und DDM mit DTX und EVR geladen.
Figur 2:Drug (s) Laden und Stabilität des DTX und EVR einzelnen Mizellen und DDM in PEG 2000 - b -PLA 1800 (A) oder PEG 4000 - b -PLA 2200 (B). Die Wirkstoffkonzentration in den Mizellen durch RP-HPLC bei 0, 24 und 48 Stunden quantifiziert. Als Mittelwert ± SD von drei Läufen dargestellten Daten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Individuelle Mizellen und DDM Größenbestimmung DLS in PEG 2000 - b -PLA 1800 (A) oder PEG 4000 - b -PLA 2200 (B). Das Mizellengröße durch dynamische Lichtstreuung ermittelt. Daten dargestellt ist ein Vertreter der Verteilung für Ter einzelnen Mizellen und DDM in den beiden Polymeren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Drug (e) Veröffentlichung von DTX (A) und EVR (B) aus einzelnen Mizellen und DDM (C). Wirkstofffreisetzungsstudien werden durch Dialyse und unter Sink-Bedingungen durchgeführt, wobei die Temperatur, wenn das System bei 37 ° C. Die vorgestellten Daten sind mittlere Arzneimittelfreisetzung ± SD von 4 Wiederholungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Micelle | t 1/2 (hr) | r 2 |
| DTX | 10 | 0,986 |
| EVR | 35 | 0.82 |
| DDM | DTX - 8.86 | DTX - 0,987 |
| EVR - 48 | EVR - 0,955 |
Tabelle 2: Die Zeit, die 50% Wirkstoff-Freisetzung (t 1/2) und Güte des Kurvenanpassung (r 2) von in-vitro-Freisetzung Studie erforderlich.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PEG2000-b-PLA1800 | Advanced Polymer Materials, Inc | 6-01- PLA/2000 | PLA MW can be specified on ordering |
| PEG4000-b-PLA2200 | Advanced Polymer Materials, Inc | 6-01- PLA/4000 | PLA MW can be specified on ordering |
| Docetaxel | LC Laboratories | D-1000 | 100 mg |
| Everolimus | LC Laboratories | E-4040 | 100 mg |
| Acetonitrile | EMD/VWR | EM-AX0145-1 | HPLC grade; 4 L |
| Round bottom flask | Glassco/VWR | 89426-496 | 5 ml |
| RV 10 Control Rotary Evaporators | IKA Works | 8025001 | Rotoevaporator |
| Shimadzhu HPLC with DAD detector | Shimadzhu | RP-HPLC | |
| Slide-a-lyzer dialysis casette MWCO 7000 | Thermo Scientific, Inc | 66370 | 3 ml |
| Phosphate buffer pH 7.4, 200 mM | VWR | 100190-870 | 500 ml |
| Malvern NanoZS | Malvern Instruments, UK | DLS | |
| Nylon filter | Acrodisc/VWR | 28143-242 | 13 mm; 0.2µM |
| Phosphoric acid, NF | Spectrum Chemical/VWR | 700000-626 | 100 ml |
| GraphPad Prism | www.graphpad.com | Analysis software | |
| Zorbax SB-C8 Rapid Resolution cartridge | Agilent Technologies | 866953-906 | 4.6 ×75 mm, 3.5 μm |
References
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