Abstract
Intravital mikroskopi yaşayan hayvanlarda farklı farklı bölgelerde süreçleri ve damarları araştırmak için kullanılabilecek bir yöntemdir. Bu protokol, biz mezenter damarların intravital mikroskobu açıklar. Bu, in vivo olarak, lökosit-endoteliyal etkileşimleri gösteren tekrarlanabilir sonuçlar ile kısa bir süre içinde gerçekleştirilebilir. Biz endotel LPS mücadeleden sonra inflamatuar bir ayarı açıklamak. Ancak bu modelde biri bakteriyel kimyasal veya biyolojik gibi iltihaplı durumların birçok farklı türde uygulamak ve ilaçların yönetimini ve yaşam hayvan üzerindeki doğrudan etkileri ve lökosit işe üzerindeki etkisini araştırmak yapabilirsiniz. Bu protokol, farelerde ve damarlarda inflamatuar yanıt üzerindeki etkileri farklı tedaviler için başarılı bir şekilde uygulanmıştır. Burada, floresan rodamin 6G bu etiketleme yoluyla lökosit ve trombosit görselleştirme açıklar. Buna ek olarak, herhangi bir görüntüleme pe olabilirhedeflenen floresan etiketli moleküller kullanılarak rformed.
Introduction
Bu protokolün amacı, inflamatuvar koşullarda lökosit-endotel ve lökosit-trombosit etkileşimleri doğrudan gözlem için fareler yaşayan mezenter damarların intravital mikroskopi basitleştirilmiş tekniği tanımlamaktır.
Intravital mikroskopi inflamatuar lökosit işe alma ve işlevini anlamak için önemsiz ama önemli değil enflamatuvar durumlarda 1,2 altında in vivo lökosit-endotel etkileşimleri incelemek için geliştirilmiştir. Bu protokolde biz tarif yöntemi daha önce yayınlanan yayınlara göre geliştirilmiştir. Yayımlanmıştır ne büyüyen trombüs 3 ve paralel olarak trombosit birleşmesini görselleştirmek benzer daha erken 4, bir batın mezenterik ven iletilen ışık mikroskobu ile incelenir. Bu tür sıçanlarda 5 veya fare karaciğer ve sıçanların 6 cremaster kas gibi içi hayati mikroskobu çeşitli modelleri vardır.
Mezenter ven intravital mikroskopi geliştirilmiş ve birçok grup ile daha önceki çalışmalarda uygulanmıştır. / - - Kimin trombosit serotonin farmakolojik uzun vadeli tarafından tükenmiş farelere bulgular nöronal olmayan serotonin eksikliği ve karşılaştırılmıştır olan fareler, vahşi tip fareler ve triptofan hydroxylase1 (TPH1) arasında lökosit işe farklılıkları gözlemlemek için bu tekniği kullandık Uygulama, bir seçici serotonin tekrar-yükselme inhibitörü, fluoksetin 7. Biz de akut fluoksetin tedavisinin 8. sonrası lökosit-endotel etkileşimleri incelenmiştir.
Bu model, hızla gerçekleştirilen ve lökosit-endotel ve trombosit lökosit etkileşimleri geçerli ölçümleri sağlar, çünkü bu protokolde, mezenter damarların intravital mikroskopi odaklanmak. Bu çok daha zor ve zaman alıcı kemik, karaciğer, deri, ya da cremaster kas gibi diğer organlara, intravital mikroskobiyle bulunmaktadır. kipBurada tarif edilen L, lipopolisakarit intraperitoneal enjeksiyonu gibi bir enflamatuar uyarıcı, ile challengeing sonrası inflamatuar hücre-hücre etkileşim tekrarlanabilir değerlendirilmesi için idealdir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri Alman hayvan koruma kanunu (TierSchG) uygun olarak yapılmıştır. FELASA (www.felasa.eu/guidelines.php) ve ulusal hayvan refahı vücut GV-SOLAS (www.gv-solas.de/index.html) tarafından tanımlanan fareler ev sahipliği ve iyi hayvan uygulamalarına uygun olarak ele alındı. Freiburg Üniversitesi hayvan refahı komitesi yanı sıra yerel yönetimler (Regierungspräsidium Freiburg) tüm hayvan deneyleri onayladı.
1. Hayvan Taşıma, hazırlanması ve Enflamasyon indüksiyonu
- 20 g - 16 ağırlık aralığı ile 6 haftalık erkek fareler - 4 kullanın. Not: fareler eski veya daha ağır olmaları durumunda, mikroskobik gözlem sınırlayan, damar etrafındaki aşırı yağ sunuyoruz.
- Ameliyat öncesinde tüm araçları ve mikroskop tablosunu sterilize edin.
- Enjekte 20 mg / kg LPS (lipopolisakarit) intraperitonal olarak 4 bakteriyel Inflamm uyarılması için bir oturma fare içine mikroskop önce saattirme.
- Plastik odası ve mezenterik doku nemlendirmek için 37 ° C sıcaklıkta bir su banyosu içinde bir% 0.9 tuzlu su çözeltisi Prewarm.
- Sağ mikroskopi işlem öncesi intraperitonal ketamin enjekte (100 mg / kg) ve ksilazin (5 mg / kg) ile fare anestezisi. Alternatif anestezi, örneğin,% 2 izofluran teneffüs kullanılabilir. Refleks uyarım (firma basınç ayak veya kuyruk tutam) yanıt kaybı ile doğru anesthetization onaylayın.
- Bir tıraş makinesi kullanarak karın atmaktadır ve etanol% 70 doymuş gazlı bez ile gevşek saç çıkarın.
- Anestezi altında iken, kuruluk önlemek için fare gözleri veteriner merhem sürün.
2. Cerrahi
- % 70 etanol kullanılarak karın sterilize edin. Bu yöntem, steril bir yöntem değildir, deney sonunda öldürücü olabilir.
- Median laparotomi gerçekleştirin: küçük, kavisli bir forseps ve küçük bir makas kullanarak karın cildi açın. Epi tanımlayıngastrical gemiler damarları korumak için, linea alba bölgesinde periton açın ve.
- Nemli doku tutmak için karın boşluğuna önceden ısıtılmış tuzlu su bir kaç damla uygulanır.
- Floresan 50 ul rodamin 6G 9,10 daha önce tanımlandığı gibi, retro-orbital (1 mg / mi) enjekte edilmesiyle Etiket lökositlerin ve trombositlerin.
- 10 cm çapında bir petri içinde ileumand yerinde bunun bir döngü exteriorize ve 37 ° C uygulayarak nemli doku tutmak için emin olun tuzlu su çözeltisi (% 0.9) her dakika önceden ısıtılmış.
3. Intravital Mikroskopi
- Mikroskop altına Fare yerleştirin ve 200 çapında mezenter ven getirmek - görünümünde merkezinde 300 um. Hiçbir görünür yağ çevresi ile bir gemi seçin.
- Böylece endotel uyarılmasını önlemek mezenter damarlarını dokunmayın. Dikkatli ileum döngü Kolu.
- Kan hücresi endotel etkileşimlerini görselleştirinBir ters çevrilmiş veya dik bir mikroskop ve mikroskop yazılımı kullanarak bir kamera ile. Tutanak kan fare başına 4 farklı damarlarda 1 dakika için hücre-endotelyal etkileşimleri.
- Görüntüleme Deneylerin tamamlanmasından sonra, servikal dislokasyon ile fare öldürülür.
4. Analiz
- Analiz çevrimdışı yürütmek ve tüm parametreler için kör. Herhangi bir uygun yazılım programı kullanarak analiz gerçekleştirin.
- Intraluminal kan hücresi akımı odaklanmış yüksek zaman çözünürlüklü sine-klipleri istikrarlı ve interindividually karşılaştırılabilir kan akımı koşulları (maksimal kare hızı) onaylayın.
- Haddeleme lökosit sayısını ölçmek. Bunun damar yoluyla dikey bir çizgi çizin ve 1 dakika içinde bu çizgiyi tüm lökositlerin sayısı.
- Tek lökosit stabil endotel üzerinde yuvarlanma sırasında 50 mikron mesafe geçmek gerekiyor zamanı ölçerek haddeleme hızı belirleyin. Bunu yapmak için, 50 um t mesafede iki dikey çizgi çizinven hrough.
- Temsili bir lökosit gerekli zaman (mm / s) üzerinden 50 mikron bölerek other.Calculate bir hattan lökositlerin hız almak için gereken süreyi ölçün.
- 0.04 mm'lik bir 2 alanda lökosit adezyonu ölçün. Bunu yapmak için, damara 200 mikron yan uzunluğunda bir kare çizin.
- Bu kare içinde 30 saniye boyunca hiçbir görünür hareket olarak tanımlanan firma yapışık lökositler, Kont.
- Platelet lökosit etkileşimlerini ölçmek için tek lökosit bağlı trombositlerin sayısını.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokolde tarif edilen deneysel ortamda bir genel görünüşü Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu intravital mikroskobiyle gözlenebilir bir batın ileum-döngü ve kaplar, bir fare göstermektedir. Şekil 2 nedeniyle işlem görmemiş hayvanlarda aktivasyon belli ölçüde göstermektedir prosedür kendisi. Fakat hemen hemen hiç yavaş haddeleme ya LPS ile tedavi edilen farelere kıyasla, lökositlerin Sıkı yapışma vardır. Ayrıca, vahşi tipli fare ya içme suyu ya da tedavi edilmemiş farelerde 3 hafta içinde fluoksetin ile işlemden geçirildi. Şekil 2A- bölgesindeki intravital mikroskobiyle farklı sonuçlarını göstermektedir, Şekil 2 Şekil 2F-H fareler ek olarak LPS ile tedavi ederken, LPS ile başka inflamatuar meydan vermeden sonuçları gösterir C. Haddeleme hız LPS mücadeleden sonra azalırken Burada, haddeleme ve yapışık lökositlerin yüksek numaralarını görebilirsiniz. Bu deneyler ile biz trombosit serotonin c olduğunu gösterebiliriminflamasyon 7 lökosit işe ilk adımlar için rucial.
Şekil 3'te, İntra vital mikroskopik daha LPS meydan vermeden sadece karın içinden 2 saat önce cerrahi fluoksetin akut tedaviden sonra gerçekleştirilmiştir. Burada, lökosit-endoteliyal etkileşimleri 8 akut fluoksetin tedavinin etkisini gösteren sıkıca yapışmış lökositler ve fluoksetin ile tedavi edilmiş farelerde daha düşük yuvarlanma hızlarının daha yüksek sayıda görebilir.
Şekil lipopolisakkaritin kaynaklı peritonit sırasında 4 trombosit lökosit etkileşimleri bir damar içinde görselleştirilmektedir. Trombositler lökositler etrafında rozetlenmeyen ve bu kompleksler damar duvarı ile etkileşim.
Deneysel Ayarları 1. Genel Bakış Şekil. (A) batın ileum-döngü ve mezenter gemiler (siyah ok) ile bir anestezi fare. Amaç (siyah ok) altına (B) yerleştirilen fare (kırmızı ok) ile Intravital mikroskop. Işık kaynağı (siyah ok başı) ve kamera (kırmızı ok ucu) işaretlenmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Intravital Mikroskopi ile veya LPS Mücadelesi. LPS stimülasyon olmadan haddeleme lökositlerin 7 (A) Number Modifiye olmadan Ya Yabani türde Fareler için Fluoksetin 3 haftalık İdaresi sonrası. LPS stimülasyon olmadan (B) lökosit hızı. LPS uyarımı olmadan sıkıca yapışan lökositlerin (C) sayısı.(D), LPS meydan okumasından olmayan bir muamele edilmemiş WT fare bir kap örneği. (E), LPS meydan okumasından olmadan fluoksetin ile muamele edilmiş bir fare kap örneği. LPS ile stimülasyondan sonra, yuvarlanan lökositlerin (F) sayısı. LPS uyarımından sonra (G) lökosit hızı. LPS uyarımından sonra sıkı bir şekilde yapışan lökositlerin (H) sayısı. (I), LPS meydan okumasından sonra işlem görmemiş bir WT fare bir kap örneği. LPS meydan okumasından sonra fluoksetin ile muamele edilmiş bir fare kabın (J) Örnek. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Intravital Mikroskop ile Cerrahi Akut Fluoksetin Challenge 2 saat önce sonraLPS meydan. 8 A Modifiye) LPS stimülasyon olmadan haddeleme lökosit sayısı dışında. LPS stimülasyon olmadan B) Lökosit hızı. LPS stimülasyon olmadan sıkıca yapışık lökositlerin C) sayısı. D), LPS meydan okumasından olmayan bir muamele edilmemiş WT fare bir kap örneği. E), LPS meydan okumasından olmayan akut fluoksetin ile muamele edilmiş bir fare kap örneği. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4:. Vivo Trombosit lökosit Etkileşimleri bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Trombosit lökosit inter Temsilcisi resimDamarlarında lipopolisakarit kaynaklı peritonit sırasında farelerde in vivo eylemler. 11 den yeniden yazdırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda hazırlık ve in vivo farelerin mezenter damarlarının intravital mikroskopi performansını açıklamak. Bu yöntem bize canlı organizmada doğrudan lökosit-endotel ve trombosit endotel etkileşimleri 11 gözlemleme fırsatı veriyor.
Endotel inflamasyon için erken yanıt olarak aktive olur ve haddeleme, yapışma ve göçüne 12 sonuçlanan lökositler ve trombositler ile etkileşime girer. Ancak lökositler de trombosit sözde şekillendirme ile etkileşim, platelet lökosit kompleksleri, esas olarak trombosit nötrofil kompleksler (PNK'lar) ve pıhtılaşma parçacığı monosit kompleksler (PMC) 13,14 .Bu etkileşimleri mevcut olup, bu yöntemde belirlenebilir.
Buna ek olarak, bu teknik, (trombosit / lökosit etkileşimi sonra, örneğin,), VCAM-1 ya da ICAM-1 gibi belirteçleri ile endotel aktivasyonunu 15 soruşturma sağlar.
prosedürün kendisi fiziksel uyaran lökositlerin görünür haddeleme (ama neredeyse hiçbir yavaş haddeleme ve hiçbir firma yapışma) yol açar endotel aktivasyonu belirli bir ölçüde neden olur. Bu muayene büyük bir özenle mezenter işlemek gerektiğini ima eder. Bu haddeleme ve yapışık lökositlerin yüksek sayılar neden olacaktır ele ham neden çok fazla aktivasyon varsa. 30 tekrarlanabilir bir sayı ulaşmak için - vahşi tip farelerde doktoru dakikada 80, yuvarlanan lökositlerin yetiştirilmek üzere yer alır.
P-selektin / PSGL-etkileşim Blokaj endotele ile lökositlerin etkileşimi onaylamak için bir kontrol olarak hizmet verebilir. Bu lökositler pasif, endotel kan akımı şiddetle azalır oluşabilir bir senaryo "bağlı" olduğunu dışladı.
300 mikron - mezenter damar çapı yaklaşık 200 aralığındadır. Bu nedenle, bu yöntem, kılcal mikrodolaşımı değerlendirmek için uygun değildir, ancak odaklanırKüçük, iltihaplı venler, lökositlerin göçü için birincil yerde lökosit-endotel etkileşimleri. Örneğin cremaster modeli gibi diğer içi canlı mikroskobi yöntemleri ile karşılaştırıldığında, bu yöntem, öğrenme ve daha kısa bir süre içinde gerçekleştirilebilir daha kolaydır.
Bu yöntemin en önemli sınırlamalar biri fareler bu yöntem uzun beslenme veya tedavi çalışmalarının ardından gerçekleştirilemez, böylece damarlara iyi bir görünümü var çok mezenterik yağ olmadan genç olmak gerektiğidir.
Muayene eğitimli sonra, farklı ateşli koşullar, LPS uygulaması, tiyoglikolat, TNFa ya da histamin gibi, bu yöntem ile incelenebilir. Özellikle kan hücrelerinin daha özel görüntüleme hedef floresan etiketli molekülleri kullanılarak elde edilebilir. Genel olarak, bu yöntem öğrenmesi kolay ve canlı bir organizmada lökosit-endotel ve trombosit lökosit etkileşimleri incelemek için hızlı bir yoldur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 989-38-8 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5 | Sigma-Aldrich | L2637 |
References
- Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells. Methods in enzymology. 300, 462-481 (1999).
- Atherton, A., Born, G. V. Quantitative investigations of the adhesiveness of circulating polymorphonuclear leucocytes to blood vessel walls. The Journal of physiology. 222, 447-474 (1972).
- Duerschmied, D., et al. Serotonin stimulates platelet receptor shedding by tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme (ADAM17). Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 7, 1163-1171 (2009).
- Chauhan, A. K., et al. ADAMTS13: a new link between thrombosis and inflammation. The Journal of experimental medicine. 205, 2065-2074 (1084).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvascular research. 5, 384-394 (1973).
- Leister, I., et al. A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum. Surgical endoscopy. 17, 939-942 (2003).
- Duerschmied, D., et al. Platelet serotonin promotes the recruitment of neutrophils to sites of acute inflammation in mice. Blood. 121, 1008-1015 (2013).
- Herr, N., et al. Acute fluoxetine treatment induces slow rolling of leukocytes on endothelium in mice. PloS one. 9, e88316 (2014).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S.
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab animal. 37, 26-32 (2008).
- Duerschmied, D., Bode, C., Ahrens, I.
- Wagner, D. D., Frenette, P. S. The vessel wall and its interactions. Blood. 111, 5271-5281 (2008).
- Gawaz, M., Fateh-Moghadam, S., Pilz, G., Gurland, H. J., Werdan, K. Platelet activation and interaction with leucocytes in patients with sepsis or multiple organ failure. European journal of clinical investigation. 25, 843-851 (1995).
- Sarma, J., et al. Increased platelet binding to circulating monocytes in acute coronary syndromes. Circulation. 105, 2166-2171 (2002).
- Sumagin, R., Sarelius, I. H. TNF-alpha activation of arterioles and venules alters distribution and levels of ICAM-1 and affects leukocyte-endothelial cell interactions. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 291, H2116-H2125 (2006).
