Abstract
生体顕微鏡は、生きている動物における異なる領域と血管内の異なるプロセスを研究するために使用することができる方法です。このプロトコルでは、我々は腸間膜静脈の生体顕微鏡を説明します。これは、再現性のある結果がインビボで白血球-内皮相互作用を示すと共に、短時間で行うことができます。我々は、内皮細胞のLPSチャレンジ後の炎症の設定について説明します。しかし、このモデルでは1は、細菌の化学的または生物学的のように、炎症性状態の多くの異なる種類を適用し、薬剤の投与と生きている動物に対するその直接効果と白血球動員への影響を調査することができます。このプロトコルは、異なるマウスの処置および血管における炎症反応に及ぼす影響の数に正常に適用されました。ここで、我々は、蛍光ローダミン6Gでこれらを標識することにより、白血球と血小板の可視化について説明します。さらに、特定のイメージングは、PEとすることができます対象となる蛍光標識された分子を用いてrformed。
Introduction
このプロトコルの目的は、炎症状態の下で白血球 - 内皮細胞および白血球、血小板の相互作用を直接観察するために生きているマウスにおける腸間膜静脈の生体内顕微鏡検査の簡略化された手法を記述することです。
生体顕微鏡は、炎症性白血球動員および機能を理解するために些細なしかし重要ではありません炎症状態1,2、下のin vivoでの白血球-内皮相互作用を研究するために開発されました。私たちはこのプロトコルで説明した方法は、以前に公開された刊行物に基づいて開発されました。公開されたものに成長して血栓3に並行して、血小板の取り込みを可視化と同様に、以前の4、体外に腸間膜静脈を透過光顕微鏡で観察されます。例えばラット5やマウスの肝臓およびラット6の精巣挙筋としてイントラ不可欠な顕微鏡の他の様々なモデルがあります。
腸間膜静脈の生体内顕微鏡法が開発され、いくつかのグループによって以前の研究に適用されています。非神経セロトニンの欠損しているマウス、およびその血小板セロトニン薬理学的に長期的により枯渇したマウスとの調査結果を比較して - / - 我々は、野生型マウスとトリプトファンhydroxylase1（TPH1）との間の白血球動員の違いを観察するためにこの技術を使用していますアプリケーション選択的セロトニン再取り込み阻害剤フルオキセチン7。また、急性フルオキセチン処置8後に白血球-内皮相互作用を検討しました。
このプロトコルでは、このモデルは迅速に行うことができるので、腸間膜静脈の生体内顕微鏡検査に焦点を当てて、白血球 - 内皮細胞および血小板 - 白血球の相互作用の有効な測定を可能にします。これは、はるかに困難な、時間のかかる、骨、肝臓、皮膚、または精巣挙筋のような他の臓器の生体内顕微鏡検査です。モードここで説明するlは、このようなリポ多糖の腹腔内注射のような炎症性刺激、とそれをchallengeing後の炎症性細胞間相互作用の再現性の評価に最適です。
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Protocol
全ての動物実験は、ドイツ動物保護法（TierSchG）に準拠して行きました。 FELASA（www.felasa.eu/guidelines.php）と全国動物福祉本体GV-SOLAS条約（www.gv-solas.de/index.html）で定義されているようにマウスが収容され、良好な動物の慣行に従って取り扱われました。フライブルク大学の動物福祉委員会だけでなく、自治体（Regierungspräsidiumフライブルク）は、すべての動物実験を承認しました。
1.動物の取り扱い、準備および炎症の誘導
- 16〜20グラムの重量範囲で6週齢の雄マウス - 4を使用してください。注：マウスは古いまたは重い場合、それらは顕微鏡観察を制限する、血管の周囲の過剰な脂肪を提示します。
- 手術前にすべてのツールと顕微鏡テーブルを滅菌します。
- 注入の20mg / kgのLPS（リポポリサッカライド）を腹腔内4細菌inflammを誘導するために生きているマウスに、顕微鏡の前に時間エーション。
- プラスチック容器および腸間膜組織を加湿するために37℃の水浴中で0.9％食塩水を予熱します。
- 右の顕微鏡の手順の前に腹腔内ケタミンの注射（100mg / kg）およびキシラジン（5mg / kg）でマウスを麻酔。別の麻酔は、 例えば、2％イソフルラン吸入を用いることができます。反射刺激（しっかり圧でつま先やテールピンチ）に対する応答の喪失によって、適切な麻酔を確認してください。
- シェーバーを使用して腹部を脱毛するとエタノール70％で飽和したガーゼで抜け毛を取り除きます。
- 麻酔下にある間、乾燥を防ぐために、マウスの目に獣医軟膏を適用します。
2.手術
- 70％エタノールを用いて腹部を滅菌します。この方法は、滅菌方法ではなく、実験の終了時に致死的である可能性があります。
- 正中開腹術を実行します。小さな、湾曲鉗子と小さなハサミを使用して腹部の皮膚を開きます。エピを特定gastrical血管や血管を保護するために、白線の領域で腹膜を開きます。
- 湿った組織を維持するために腹腔内に予め加温した生理食塩水を数滴を適用します。
- 9,10前に説明したように眼窩50μlのローダミン6G（1mg / ml）を注入することにより、蛍光ラベルの白血球と血小板。
- 直径10cmのペトリ皿にileumandの場所それのループを体外に出すし、37℃を適用することにより、湿った組織を維持することを確認してくださいは、生理食塩水（0.9％）、他のすべての分を予め加温しました。
3.生体顕微鏡
- 顕微鏡の下にマウスを置き、200の直径を有する腸間膜静脈を持って - ビューの中央には300μm。目に見える脂肪周囲と容器を選択してください。
- それによって内皮の刺激を避ける腸間膜血管を触れないでください。慎重回腸ループを処理します。
- 血液細胞 - 内皮相互作用を可視化倒立または正立顕微鏡、顕微鏡ソフトウェアを使用して、カメラで。マウスあたり4つの異なる静脈の1分間の録音血液細胞 - 内皮相互作用。
- イメージング実験の完了後に頸椎脱臼によりマウスを安楽死させます。
4.分析
- 分析をオフラインで実行し、すべてのパラメータに対して盲目に。任意の適切なソフトウェアプログラムを用いて分析を行います。
- 管腔内の血液細胞の流れに焦点を当て、高時間分解能のシネクリップで安定しており、interindividually同等の血流状態（最大フレームレート）を確認してください。
- ローリング白血球数を定量化します。そのための静脈を介して垂直線を描画し、1分でこのラインを交差するすべての白血球をカウントします。
- 一つの白血球を安定して内皮上を転動しながら、50μmの距離を通過するのに必要な時間を測定することにより、圧延速度を決定。これを行うには、50ミクロンtの距離で2つの垂直線を描きます静脈hrough。
- 代表的な白血球が必要な時間（マイクロメートル/秒）を介して、50ミクロンを分割しother.Calculate行への白血球の速度を得るために必要な時間を測定します。
- 0.04ミリメートル2のフィールドに白血球の接着を測定します。これを行うには、静脈に200μmの辺の長さの正方形を描画します。
- この正方形の中に、30秒間、目に見える動きとして定義されてしっかりと付着性白血球を、数えます。
- 血小板 - 白血球の相互作用を定量化するために、1つの白血球に結合した血小板の数を数えます。
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Representative Results
このプロトコールに記載された実験設定の概要を図1に示されている。これは、生体顕微鏡で観察することができる、体外回腸ループと血管を有するマウスを示す。 図2に起因して、未処理の動物における活性化の特定の程度を示します手順自体。しかし、ほとんどない低速圧延またはLPS処置マウスと比較して、白血球の強固な接着性がある。また、野生型マウスのいずれかの飲料水または未処理のマウスに3週間のフルオキセチンで処置した。 図2A-における生体顕微鏡の異なる結果を示した図2図2F-Hのマウスは、ほかに、LPSで処理しながらCは 、LPSによる任意のさらなる炎症挑戦せずに結果を示します。圧延速度がLPSチャレンジ後に減少している間ここでは、ローリング、付着白血球の高い数字を見ることができます。これらの実験では、我々は、血小板セロトニンがCであることを示すことができました炎症7の白血球動員の最初のステップのためにrucial。
図3では、生体顕微鏡は、手術前に腹腔内に2時間、さらにLPSチャレンジすることなく、ちょうどフルオキセチンでの急性治療後に行きました。ここでは、白血球-内皮相互作用8の急性フルオキセチン処置の影響を示す、しっかりと付着性白血球およびフルオキセチン処置したマウスにおける低い圧延速度の高い数字を見ることができます。
図では、リポ多糖誘発される腹膜炎中4血小板白血球の相互作用は、静脈内に可視化されます。血小板は、白血球の周りロゼット形成されており、これらの複合体は、血管壁と相互作用しています。
実験設定の1.概要図。 >（A）体外回腸ループとその腸間膜血管で麻酔マウス（黒矢印）。 （B）目的（黒矢印）の下に配置されたマウス（赤矢印）と生体内顕微鏡。光源（黒矢印）とカメラ（赤矢印）マークされている。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2.生体顕微鏡またはLPSチャレンジ。LPS刺激せずにローリング白血球の7（A）の数から変更されてもしなくても野生型マウスへのフルオキセチンの3週間投与後 。 （B）LPS刺激のない白血球の速度。 （C）LPS刺激のないしっかりと付着した白血球の数。（D）LPSチャレンジのない未処理のWTマウスの容器の例。 （E）LPSチャレンジのないフルオキセチンで処置したマウスの血管の例。 LPS刺激後のローリング白血球の（F）数。 LPS刺激後（G）白血球の速度。 （H）、LPS刺激後にしっかり付着した白血球の数。 （I）、LPSチャレンジ後、未処理のWTマウスの容器の例。 LPSチャレンジ後のフルオキセチンで処置したマウスの血管の（J）の例。スケールバー=100μmである。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図3：生体顕微鏡急性フルオキセチンチャレンジ2時間後、前、手術へLPSチャレンジ。8 Aから変更）、LPS刺激のないローリング白血球の数が不足しています。 LPS刺激のないB）白血球速度。 LPS刺激のないしっかりと付着性の白血球のC）数。 D）LPSチャレンジのない未処理のWTマウスの容器の例。 E）LPSチャレンジのない急性フルオキセチン処置したマウスの血管の例。スケールバー=100μmである。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図4：in vivoでの血小板-白血球の相互作用。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
血小板、白血球インターの代表画像静脈のリポ多糖誘発される腹膜炎中のin vivoでのマウスのアクション。 11から転載。
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Discussion
本明細書中で、我々は、in vivoでのマウスの腸間膜静脈の生体顕微鏡の製造及び性能を記載します。この方法は、私たちに生体内で直接白血球-内皮細胞および血小板-内皮相互作用11を観察する機会を与えてくれます。
内皮を炎症に対する初期応答として活性化されますと、ローリング、接着および遊出12で得られた白血球と血小板と相互作用します。しかし、白血球はまた、血小板が、いわゆるフォーミングと相互作用、血小板、白血球複合体、主に血小板、好中球の複合体（PNCs）および血小板-単球の複合体（PMCの）13,14。これらの相互作用が観察され、この方法で定量することができます。
さらに、この技術は、（血小板/白血球の相互作用の後に、例えば ）VCAM-1またはICAM-1 15のようなマーカーを用いて内皮の活性化を調査することができます。
手順自体の物理的な刺激は、白血球の可視ローリング（しかし、ほとんどない低速圧延となし密着性）につながる内皮活性化、ある程度の原因となります。これは、審査官は、細心の注意を払って腸間膜を処理する必要があることを意味します。すぎるがある場合は、それを扱う粗製によって引き起こされる多くの活性化は、ローリングの上昇数および接着性白血球になります。 30の再現可能な数に到達するには - 野生型マウスでは、毎分80ローリング白血球を審査官は、訓練を受けたことがあります。
P-セレクチン/ PSGL-相互作用の遮断は、内皮と白血球の相互作用を確認するための対照として役立つことができます。これは、白血球は受動的、内皮への血流が大幅に減少した場合に発生することがあり、シナリオを「添付」されていることを除外します。
300ミクロン - 腸間膜血管の直径は約200の範囲です。したがって、この方法は、毛細血管内微小循環を評価するために適切なものではなく、焦点を合わせます小、炎症を起こした静脈の白血球 - 内皮相互作用に対する、白血球の遊出のための主要な場所。そのような精巣挙モデルなどの他の内の重要な顕微鏡検査法と比較すると、この方法は、習得が容易であり、短時間で行うことができます。
この方法の最も重要な制限の1つは、この方法は、長い給電または治療の研究の後に行うことができないように、マウスは、血管への素晴らしい眺めを持っている多くの腸間膜脂肪なしで若いする必要があることです。
検者が訓練されると、別の炎症状態は、LPSの適用、チオグリコール酸、TNFαまたはヒスタミンとして、この方法を用いて調べることができます。特定の血液細胞のより具体的なイメージングは、蛍光標識された標的分子を使用することによって達成することができます。全体的に、この方法は習得が容易で、生体内で白血球 - 内皮細胞および血小板 - 白血球の相互作用を調べるための簡単な方法です。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 989-38-8 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5 | Sigma-Aldrich | L2637 |
References
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