We demonstrate the fabrication, calibration and properties of two types of ion-selective microelectrodes (double-barreled and concentric) for measurement of ion concentrations in brain tissue. These are then used in the mouse hippocampal slice preparation to show that excitatory activity changes both extracellular potassium and sodium concentrations.
Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular concentration of all major ions. As these ion shifts bear significant functional consequences, their quantitative determination is often required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. In the present study, we demonstrate the fabrication and calibration of double-barreled ion-selective microelectrodes, which have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue. Moreover, so-called “concentric” ion-selective microelectrodes are also described, which, based on their different design, offer a far better temporal resolution of fast ion changes. We then show how these electrodes can be employed in acute brain slice preparations of the mouse hippocampus. Using double-barreled, potassium-selective microelectrodes, changes in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in response to exogenous application of glutamate receptor agonists or during epileptiform activity are demonstrated. Furthermore, we illustrate the response characteristics of sodium-sensitive, double-barreled and concentric electrodes and compare their detection of changes in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) evoked by bath or pressure application of drugs. These measurements show that while response amplitudes are similar, the concentric sodium microelectrodes display a superior signal-to-noise ratio and response time as compared to the double-barreled design. Generally, the demonstrated procedures will be easily transferable to measurement of other ions species, including pH or calcium, and will also be applicable to other preparations.
Electrical signaling in the brain is based on the flux of ions across plasma membranes. Major ion movements into and from the extracellular space are not only mediated by passage through voltage-gated ion channels, but also by postsynaptic ionotropic receptors as well as ion transporters. Neuronal activity is thus accompanied by complex changes in the extracellular concentration of all major ions 1. For example, influx of sodium into neurons during excitatory activity has been shown to result in a decrease in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) 2. The same holds true for the extracellular calcium concentration because calcium ions rapidly enter both pre- and postsynaptic structures 3. At the same time, potassium moves the opposite way and this mediates an increase in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in the low mM range 4,5. Synaptic activity also causes changes in extracellular pH that are partly mitigated by concomitant glial membrane fluxes that change intraglial pH 6,7. These activity-related changes in extracellular ion concentrations have significant functional consequences. For example, even small increases in [K+]o depolarize neurons as well as glial cells thereby altering neuronal excitability, and several mechanisms exist to remove excess potassium 8. Failure of these may result in epileptiform activity of neurons or phenomena like spreading depression 1.
Because of their critical importance, quantitative determination of extracellular ion concentrations is often necessary and required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. For decades, double-barreled ion-selective microelectrodes have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue 9. For many ions, highly specific sensors with low cross-reactivity for other ions are available. In addition to the classical double-barreled electrodes, so-called concentric electrodes were recently introduced. The latter provide a superior time resolution, but take a little more time and effort to construct 10.
In the following, we will describe the preparation and calibration of these two types of ion-selective microelectrodes. We then show how these electrodes can be employed in brain slice preparations for measurement of changes in [K+]o or [Na+]o induced by excitatory activity following different stimulation paradigms including bath and pressure application of drugs.
Vätske carrier-baserade, jonselektiva elektroder har framgångsrikt använts i årtionden och för många joner, mycket specifika sensorer finns 22-26. Vid användning i det extracellulära utrymmet (ECS) av ryggradsdjur hjärnan preparat, måste man ha i åtanke är dock att detta är en ganska invasiv teknik: medan bredden på ECS är endast cirka 20-50 nm, diameter jonselektiva microelectrodes är cirka 1 pm (dubbelpipiga elektroder) eller större (koncentriska elektroder). Spetsarna på jonselektiva mikroelektroder kommer således inte bara skada vävnaden under impalement av vävnaden, men också förstora ECS, som främjar en underskattning av jon transienter. Trots dessa fallgropar, extracellulära jon transienter som svar på nervaktivitet är anmärkningsvärt konsekvent mellan olika laboratorier 7,8, styrker tillförlitligheten av denna metod.
Prestandan och lämplighet jonselektiva elektroderär beroende av deras känslighet och selektivitet, som definieras av sensor cocktail ("vätskemembran jonofor") som används. Sensor drinkar innehåller en speciell bärarmolekyl, t.ex. valinomycin för K + -selektiv mikroelektroder som uppvisar en hög selektivitet för kalium 27. Trots detta kan korsreaktivitet med andra joner förekommer och måste testas. Valinomycin uppvisar en signifikant korsreaktivitet för ammonium, som måste beaktas vid tolkning av resultaten (t.ex. 11,12). Vidare eftersom spänningen-svaret hos jonoforer följer en Nernstian beteende (jfr ekvation 1), signal-till-brusförhållande och tröskeldetektering beror på koncentrationen av jonen, som skall mätas. Således, medan små [K +] o transienter framkalla stora spänningsändringar mot låga baslinjen [K +] o, liten [Na +] o transienter är mycket svårare att upptäcka mot high baslinjen [Na +] o (se Figur 5 och 6).
Utförandet av jonselektiva elektroder bestäms också av tidsupplösning, som till stor del styrs av den elektriska tidskonstant. Den senare bestäms huvudsakligen av den axiella resistansen hos sensorn, och av den fördelade kapacitansen längs längden av pipetten, mellan sina interna lösningar och det yttre fluidumet. I den dubbelpipiga konfiguration, är resistansen hög, på grund av den lång kolonn av återfyllt jonsensor. För ett givet isolerande dielektrikum (i detta fall borsilikatglas), är kapacitansen styrs av den dielektriska tjocklek. I dubbelpipiga elektroder, uppgår den dielektriska bredd till glasväggen av pipetten. Som glaset tunnar nära spetsen, faller den dielektriska bredd, och kapacitansen ökar. Dessa faktorer samverkar för att producera elektroder med svarstider som sträcker sig från flera hundra millisekunder till flerasekunder, eftersom dessa faktorer är varierande.
En stor fördel med den koncentriska utformning är att såväl den axiella motståndet och kapacitansen till badet är kraftigt minskat. De koncentriska pipett shuntar de flesta av resistansen av den återfyllda jonbytare, vilket innebär att endast en kvarleva i de sista få mikrometer före spetsen. Dessutom är fyll lösning inom den koncentriska pipetten fysiskt distanserade från badet, åtskilda av tjockleken av två glasväggar, vilket kraftigt minskar kapacitansen. Som framgått tidigare 10, är den kombinerade effekten av minskad resistans och kapacitans en förbättring av tidsupplösning av två storleksordningar. I fallet med koncentriska Ca2 + och pH-mikroelektroder, 90% svarstider var så låg som 10 till 20 ms 10. En besläktad fördel med den koncentriska utformningen är den lägre brusnivå (se Figur 8). På grund av den kraftigt minskad motståndskraft, spänningstransienter från någon Ambient buller minimeras. Dessutom är återhämtning från sådana transienter snabb, på grund av den snabba tidskonstanten. Sådana artefakter är därför liten och snabb och har en mindre störande effekt på fysiologiska inspelningar (se Figur 8).
Det finns också nackdelar med den koncentriska teknik. För det första är deras montering mer komplex och tidskrävande. En andra nackdel är behovet att placera en separat referensmikroelektrod med sin spets, vilket innebär användning av antingen ett separat mikromanipulator eller en specialiserad dubbel manipulator. Slutligen kan dubbelpipiga microelectrodes utökas till en trippel pipa design, möjliggör detektion av två olika jonslag samtidigt 28, vilket inte är möjligt för koncentriska elektroder.
Vanligaste fallgropar
Ineffektiv silanisering.
Det viktigaste steget, och främsta hindret i tillverkning av alla vätske-senseller baserade jonselektiva mikro är silaniseringen förfarandet. När elektroderna inte svarar på förändringar i specifik jonkoncentration, eller svara med en sub-Nernstian respons (dvs väl mindre än 58 mV per tiofaldig skillnad koncentration), är dålig effekt av silanisering typiskt orsaken. I vår erfarenhet, kan detta inträffa om luftfuktigheten är för hög eller för låg, typiskt förhållanden på höjden av sommaren, eller vintern, respektive. Om det är möjligt att utöva en viss kontroll över rumsfuktighet, kan dessa problem övervinnas.
Elektrod resistansen är för hög.
Vid behov kan resistansen hos jonkänsliga fat minskas genom fasning. För detta ändamål utsätter dess spets till en stark stråle av ett slipmedel suspenderat i vatten i ett par sekunder. Detta kommer att orsaka dess översta spets för att bryta och sänka motståndet till det önskade värdet.
Saltbryggor.
Saltbroar mellan jon och referens fat leder till dåligt eller ingen-svarande elektroderna och kan därmed också kraftigt förvirra sina resultat i kalibreringen. Som nämnts ovan (se punkt 1.6.), Är detta främst en fråga när dubbelpipiga theta glas väljs, men är en sällsynt företeelse när du använder offset, vridna fat teknik som beskrivs här.
Med enkel tillverkning i åtanke, kan ofta användas den ursprungliga dubbelpipiga utformning av Lux 29 lönsamt. Denna metod använder pre-fyllning av jon och referens fat med saltlösningar, en snabb exponering för en silanlösning genom sin sug och utvisning från spetsen, följt av inkorporering av jonbytare, även via spetsen (se 30,31) . Dessa elektroder kan tillverkas på ungefär 10 minuter, men deras spetsstorlek är typiskt 4 um eller mer och de är mer benägna att misslyckas under ett experiment. I motsats till metoder som silaniseringen innebär exponering för silanånga och värmeIng kan producera elektroder med mindre tips som varar dagar och ibland veckor.
Sammantaget finns det flera protokoll och metoder om hur du förbereder jonselektiva microelectrodes. Här har vi beskrivit två huvudsakliga förfaranden för tillverkning av tvinnade dubbelpipiga samt koncentriska mikroelektroder som fungerar bra och tillförlitligt i våra laboratorier, med en total framgång på nära 100%. Viktigare, kommer dessa tekniker kunna överlåtas till mätning av andra joner arter, däribland pH eller kalcium, och kommer också att kunna tillämpas på andra beredningar än i hjärnan, inklusive vätskefyllda hålrum eller vätskor i allmänhet. Sist men inte minst, jonselektiva microelectrodes tillåter bestämning av jonkoncentrationer inuti celler. På grund av deras relativt stora spetsstorlek (~ 1 pm), detta kommer dock att vara möjligt endast i celler med en stor cellkroppen, t.ex. sådana som finns i ryggradslösa preparat 28,32.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka C. Roderigo för teknisk experthjälp. Vi tackar S. Köhler (Center of Advanced Imaging, Heinrich Heine-universitetet Düsseldorf) för att få hjälp i videoproduktion. Forskning i författarens laboratorium har finansierats av det tyska Research Association (DFG: Ro 2327 / 8-1 till CRR), Heinrich Heine-universitetet Düsseldorf (NH) och National Institutes of Health bevilja R01NS032123 (till MC).
Abrasive | MicroPolish | Buehler GmbH | Dissolved in A.dest |
Borosilicate-glass capillaries | 1405059 | Hilgenberg | Application pipette; 75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm |
Borosilicate glass capillaries with filament | GC 150 F-15 | Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus | For the sensor of double-barreled microelectrodes |
Borosilicate glass capillaries with filament | GC100-F-15 | Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus | For the reference of double-barreled microelectrodes |
Borosilicate glass capillaries with filament | GB-200TF-15 | Science Products | Concentric, outer channel. o.d. 2.0 mm |
Borosilicate glass capillaries with filament | GB-120TF-10 | Science Products | Concentric, inner channel. o.d. 1.2 mm |
Digidata | 1322A | Axon Instruments | |
Electrometer amplifier with headstage | Custom-made | Rin = 10TΩ and Ibias=50fA-1pA (commercially available alternatives: e. g. Dagan IX2-700, with headstage (10 Gig feedback resistor) or EPMS-07, NPI, Tamm, Germany) | |
Experimental chamber | Custom-made | Commercially available from e.g. Warner Instruments,USA; Scientifica, UK | |
Furnace | Heraeus | Must stay constant at 200°C | |
Hard sticky wax / dental wax | Deiberit 502 | Siladent Dr. Boehme & Schoeps GmbH | |
Hot plate | Custom-made | Must stay constant at 40°C | |
Microelectrodes holder made of plexiglas | Custom-made | Double-barreled: o.d. capillaries 1.5 mm, concentric: o.d. capillaries 2 mm | |
Micromanipulator | Leitz | ||
Micromanipulator | MD4R | Leica | |
Stereo microscope | M205C | Leica | |
Objective | Plan 0.8xLWD | Leica | |
Pipette puller | Model PP-830 | Narishige | Concentric microelectrodes |
Pipette puller | Model P-97 | Sutter Instruments | Sensor of concentric microelectrodes |
Pneumatic drug ejection system | Picospritzter Type II | General Valve TM Corporation | |
Travel dovetail stage | DT 25/M | Thorlabs | |
Two-component glue | Araldite | Huntsman advanced materials GmbH | One may also use a small stripe of aluminum foil to stick the capillaries together |
Silverwire | 99.9% | Wieland Edelmetalle | |
Slicer / Vibratome | Microm HM 650 V | Thermo Scientific | |
Software | AxoScope 8.1 | Axon Instruments | |
Vertical puller | Type PE-2 | Narishige Scientific Instruments | With a revolvable chuck for double-barreled microelectrodes |
x/y translational stage | Custom-made | ||
Name of Compound | Company | Catalog Number | Comments/Description |
1(S),9(R)-(−)-Bicuculline methiodide | Sigma aldrich | 14343 | Competitive antagonist of GABAA receptors (light-sensitive); CAUTION toxic |
CNQX | Sigma aldrich | C-127 | AMPA/kainate receptor antagonist; CAUTION toxic |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma aldrich | D5879 | |
DL-AP5 | Alfa Aesar | J64210 | NMDA receptor antagonist; CAUTION toxic |
Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma aldrich | 440191 | CAUTION: Flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) and corrosive to metals and skin |
L-Aspartic acid | Sigma aldrich | A9256 | Activates NMDA and non-NMDA and EAATs |
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma aldrich | G1626 | Activates NMDA-R, AMPA-R, QA-R and KA-R), mGluRs and EAATs |
Potassium ionophore I – cocktail B | Fluka | 60403 | Based on valinomycin; CAUTION toxic |
Sodium ionophore II – cocktail A | Fluka | 71178 | Based on ETH 157 |
TTX | Ascent Scientific | Asc-055 | Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION toxic |
Water, ultra pure | Sigma aldrich | W3500 |