We demonstrate the fabrication, calibration and properties of two types of ion-selective microelectrodes (double-barreled and concentric) for measurement of ion concentrations in brain tissue. These are then used in the mouse hippocampal slice preparation to show that excitatory activity changes both extracellular potassium and sodium concentrations.
Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular concentration of all major ions. As these ion shifts bear significant functional consequences, their quantitative determination is often required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. In the present study, we demonstrate the fabrication and calibration of double-barreled ion-selective microelectrodes, which have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue. Moreover, so-called “concentric” ion-selective microelectrodes are also described, which, based on their different design, offer a far better temporal resolution of fast ion changes. We then show how these electrodes can be employed in acute brain slice preparations of the mouse hippocampus. Using double-barreled, potassium-selective microelectrodes, changes in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in response to exogenous application of glutamate receptor agonists or during epileptiform activity are demonstrated. Furthermore, we illustrate the response characteristics of sodium-sensitive, double-barreled and concentric electrodes and compare their detection of changes in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) evoked by bath or pressure application of drugs. These measurements show that while response amplitudes are similar, the concentric sodium microelectrodes display a superior signal-to-noise ratio and response time as compared to the double-barreled design. Generally, the demonstrated procedures will be easily transferable to measurement of other ions species, including pH or calcium, and will also be applicable to other preparations.
Electrical signaling in the brain is based on the flux of ions across plasma membranes. Major ion movements into and from the extracellular space are not only mediated by passage through voltage-gated ion channels, but also by postsynaptic ionotropic receptors as well as ion transporters. Neuronal activity is thus accompanied by complex changes in the extracellular concentration of all major ions 1. For example, influx of sodium into neurons during excitatory activity has been shown to result in a decrease in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) 2. The same holds true for the extracellular calcium concentration because calcium ions rapidly enter both pre- and postsynaptic structures 3. At the same time, potassium moves the opposite way and this mediates an increase in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in the low mM range 4,5. Synaptic activity also causes changes in extracellular pH that are partly mitigated by concomitant glial membrane fluxes that change intraglial pH 6,7. These activity-related changes in extracellular ion concentrations have significant functional consequences. For example, even small increases in [K+]o depolarize neurons as well as glial cells thereby altering neuronal excitability, and several mechanisms exist to remove excess potassium 8. Failure of these may result in epileptiform activity of neurons or phenomena like spreading depression 1.
Because of their critical importance, quantitative determination of extracellular ion concentrations is often necessary and required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. For decades, double-barreled ion-selective microelectrodes have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue 9. For many ions, highly specific sensors with low cross-reactivity for other ions are available. In addition to the classical double-barreled electrodes, so-called concentric electrodes were recently introduced. The latter provide a superior time resolution, but take a little more time and effort to construct 10.
In the following, we will describe the preparation and calibration of these two types of ion-selective microelectrodes. We then show how these electrodes can be employed in brain slice preparations for measurement of changes in [K+]o or [Na+]o induced by excitatory activity following different stimulation paradigms including bath and pressure application of drugs.
Flytende bærebølge-basert, har ione-selektive elektroder blitt anvendt i årtier, og for mange ioner, meget spesifikke sensorer er tilgjengelige 22-26. Når den brukes i det ekstracellulære rom (ECS) i virveldyr hjernepreparater, må en huske på, men at dette er en ganske invasiv teknikk: mens bredden på ECS er bare rundt 20-50 nm, diameteren av ion-selektive mikroelektroder er omtrent 1 mikrometer (dobbeltløpet elektroder) eller større (konsentriske elektroder). Tuppen av ioneselektive mikroelektroder vil således ikke bare skade vev under impalement av vevet, men også større ECS, favoriserer en undervurdering av ion-transienter. Til tross for disse fallgruvene, ekstracellulære ion transienter i respons til neuronal aktivitet er bemerkelsesverdig konsistent mellom ulike laboratorier 7,8, attesterer til påliteligheten av denne metoden.
Ytelsen og egnethet ion-selektive elektroderer avhengig av deres følsomhet og selektivitet, som er definert av føleren cocktail («flytende membran ionofor") anvendt. Sensor cocktails inneholde en spesiell bæremolekyl, f.eks valinomycin for K + selektive microelectrodes som viser en høy selektivitet for kalium 27. Likevel kan kryssreaksjon med andre ioner oppstå og må testes. Valinomycin viser en betydelig kryssreaktivitet for ammonium, som må tas i betraktning når man tolker resultatene (f.eks 11,12). Videre, fordi den spenningsresponsen av de ionoforer følger en Nernstian atferd (jfr ligning 1), signal-til-støy-forhold og deteksjonsgrensen er avhengig av konsentrasjonen av det ion som skal måles. Således, mens små [K +] o transienter fremkalle store spenningsendringer mot den lave grunnlinjen [K +] o, liten [Na +] o transienter er mye vanskeligere å oppdage mot high baseline [Na +] o (se figur 5 og 6).
Utførelsen av ioneselektive elektroder blir også bestemt av den tidsmessig oppløsning, som i stor grad styres av den elektriske tidskonstant. Sistnevnte er i hovedsak bestemt av den aksiale motstanden i føleren, og ved den fordelte kapasitans langs lengden av pipetten, mellom de interne løsninger og det eksterne fluidet. I dobbeltløpet konfigurasjon, er motstanden stor, på grunn av den lange kolonne av backfilled ion sensor. For en gitt isolerende dielektrikum (i dette tilfelle borsilikatglass), blir kapasitansen styrt av den dielektriske tykkelsen. I dobbeltløpet elektroder, utgjør det dielektriske bredden til glassveggen av pipetten. Som glasset tynner nær spissen, faller det dielektriske bredde, og kapasitans øker. Disse faktorene kombineres for å fremstille elektroder med responstider som varierer fra flere hundre til flere millisekundersekunder, ettersom disse faktorene er variert.
En stor fordel med den konsentriske konstruksjon er at både den aksielle motstand og kapasitans til badet er sterkt redusert. De konsentriske pipettes shunts fleste av motstanden i backfilled ionebytter, slik at bare en levning i de siste par mikrometer før spissen. I tillegg er fyllingen løsning i løpet av konsentriske pipetten fysisk avstand fra badet, adskilt av tykkelsen av to glassvegger, noe som reduserer kapasitansen. Som vist tidligere 10, den kombinerte effekt av redusert motstand og kapasitans er en forbedring i tidsmessig oppløsning på to størrelsesordener. I tilfelle av konsentriske Ca 2+ og pH-mikroelektroder, 90% responstider var så lav som 10-20 msek 10. En beslektet fordel av den konsentriske konstruksjon er lavere lydnivå (se figur 8). På grunn av den sterkt redusert motstand, spenningstransienter fra en hvilken som helst valiumt støy minimaliseres. Dessuten er utvinningen av slike transienter hurtig, på grunn av den hurtig tidskonstant. Slike gjenstander er derfor liten og rask, og har en mindre forstyrrende effekt på fysiologiske opptak (jf figur 8).
Det er også ulemper ved den konsentriske teknikk. For det første er deres montasje mer komplisert og tidkrevende. En annen ulempe er behovet for å plassere et separat referanse microelectrode med sin spiss, medfører bruk av enten en separat mikromanipulator eller en spesialisert dual manipulator. Endelig kan dobbeltløpet mikroelektroder bli utvidet til en trippel løpet utforming, slik at deteksjon av to forskjellige arter ion samtidig 28, som ikke er mulig for konsentriske elektroder.
De vanligste fallgruvene
Ineffektiv silanisering.
Det viktigste steget, og rektor hinder i fabrikasjon av Flytende-senseller basert ioneselektiv microelectrode er silanisering prosedyre. Når elektrodene unnlater å reagere på endringer i spesifikke ion konsentrasjon, eller reagere med et sub-Nernstian respons (dvs. godt mindre enn 58 mV per ti gangers forskjell konsentrasjon), er dårlig effekt av silanisering vanligvis årsaken. I vår erfaring, kan dette skje hvis luftfuktigheten er for høy eller for lav, typisk for forholdene på høyden av sommeren eller vinteren, henholdsvis. Hvis det er mulig å utøve en viss kontroll over fuktigheten i rommet, kan disse problemene overvinnes.
Elektrode motstanden er for høy.
Om nødvendig kan motstanden av ion-sensitive fat reduseres med avfasing. For dette formål utsettes sin spiss til en sterk stråle av et slipemiddel oppslemmet i vann i et par sekunder. Dette vil føre til at den ytterste spiss for å bryte og lavere motstand til den ønskede verdi.
Salt broer.
Saltbroer mellom ion og referanse fat resultere i dårlig eller ingen kontaktbare elektroder og kan dermed også i stor grad forvirre deres prestasjoner i kalibreringen. Som nevnt ovenfor (se punkt 1.6.), Er dette først og fremst et problem når dobbeltløpet theta glass er valgt, men er en sjelden forekomst når du bruker offset, vridd fat teknikken beskrevet her.
Med enkel fabrikasjon i tankene, kan den opprinnelige dobbeltløpet design av Lux 29 ofte brukes lønnsomt. Denne metoden benytter forhånds fylling av ion og referanse tønner med saltløsninger, en rask eksponering til en silanløsning ved sin suge og utdriving fra spissen, som følge av innlemmelse av ionebytter, også via spissen (se 30,31) . Disse elektroder kan fremstilles i omtrent 10 min, men deres dysestørrelse er typisk 4 um eller mer, og de er mer utsatt for å svikte i løpet av et eksperiment. I motsetning til dette, silanisering metoder som involverer eksponering av silan damp og varmeing kan produsere elektroder med mindre tips som siste dager, og noen ganger uker.
Til sammen er det flere protokoller og tilnærminger på hvordan å forberede ion-selektive mikroelektroder. Her har vi beskrevet to hoved prosedyrer for fabrikasjon av vridde dobbeltløpet samt konsentriske mikroelektroder som fungerer godt og pålitelig i våre laboratorier, med en samlet suksessrate på nær 100%. Viktigere, vil disse teknikkene være overførbar til måling av andre ioner arter, inkludert pH eller kalsium, og vil også være anvendelig for andre preparater enn hjernen, inkludert væskefylte hulrom eller væsker generelt. Sist, men ikke minst, ion-selektive microelectrodes tillater bestemmelse av ionekonsentrasjoner inni cellene. På grunn av sin relativt store størrelse spiss (~ 1 mm), det vil imidlertid være mulig bare i celler med en stor cellelegemet, for eksempel slik som befinner seg i virvelløse preparater 28,32.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke C. Roderigo for sakkyndig teknisk assistanse. Vi takker S. Köhler (Center of Advanced Imaging, Heinrich Heine Universitetet Düsseldorf) for å få hjelp i videoproduksjon. Forskning i forfatterens laboratorium har blitt finansiert av den tyske Research Association (DFG: Ro 2327 / 8-1 til CRR), Heinrich Heine Universitetet Düsseldorf (til NH) og ved National Institutes of Health gi R01NS032123 (til MC).
Abrasive | MicroPolish | Buehler GmbH | Dissolved in A.dest |
Borosilicate-glass capillaries | 1405059 | Hilgenberg | Application pipette; 75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm |
Borosilicate glass capillaries with filament | GC 150 F-15 | Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus | For the sensor of double-barreled microelectrodes |
Borosilicate glass capillaries with filament | GC100-F-15 | Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus | For the reference of double-barreled microelectrodes |
Borosilicate glass capillaries with filament | GB-200TF-15 | Science Products | Concentric, outer channel. o.d. 2.0 mm |
Borosilicate glass capillaries with filament | GB-120TF-10 | Science Products | Concentric, inner channel. o.d. 1.2 mm |
Digidata | 1322A | Axon Instruments | |
Electrometer amplifier with headstage | Custom-made | Rin = 10TΩ and Ibias=50fA-1pA (commercially available alternatives: e. g. Dagan IX2-700, with headstage (10 Gig feedback resistor) or EPMS-07, NPI, Tamm, Germany) | |
Experimental chamber | Custom-made | Commercially available from e.g. Warner Instruments,USA; Scientifica, UK | |
Furnace | Heraeus | Must stay constant at 200°C | |
Hard sticky wax / dental wax | Deiberit 502 | Siladent Dr. Boehme & Schoeps GmbH | |
Hot plate | Custom-made | Must stay constant at 40°C | |
Microelectrodes holder made of plexiglas | Custom-made | Double-barreled: o.d. capillaries 1.5 mm, concentric: o.d. capillaries 2 mm | |
Micromanipulator | Leitz | ||
Micromanipulator | MD4R | Leica | |
Stereo microscope | M205C | Leica | |
Objective | Plan 0.8xLWD | Leica | |
Pipette puller | Model PP-830 | Narishige | Concentric microelectrodes |
Pipette puller | Model P-97 | Sutter Instruments | Sensor of concentric microelectrodes |
Pneumatic drug ejection system | Picospritzter Type II | General Valve TM Corporation | |
Travel dovetail stage | DT 25/M | Thorlabs | |
Two-component glue | Araldite | Huntsman advanced materials GmbH | One may also use a small stripe of aluminum foil to stick the capillaries together |
Silverwire | 99.9% | Wieland Edelmetalle | |
Slicer / Vibratome | Microm HM 650 V | Thermo Scientific | |
Software | AxoScope 8.1 | Axon Instruments | |
Vertical puller | Type PE-2 | Narishige Scientific Instruments | With a revolvable chuck for double-barreled microelectrodes |
x/y translational stage | Custom-made | ||
Name of Compound | Company | Catalog Number | Comments/Description |
1(S),9(R)-(−)-Bicuculline methiodide | Sigma aldrich | 14343 | Competitive antagonist of GABAA receptors (light-sensitive); CAUTION toxic |
CNQX | Sigma aldrich | C-127 | AMPA/kainate receptor antagonist; CAUTION toxic |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma aldrich | D5879 | |
DL-AP5 | Alfa Aesar | J64210 | NMDA receptor antagonist; CAUTION toxic |
Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma aldrich | 440191 | CAUTION: Flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) and corrosive to metals and skin |
L-Aspartic acid | Sigma aldrich | A9256 | Activates NMDA and non-NMDA and EAATs |
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma aldrich | G1626 | Activates NMDA-R, AMPA-R, QA-R and KA-R), mGluRs and EAATs |
Potassium ionophore I – cocktail B | Fluka | 60403 | Based on valinomycin; CAUTION toxic |
Sodium ionophore II – cocktail A | Fluka | 71178 | Based on ETH 157 |
TTX | Ascent Scientific | Asc-055 | Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION toxic |
Water, ultra pure | Sigma aldrich | W3500 |