Abstract
Intravital माइक्रोस्कोपी रहने वाले जानवरों में अलग अलग क्षेत्रों में प्रक्रियाओं और जहाजों की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक विधि है। इस प्रोटोकॉल में, हम अन्त्रपेशी नसों के intravital माइक्रोस्कोपी का वर्णन है। इस vivo में ल्युकोसैट endothelial बातचीत दिखा प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों के साथ समय की एक छोटी अवधि में प्रदर्शन किया जा सकता है। हम अन्तःचूचुक की एलपीएस चुनौती के बाद एक भड़काऊ सेटिंग का वर्णन है। लेकिन इस मॉडल में से एक है, बैक्टीरियल रासायनिक या जैविक, जैसे भड़काऊ शर्तों के कई अलग अलग प्रकार लागू करते हैं और दवाओं के प्रशासन और जीवित जानवरों पर उनके प्रत्यक्ष प्रभाव और ल्युकोसैट भर्ती पर इसके प्रभाव की जांच कर सकते हैं। इस प्रोटोकॉल चूहों और जहाजों में भड़काऊ प्रतिक्रिया पर उनके प्रभाव के विभिन्न उपचार के एक नंबर करने के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया है। इस के साथ साथ, हम fluorescently rhodamine 6G के साथ इन लेबल करके leukocytes और प्लेटलेट्स के दृश्य का वर्णन है। साथ ही, किसी भी विशिष्ट इमेजिंग पे किया जा सकता हैलक्षित fluorescently लेबल अणुओं का उपयोग कर rformed।
Introduction
इस प्रोटोकॉल के उद्देश्य भड़काऊ शर्तों के तहत ल्युकोसैट endothelial और ल्युकोसैट प्लेटलेट बातचीत के प्रत्यक्ष अवलोकन के लिए चूहों में रहने वाले अन्त्रपेशी नसों के intravital माइक्रोस्कोपी का एक सरल तकनीक का वर्णन करने के लिए है।
Intravital माइक्रोस्कोपी भड़काऊ ल्युकोसैट भर्ती और समारोह को समझने के लिए तुच्छ है, लेकिन महत्वपूर्ण नहीं है जो भड़काऊ शर्तों 1,2 के तहत vivo में ल्युकोसैट endothelial बातचीत का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था। इस प्रोटोकॉल में हम विधि का वर्णन पहले प्रकाशित प्रकाशनों के आधार पर विकसित किया गया था। प्रकाशित किया गया है क्या करने के लिए एक से बढ़ थक्का 3 में और समानांतर में प्लेटलेट समावेश दृश्यमान करने के लिए इसी प्रकार पहले 4, एक exteriorized अन्त्रपेशी नस प्रेषित प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच की है। ऐसे चूहों 5 या माउस के जिगर और चूहों 6 की cremaster मांसपेशियों के रूप में इंट्रा-महत्वपूर्ण माइक्रोस्कोपी के विभिन्न अन्य मॉडल हैं।
अन्त्रपेशी नस के intravital माइक्रोस्कोपी विकसित की है और कई समूहों द्वारा पिछले अध्ययनों में लागू किया गया है। / - - जिसका प्लेटलेट सेरोटोनिन औषधीय लंबी अवधि के द्वारा समाप्त हो गया था चूहों को निष्कर्ष गैर-न्यूरोनल सेरोटोनिन की कमी और तुलना कर रहे हैं चूहों, हम जंगली प्रकार चूहों और tryptophane hydroxylase1 (Tph1) के बीच ल्युकोसैट भर्ती में मतभेद निरीक्षण करने के लिए इस तकनीक का इस्तेमाल किया है आवेदन एक चयनात्मक serotonin reuptake अवरोध करनेवाला Fluoxetine 7। हम यह भी तीव्र Fluoxetine उपचार 8 के बाद ल्युकोसैट endothelial बातचीत की जांच की है।
इस मॉडल को जल्दी से प्रदर्शन किया, और ल्युकोसैट endothelial और प्लेटलेट ल्युकोसैट बातचीत के मान्य माप की अनुमति देता जा सकता है क्योंकि इस प्रोटोकॉल में हम, अन्त्रपेशी नसों के intravital माइक्रोस्कोपी पर ध्यान केंद्रित। यह अधिक चुनौतीपूर्ण और समय लेने वाली ऐसी हड्डी, जिगर, त्वचा, या cremaster मांसपेशियों के रूप में अन्य अंगों की intravital माइक्रोस्कोपी में है। साधनयहाँ वर्णित एल ऐसे lipopolysaccharide की intraperitoneal इंजेक्शन के रूप में एक भड़काऊ प्रोत्साहन, साथ यह challengeing के बाद भड़काऊ सेल सेल बातचीत की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मूल्यांकन के लिए आदर्श है।
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Protocol
सभी पशु प्रयोगों जर्मन पशु संरक्षण कानून (TierSchG) के अनुपालन में प्रदर्शन किया गया। FELASA (www.felasa.eu/guidelines.php) और राष्ट्रीय पशु कल्याण शरीर जीवी-SOLAS (www.gv-solas.de/index.html) द्वारा परिभाषित के रूप में चूहों रखे और अच्छे पशु प्रथा के अनुसार संभाल रहे थे। फ्रीबर्ग विश्वविद्यालय के पशु कल्याण समिति के साथ ही स्थानीय अधिकारियों (Regierungspräsidium फ्रीबर्ग) सभी पशु प्रयोगों को मंजूरी दे दी।
1. पशु हैंडलिंग, तैयारी और सूजन की प्रेरण
- 20 ग्राम - 16 के एक वजन सीमा के साथ 6 सप्ताह पुराने नर चूहों - 4 का उपयोग करें। नोट: चूहों पुराने या भारी होते हैं, तो वे सूक्ष्म अवलोकन सीमित पोत आसपास के अत्यधिक वसा प्रस्तुत करते हैं।
- सर्जरी से पहले सभी उपकरण और माइक्रोस्कोप तालिका जीवाणुरहित।
- इंजेक्षन 20 मिलीग्राम / किग्रा एलपीएस (lipopolysaccharide) intraperitoneally 4 एक जीवाणु inflamm प्रेरित करने के लिए रहने वाले चूहे में माइक्रोस्कोपी के लिए पहले घंटासमझना।
- प्लास्टिक कक्ष और अन्त्रपेशी ऊतक गीला करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक waterbath में एक 0.9% खारा समाधान Prewarm।
- सही माइक्रोस्कोपी प्रक्रिया से पहले intraperitoneal ketamine का इंजेक्शन (100 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (5 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ माउस anesthetize। वैकल्पिक संज्ञाहरण, उदाहरण के लिए, 2% isoflurane साँस लेना इस्तेमाल किया जा सकता है। पलटा उत्तेजना (फर्म के दबाव के साथ पैर की अंगुली या पूंछ चुटकी) के जवाब के नुकसान से उचित anesthetization की पुष्टि करें।
- एक शेवर का उपयोग कर पेट बाल हटाना और इथेनॉल के 70% के साथ संतृप्त धुंध के साथ खुले बाल हटा दें।
- संज्ञाहरण के तहत है, जबकि सूखापन को रोकने के लिए माउस की आँखों पर पशु चिकित्सक मरहम लागू करें।
2. सर्जरी
- 70% इथेनॉल का उपयोग पेट जीवाणुरहित। इस पद्धति का एक बाँझ विधि नहीं है और प्रयोग के अंत में घातक हो सकता है।
- एक औसत laparotomy प्रदर्शन करना: छोटे, घुमावदार संदंश और छोटे कैंची का उपयोग पेट की त्वचा को खोलें। महामारी को पहचानेंgastrical जहाजों जहाजों की रक्षा के लिए, linea अल्बा के क्षेत्र में पेरिटोनियम खोलने के लिए और।
- नम ऊतक रखने के लिए उदर गुहा में prewarmed खारा की कुछ बूँदें लागू करें।
- Fluorescently 50 μl rhodamine 6G 9,10 से पहले वर्णित के रूप में रेट्रो orbitally (1 मिलीग्राम / एमएल) के इंजेक्शन द्वारा लेबल leukocytes और प्लेटलेट्स।
- 10 सेमी की एक व्यास के साथ एक petridish में ileumand जगह इसके बारे में एक पाश अमल में और 37 डिग्री सेल्सियस को लागू करने से नम ऊतक रखना सुनिश्चित करें नमकीन घोल (0.9%) हर दूसरे मिनट prewarmed।
3. intravital माइक्रोस्कोपी
- माइक्रोस्कोप के नीचे माउस रखें और 200 के एक व्यास के साथ अन्त्रपेशी नस लाने - दृश्य के केन्द्र में 300 माइक्रोन। कोई दिखाई वसा परिवेश के साथ एक पोत चुनें।
- जिससे अन्तःचूचुक की उत्तेजना से परहेज अन्त्रपेशी वाहिकाओं को छुआ तक नहीं। सावधानी से लघ्वान्त्र पाश संभाल।
- रक्त कोशिका-एन्दोथेलिअल बातचीत कल्पनाएक औंधा या ईमानदार माइक्रोस्कोप और एक माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक कैमरा के साथ। रिकॉर्ड रक्त माउस प्रति 4 अलग रगों में 1 मिनट के लिए सेल-एन्दोथेलिअल बातचीत।
- इमेजिंग प्रयोगों के पूरा होने के बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से माउस euthanize।
4. विश्लेषण
- विश्लेषण ऑफ़लाइन बाहर ले और सभी मापदंडों के लिए अंधा हो। किसी भी उपयुक्त सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग कर विश्लेषण बाहर ले।
- Intraluminal रक्त कोशिका के प्रवाह पर ध्यान केंद्रित उच्च समय संकल्प सिने-क्लिप में स्थिर और interindividually तुलनीय रक्त प्रवाह की स्थिति (अधिकतम फ्रेम दर) की पुष्टि करें।
- रोलिंग leukocytes की संख्या यों। वजह नस के माध्यम से एक खड़ी रेखा खींचना और 1 मिनट में इस लाइन को पार करने के लिए सभी ल्यूकोसाइट्स गिनती।
- एक ही ल्युकोसैट स्थिरतापूर्वक अन्तःचूचुक पर रोलिंग जबकि 50 माइक्रोन की दूरी से पारित करने की जरूरत है समय को मापने के द्वारा रोलिंग वेग निर्धारण करते हैं। ऐसा करने के लिए, 50 माइक्रोन टी की दूरी में दो खड़ी रेखा खींचनानस hrough।
- एक प्रतिनिधि ल्युकोसैट आवश्यक समय (माइक्रोन / एस) के माध्यम से 50 माइक्रोन विभाजित करके other.Calculate करने के लिए एक लाइन से leukocytes की गति लाने के लिए की जरूरत है समय को मापने।
- 0.04 मिमी 2 के एक क्षेत्र में ल्युकोसैट आसंजन उपाय। ऐसा करने के लिए, नस में 200 माइक्रोन की ओर लंबाई के साथ एक वर्ग आकर्षित।
- इस वर्ग के भीतर 30 सेकंड के लिए नहीं दिखाई आंदोलन के रूप में परिभाषित फर्म पक्षपाती ल्यूकोसाइट्स, गिन लो।
- प्लेटलेट ल्युकोसैट बातचीत यों के लिए एक ल्युकोसैट करने के लिए बाध्य प्लेटलेट्स की संख्या की गणना।
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Representative Results
इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रयोगात्मक सेटिंग का अवलोकन चित्र 1 में दिखाया गया है। यह intravital माइक्रोस्कोपी में देखा जा सकता है जो एक exteriorized लघ्वान्त्र-पाश और उसके जहाजों, के साथ एक माउस से पता चलता है। चित्रा 2 की वजह से अनुपचारित पशुओं में सक्रियण के कुछ डिग्री से पता चलता है प्रक्रिया ही। लेकिन लगभग कोई धीमी रोलिंग या एलपीएस इलाज चूहों की तुलना में leukocytes की फर्म आसंजन है। यह भी wildtype चूहों या तो पीने के पानी या अनुपचारित चूहों में 3 सप्ताह के लिए Fluoxetine के साथ इलाज किया। चित्रा 2A- में intravital माइक्रोस्कोपी के विभिन्न परिणामों से पता चलता 2 चित्रा चित्रा 2 एफ-एच में चूहों अलावा LPS के साथ इलाज किया गया है, जबकि LPS के साथ किसी भी आगे भड़काऊ चुनौती के बिना परिणाम दिखाने सी। रोलिंग वेग एलपीएस चुनौती के बाद से कमी आई है, जबकि यहाँ हम, रोलिंग और पक्षपाती leukocytes की अधिक संख्या देख सकते हैं। इन प्रयोगों के साथ हम प्लेटलेट सेरोटोनिन सी है कि दिखा सकता हैसूजन 7 में ल्युकोसैट भर्ती के प्रारंभिक चरणों के लिए rucial।
चित्रा 3 में, intravital माइक्रोस्कोपी आगे एलपीएस चुनौती के बिना और बस intraperitoneally 2 घंटा सर्जरी से पहले Fluoxetine के साथ तीव्र उपचार के बाद किया गया था। यहाँ हम ल्युकोसैट endothelial बातचीत 8 पर तीव्र Fluoxetine उपचार का एक प्रभाव का संकेत है, दृढ़ता से पक्षपाती leukocytes और Fluoxetine इलाज चूहों में कम रोलिंग वेग से अधिक संख्या देख सकते हैं।
चित्रा में lipopolysaccharide प्रेरित पेरिटोनिटिस के दौरान 4 प्लेटलेट ल्युकोसैट बातचीत एक नस के भीतर कल्पना कर रहे हैं। प्लेटलेट्स ल्यूकोसाइट्स के आसपास rosetting कर रहे हैं और इन परिसरों पोत दीवार के साथ बातचीत कर रहे हैं।
प्रायोगिक सेटिंग्स 1. अवलोकन चित्रा। (ए) exteriorized लघ्वान्त्र-पाश और उसके अन्त्रपेशी वाहिकाओं (काला तीर) के साथ एक anaesthetized माउस। उद्देश्य (काला तीर) के नीचे (बी) रखा माउस (लाल तीर) के साथ intravital खुर्दबीन। प्रकाश स्रोत (काला नोक) और कैमरा (लाल नोक) के रूप में चिह्नित कर रहे हैं। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. intravital माइक्रोस्कोपी के साथ या एलपीएस चैलेंज। LPS-उत्तेजना के बिना रोलिंग leukocytes के 7 (ए) नंबर से संशोधित बिना किसी भी wildtype चूहों को Fluoxetine के 3 सप्ताह के बाद प्रशासन। एलपीएस उत्तेजना के बिना (बी) ल्यूकोसाइट वेग। एलपीएस उत्तेजना के बिना मजबूती से पक्षपाती leukocytes के (सी) संख्या।(डी) एलपीएस चुनौती के बिना एक अनुपचारित गुम्मट माउस के एक पोत का उदाहरण। (ई) एलपीएस चुनौती के बिना एक Fluoxetine इलाज माउस के एक पोत का उदाहरण। LPS-उत्तेजना के बाद रोलिंग leukocytes के (एफ) संख्या। एलपीएस उत्तेजना के बाद (जी) ल्यूकोसाइट वेग। एलपीएस उत्तेजना के बाद मजबूती से पक्षपाती leukocytes के (एच) संख्या। (मैं) एलपीएस चुनौती के बाद एक अनुपचारित गुम्मट माउस के एक पोत का उदाहरण। एलपीएस चुनौती के बाद एक Fluoxetine इलाज माउस के एक पोत के (जे) उदाहरण। स्केल बार = 100 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: intravital माइक्रोस्कोपी के साथ सर्जरी के लिए तीव्र Fluoxetine चैलेंज 2 घंटा पहले के बादएलपीएस चैलेंज। 8 से संशोधित) LPS-उत्तेजना के बिना रोलिंग leukocytes की संख्या में बाहर। एलपीएस उत्तेजना के बिना बी) ल्यूकोसाइट वेग। एलपीएस उत्तेजना के बिना मजबूती से पक्षपाती leukocytes के सी) संख्या। डी) एलपीएस चुनौती के बिना एक अनुपचारित गुम्मट माउस के एक पोत का उदाहरण। ई) एलपीएस चुनौती के बिना एक तीव्र Fluoxetine इलाज माउस के एक पोत का उदाहरण। स्केल बार = 100 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4:। विवो में प्लेटलेट ल्युकोसैट सहभागिता यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
प्लेटलेट ल्युकोसैट के अंतर का प्रतिनिधि तस्वीररगों में lipopolysaccharide प्रेरित पेरिटोनिटिस दौरान vivo में चूहों में कार्रवाई। 11 से पुनर्मुद्रण।
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Discussion
इस के साथ साथ हम तैयार करने और इन विवो में चूहों के अन्त्रपेशी नसों के intravital माइक्रोस्कोपी के प्रदर्शन का वर्णन है। इस विधि हमें जीवित जीव में सीधे ल्युकोसैट endothelial और प्लेटलेट एन्दोथेलिअल बातचीत 11 निरीक्षण करने का अवसर देता है।
अन्तःचूचुक सूजन के लिए एक प्रारंभिक प्रतिक्रिया के रूप में सक्रिय हो जाता है और रोलिंग, आसंजन और स्थानांतरगमन 12 में जिसके परिणामस्वरूप leukocytes और प्लेटलेट्स के साथ सूचना का आदान प्रदान। लेकिन ल्यूकोसाइट्स भी प्लेटलेट्स तथाकथित के गठन के साथ बातचीत, प्लेटलेट ल्युकोसैट परिसरों, मुख्य रूप से प्लेटलेट न्यूट्रोफिल परिसरों (PNCs) और प्लेटलेट monocyte परिसरों (PMCS) 13,14 ये बातचीत मनाया और इस विधि में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है।
इसके साथ ही इस तकनीक (प्लेटलेट / ल्युकोसैट बातचीत के बाद जैसे,) Vcam -1 या ICAM-1 की तरह मार्कर के साथ अन्तःचूचुक सक्रियण 15 की जांच की अनुमति देता है।
प्रक्रिया ही के भौतिक प्रोत्साहन ल्यूकोसाइट्स के दृश्य रोलिंग (लेकिन लगभग कोई धीमी रोलिंग और कोई फर्म आसंजन) की ओर जाता है जो एन्दोथेलिअल सक्रियण की एक निश्चित डिग्री, का कारण बनता है। इस परीक्षक बड़ी सावधानी से अन्त्रपेशी संभाल करने की जरूरत है कि निकलता है। यह रोलिंग और पक्षपाती leukocytes के बुलंद संख्या में परिणाम होगा निपटने के कच्चे तेल की वजह से बहुत ज्यादा सक्रियण अगर वहाँ। 30 की एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य संख्या तक पहुंचने के लिए - जंगली प्रकार चूहों में परीक्षक प्रति मिनट 80 रोलिंग ल्यूकोसाइट्स प्रशिक्षित किया जाना है।
पी selectin / PSGL-बातचीत की रुकावट अन्तःचूचुक साथ leukocytes की बातचीत की पुष्टि के लिए एक नियंत्रण के रूप में सेवा कर सके। यह ल्यूकोसाइट्स निष्क्रिय, अन्तःचूचुक में रक्त प्रवाह को दृढ़ता से कम है तो हो सकता है कि एक परिदृश्य "संलग्न" कर रहे हैं कि नियमों के बाहर।
300 माइक्रोन - अन्त्रपेशी पोत व्यास के बारे में 200 के बीच है। इसलिए, इस विधि केशिकाओं में microcirculation आकलन करने के लिए उपयुक्त नहीं है, लेकिन केंद्रित हैछोटे, सूजन नसों, leukocytes के स्थानांतरगमन के लिए प्राथमिक जगह में ल्युकोसैट endothelial बातचीत पर। ऐसे cremaster मॉडल के रूप में अन्य इंट्रा-महत्वपूर्ण माइक्रोस्कोपी तरीके की तुलना में, इस विधि जानने के लिए और एक कम समय अवधि में किया जा सकता है आसान है।
इस पद्धति का सबसे महत्वपूर्ण सीमाओं में से एक चूहों इस विधि लंबे खिला या उपचार पढ़ाई के बाद नहीं किया जा सकता है, ताकि वाहिकाओं में एक अच्छा विचार है ज्यादा अन्त्रपेशी वसा के बिना युवा होने की जरूरत है।
परीक्षक प्रशिक्षित किया जाता है एक बार, अलग भड़काऊ शर्तों ऐसे एलपीएस के आवेदन, thioglycollate, TNFα या हिस्टामिन के रूप में, इस विधि के साथ जांच की जा सकती है। विशेष रूप से रक्त कोशिकाओं के अधिक विशिष्ट इमेजिंग लक्षित fluorescently लेबल अणुओं का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। कुल मिलाकर, इस विधि जानने के लिए आसान और एक जीवित जीव में ल्युकोसैट endothelial और प्लेटलेट ल्युकोसैट बातचीत की जांच करने के लिए एक त्वरित तरीका है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 989-38-8 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5 | Sigma-Aldrich | L2637 |
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