Abstract
Copolímeros en bloque anfifílicos como bloque polyethyleneglycol- ácido -polylactic (PEG-b-PLA) se auto-ensamblan en micelas por encima de su concentración micelar crítica forman núcleos hidrofóbicos rodeadas de conchas hidrófilas en medios acuosos. El núcleo de estas micelas puede ser utilizado para cargar fármacos hidrófobos, mal solubles en agua como docetaxel (DTX) y everolimus (EVR). Caracterización sistemática de las capacidades de la estructura micelar y carga de drogas son importantes antes de in vitro e in vivo puede ser llevado a cabo. El objetivo del protocolo descrito en este documento es proporcionar los pasos de caracterización necesarias para lograr productos micelares estandarizados. DTX y EVR tienen solubilidades intrínsecas de 1,9 y 9,6 g / ml, respectivamente Preparación de estas micelas puede lograrse mediante colada en disolvente que aumenta la solubilidad acuosa de DTX y EVR a 1,86 y 1,85 mg / ml, respectivamente. Estabilidad del fármaco en micelas evaluated a temperatura ambiente durante 48 hr indica que el 97% o más de los fármacos se mantienen en solución. Tamaño de micelas se evaluó mediante dispersión de luz dinámica e indicó que el tamaño de estas micelas estaba por debajo de 50 nm y dependía del peso molecular del polímero. La liberación del fármaco a partir de las micelas se evaluó mediante diálisis en condiciones de inmersión a pH 7,4 a 37 ° C durante 48 hr. Resultados de ajuste de curvas indican que la liberación del fármaco es impulsado por un proceso de primer orden que indica que está impulsado difusión.
Introduction
Copolímeros en bloque anfifílicos con estructura repitiendo compuestas de dominios hidrófilos e hidrófobos pueden espontáneamente auto-ensamblan para formar tres asambleas macromoleculares tridimensionales conocidos como micelas poliméricas. Estas estructuras tienen un núcleo hidrófobo interior rodeado por una envoltura hidrofílica. El núcleo hidrófobo tiene la capacidad de incorporar fármacos hidrofóbicos, ya sea por atrapamiento físico a través de interacciones hidrófobas o por conjugación química a la cadena principal del polímero. 1 existir muchas ventajas de utilizar estos copolímeros de bloques para formar micelas para la administración de fármacos. Estos incluyen la incorporación de fármacos poco solubles, mejorando farmacocinética de los fármacos incorporados, y la biocompatibilidad y / o de biodegradabilidad de los polímeros los hace una alternativa segura a solubilizantes convencionales. 2 Otra ventaja de usar micelas poliméricas es su tamaño de partícula coloidal, entre 15- 150 nm 3, que las hace atractivas para los paentrega renteral. Por lo tanto, en los últimos 20 años micelas poliméricas han surgido como sistemas de administración de fármacos viables para fármacos poco solubles en agua, especialmente para la terapia del cáncer. 3,4
Actualmente hay cinco formulaciones micelares poliméricos para la terapia del cáncer sometidos a ensayos clínicos. 4 Cuatro de las micelas en los ensayos clínicos son copolímeros de dos bloques a base de PEG, mientras que el último es un copolímero de tres bloques que contiene óxido de polietileno. El tamaño de estas micelas varió de 20 nm a 85 nm. La ventaja de usar polímeros basados en PEG es su biocompatibilidad y dependiendo de la segunda bloque también puede ser biodegradable. Nuevos sistemas de administración de fármacos recientemente basados en bloque polyethyleneglycol- ácido -polylactic (PEG- b PLA) micelas poliméricas se han desarrollado para la entrega simultánea de varios medicamentos contra el cáncer. Las micelas de PEG-b-PLA son tanto biocompatible y biodegradable. Estos múltiples fármacos micelas cargadas han mostrado comoynergistic inhibición de diferentes modelos de cáncer en vitro e in vivo 2,5,6 y encajar en el paradigma actual de la utilización de múltiples fármacos en la quimioterapia para prevenir la resistencia y la reducción de la toxicidad. Por lo tanto, hay una gran cantidad de interés en preparar y caracterizar estos sistemas de administración de fármacos micelares para su uso en el cáncer y otros estados de enfermedad.
En el trabajo a continuación hemos esbozado un proceso paso a paso por el cual dichas micelas pueden ser preparados y caracterizados antes de evaluar en estados patológicos de interés. Para el propósito de este trabajo dos agentes contra el cáncer poco solubles, docetaxel (DTX) y everolimus (EVR) se han elegido. Tanto DTX y EVR son compuestos poco solubles en agua con solubilidades intrínsecas de agua en el 1,9 y 9,6 mg / ml, respectivamente. 7,8 Dos PEG-polímeros b -pla con diferentes pesos moleculares se utilizaron en este protocolo como los bloques de construcción para la polimérico formulado micelas,estos polímeros son PEG 2000 - b PLA 1800 (3800 Da) y PEG 4000 - b PLA 2200 (6200 Da). Por lo tanto, PEG-micelas b -pla pueden proporcionar una plataforma única como nanotransportador para DTX y EVR individualmente y en combinación. Los Reactivos / Materiales y equipos requeridos necesarios para preparar y caracterizar estas micelas se enumeran en la Tabla 1.
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Protocol
1. Preparación de individuales y de múltiples drogas micelas cargadas por medio de fusión solvente
- Pesar DTX 1 mg o EVR 1 mg o ambos fármacos a 1 mg cada una de las micelas duales de drogas (DDM).
- Pesar 15 mg de PEG 2000 - b PLA 1800 o PEG 4000 - b PLA 2200, ya sea individual o de DDM.
- Disolver los fármacos / drogas y el polímero en 0,5 ml de acetonitrilo y el lugar en un matraz de fondo redondo de 5 ml.
- Formar una película de polímero de drogas distribuido delgada por evaporación de la (s) solución de acetonitrilo -polymer droga bajo presión reducida usando un evaporador rotatorio. Ajuste el evaporador rotatorio a 100 rpm, la temperatura del baño de agua de 40 ° C y una presión de vacío de 260 mbar durante 5 min seguido de una reducción a 100 mbar durante 3 min más.
- Rehidratar la película de polímero de droga con 0,5 ml de agua desionizada a 50 ° C y agitar suavemente el frasco para formar las micelas.
- Filtrar el resultadoing solución micelar a través de un filtro de nylon de 0,2 micras para eliminar cualquier fármaco o contaminantes no-disuelto en un tubo de 1,5 ml de centrífuga.
2. Evaluación de la carga de fármaco y la estabilidad en micelas Usando inversa fase cromatografía líquida de alta resolución (CLAR)
- Realizar análisis de RP-HPLC con una columna C8 equilibriated a 40 ° C en un modo isocrático con una fase móvil de acetonitrilo / agua (62/38) que contiene ácido fosfórico 0,1% y 1% de metanol a una velocidad de flujo de 1 ml / min y un volumen de inyección de 10 microlitros.
- Diluir micelas recién preparados (sección 1) 1: 100 en fase móvil antes de analizar por RP-HPLC para determinar la carga inicial de drogas. Tienda micelas individuales sin diluir y DDM a temperatura ambiente (25 ° C) durante 48 horas y se preparan frescas 1: 100 muestras diluidas en fase móvil para volver a evaluar por RP-HPLC y determinar fármaco (s) la estabilidad de las micelas de más de 24 horas.
- Monitorear DTX y EVR picos a 227 y 279 nm, respectivamentecon tiempos de retención de 1,7 y 5,7 min, respectivamente. Realizar todas las mediciones por triplicado. Los datos actuales como la carga media ± SD de drogas.
3. Evaluación de las partículas de micelas Tamaño por Dynamic Light Scattering (DLS)
- Diluir micelas recién preparado (como se describe en la sección 1) en agua desionizada en una proporción de 1:20 para dar una concentración final de polímero de 1,5 mg / ml.
- Medir la intensidad de láser de He-Ne (633 nm) a 173 ° para determinar la dispersión. Llevar a cabo todas las mediciones a 25 ° C después de pre-equilibrado durante 2 min.
- Realizar todas las mediciones por triplicado. Los datos se presentan como el tamaño medio Z de la media ± SD junto con el índice de polidispersidad (PDI) de la distribución.
4. Evaluación de In Vitro Drogas lanzamiento de micelas individuales y DDM
- Preparar micelas individuales y DDM, como se describe en el apartado 1. Cargue 2,5 ml de las micelas en un casete de 3 ml de diálisis conuna línea de corte de peso molecular (MWCO) de 7.000 g / mol.
NOTA: Este MWCO fue elegido para permitir que el fármaco libre (s), junto con las moléculas de polímero no asociados a difundirse libremente fuera de la casete y con ello garantizar condiciones de inmersión. - Coloque los cassettes en 2.5 L de 10 mM pH 7,4 tampón de fosfato (preparada por dilución de solución madre 200 mM) y cambiar el tampón cada 3 horas para asegurar condiciones de inmersión. Mantener la temperatura del tampón a 37 ° C durante toda la duración del experimento.
- A 0, 0,5, 1, 2, 3, 6, 9, 12, 24, y 48 hr, retirar 150 ml de la solución en los cassettes y reemplazar con 150 l de tampón fresco.
- Analizar las muestras usando RP-HPLC según lo establecido en el apartado 2 para determinar la concentración del fármaco. Curva-ajusta a los datos de liberación del fármaco (s) sobre la base de un modelo de difusión simple con una fase de asociación exponencial el uso de software stastitical.
- Calcule el tiempo necesario para alcanzar el 50% de la liberación del fármaco (t 1/2) de la edrogas ada en micelas o DDM individuales en base a la curva de ajuste. Realizar todas las mediciones de cuatrillizos.
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Representative Results
DTX individual o micelas EVR y DTX y EVR DDM en PEG-b PLA micelas se formulan con éxito en cualquiera de PEG 4000 - b PLA 2200 o PEG 2000 - b PLA 1800 (Figura 1).
DTX, EVR, y el DDM mostraron una estabilidad similar en PEG 4000 - b PLA 2200 o PEG 2000 - b PLA 1800 más de 48 horas (Figura 2). Carga de fármaco inicial de EVR en PEG 4000 - b PLA 2200 y PEG 2000 - b PLA 1800 es 1,86 y 1,87 mg / ml, respectivamente. Mientras carga DTX inicial en PEG 4000 - b PLA 2200 y en PEG 2000 - b PLA 1800 es 1,85 y 1,78 mg / ml. La carga inicial de ambos DTX y EVR en micelas DDM utilizando cada uno de los polímeros es similar a micelas individuales. Todas las micelas retenidas 97% o más de la carga inicialen 48 hr a temperatura ambiente.
Tamaño de micelas se evalúa mediante DLS y se basa en los resultados todas las micelas mostraron una distribución unimodal con valores de PDI de menos de 0,2. Los tamaños medios-z promedio de DTX, EVR y DDM en PEG 2000 - b PLA 1800 es de aproximadamente 18,05 ± 0,06 nm (PDI = 0,079 ± 0,013), mientras que en el PEG 4000 - b PLA 2200 el tamaño es de aproximadamente 34,09 ± 0,24 nm (PDI = 0,137 ± 0,004) (Figura 3).
Para representar la utilidad de usar ambos polímeros los experimentos de liberación se realizan utilizando PEG 4.000 - 2.200 b PLA para micelas EVR o DDM y PEG 2.000 - 1.800 b PLA para las micelas DTX. El fármaco in vitro (s) de liberación de micelas se evalúa en tampón de pH 7,4 a 37 ° C por diálisis en condiciones de inmersión durante 48 horas. Basándose en los datos, la liberación de DTX micelas individuales y DDM es aproxoximately 60% durante 48 hr (Figura 4). EVR liberación de micelas individuales y DDM fue 60% y 50% respectivamente (Figura 4). El t media para cada fármaco a partir de micelas individuales y DDM y la bondad de ajuste de datos se presenta en la Tabla 2. La bondad de ajuste de curvas (r 2) para todas las micelas excepto EVR micelas individuales está por encima de 0.950 lo que significa que la suposición de la liberación de primer orden es una buena aproximación para explicar la liberación del fármaco a partir de micelas individuales y DDM.
Figura 1: Representación esquemática de DTX individuo o EVR PEG-b-PLA micelas y DDM cargado de DTX y EVR.
Figura 2:Medicamentos (s) de carga y estabilidad de DTX y EVR micelas individuales y DDM en PEG 2000 - b PLA 1800 (A) o PEG 4000 - b PLA 2200 (B). La concentración de fármaco en las micelas se cuantifica mediante RP-HPLC a 0, 24, y 48 hr. Los datos representan como media ± desviación estándar de carreras por triplicado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: micela individual y determinación del tamaño de DDM por DLS en PEG 2.000 - 1.800 b PLA (A) o PEG 4.000 - 2.200 b PLA (B). El tamaño micelar se evalúa por Dynamic Light Scattering. Los datos que se presenta es un representante de la distribución de tél micelas individuales y DDM en los dos polímeros. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: fármaco (s) liberación de DTX (A) y EVR (B) a partir de micelas individuales y DDM (C). Estudios de liberación de drogas se llevan a cabo mediante diálisis y en condiciones de inmersión manteniendo la temperatura si el sistema a 37 ° C. Los datos presentados es Mean Drogas lanzamiento ± SD de 4 repeticiones. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Micelle | t 1/2 (h) | r 2 |
| DTX | 10 | 0,986 |
| EVR | 35 | 0.82 |
| DDM | DTX - 8.86 | DTX - 0.987 |
| EVR - 48 | EVR - 0.955 |
Tabla 2: El tiempo necesario para la liberación del 50% de fármaco (t 1/2) y la bondad de ajuste de curvas (r 2) de estudio in vitro de liberación.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PEG2000-b-PLA1800 | Advanced Polymer Materials, Inc | 6-01- PLA/2000 | PLA MW can be specified on ordering |
| PEG4000-b-PLA2200 | Advanced Polymer Materials, Inc | 6-01- PLA/4000 | PLA MW can be specified on ordering |
| Docetaxel | LC Laboratories | D-1000 | 100 mg |
| Everolimus | LC Laboratories | E-4040 | 100 mg |
| Acetonitrile | EMD/VWR | EM-AX0145-1 | HPLC grade; 4 L |
| Round bottom flask | Glassco/VWR | 89426-496 | 5 ml |
| RV 10 Control Rotary Evaporators | IKA Works | 8025001 | Rotoevaporator |
| Shimadzhu HPLC with DAD detector | Shimadzhu | RP-HPLC | |
| Slide-a-lyzer dialysis casette MWCO 7000 | Thermo Scientific, Inc | 66370 | 3 ml |
| Phosphate buffer pH 7.4, 200 mM | VWR | 100190-870 | 500 ml |
| Malvern NanoZS | Malvern Instruments, UK | DLS | |
| Nylon filter | Acrodisc/VWR | 28143-242 | 13 mm; 0.2µM |
| Phosphoric acid, NF | Spectrum Chemical/VWR | 700000-626 | 100 ml |
| GraphPad Prism | www.graphpad.com | Analysis software | |
| Zorbax SB-C8 Rapid Resolution cartridge | Agilent Technologies | 866953-906 | 4.6 ×75 mm, 3.5 μm |
References
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