Abstract
Intravital mikroskopi er en metode, der kan anvendes til at undersøge forskellige processer i forskellige regioner og fartøjer i levende dyr. I denne protokol, beskriver vi intravital mikroskopi af mesenterium vener. Dette kan udføres i en kort periode med reproducerbare resultater viser leukocyt-endotel-interaktioner in vivo. Vi beskriver en inflammatorisk indstilling efter LPS-udfordring af endotel. Men i denne model kan man anvende mange forskellige typer af inflammatoriske tilstande, ligesom bakteriel, kemiske eller biologiske og undersøge administration af lægemidler og deres direkte virkninger på levende dyr og dens indvirkning på leukocytrekruttering. Denne protokol er blevet anvendt med succes på en række forskellige behandlinger af mus og deres virkninger på inflammatorisk respons i skibe. Heri beskriver vi visualisering af leukocytter og blodplader ved fluorescens mærkning disse med rhodamin 6G. Derudover kan en specifik billeddannelse være performed anvendes målrettede fluorescerende mærkede molekyler.
Introduction
Formålet med denne protokol er at beskrive en forenklet teknik intravital mikroskopi af mesenterium vener i levende mus til direkte observation af leukocyt-endotel og leukocyt-blodplade interaktioner under inflammatoriske tilstande.
Intravital mikroskopi blev udviklet til at studere leukocyt-endotel-interaktioner in vivo under inflammatoriske tilstande 1,2, hvilket ikke trivielt, men vigtige for forståelsen af inflammatoriske leukocytrekruttering og funktion. Den metode, vi beskriver i denne protokol blev udviklet baseret på tidligere offentliggjorte publikationer. Svarende til at visualisere blodplader inkorporering i en voksende blodprop 3 og parallelt med hvad der er blevet offentliggjort tidligere 4, er et eksterioriseret mesenterium vene undersøgt ved transmitteret lysmikroskopi. Der er forskellige andre modeller af intra-vital mikroskopi såsom cremaster muscle af rotter 5 eller lever af mus og rotter 6.
Intravital mikroskopi af mesenterium vene er blevet udviklet og anvendt i tidligere undersøgelser af flere grupper. Vi har anvendt denne teknik til at observere forskelle i leukocytrekruttering mellem vildtypemus og tryptophan hydroxylase1 (TPH1) - / - mus, der er deficiente ikke-neuronal serotonin og sammenlignede resultaterne til mus, hvis blodplade serotonin blev farmakologisk udtømt ved langsigtet ansøgningen en selektiv serotonin reuptake inhibitor fluoxetin 7. Vi har også undersøgt leukocyt-endotel interaktioner efter akut fluoxetin behandling 8.
I denne protokol fokuserer vi på intravital mikroskopi af mesenterium vener, fordi denne model kan udføres hurtigt, og giver mulighed for gyldige målinger af leukocyt-endotel og blodplade-leukocyt interaktioner. Dette er meget mere udfordrende og tidskrævende i intravital mikroskopi af andre organer, såsom knogle, lever, hud, eller cremaster muskel. Tilstandenl her beskrevne er ideel til reproducerbar evaluering af inflammatorisk interaktion celle-celle efter challengeing med et inflammatorisk stimulus, såsom intraperitoneal injektion af lipopolysaccharid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med den tyske dyrebeskyttelse lov (TierSchG). Musene blev opstaldet og håndteres i overensstemmelse med god dyr praksis som defineret af FELASA (www.felasa.eu/guidelines.php) og det nationale dyrevelfærd krop GV-SOLAS (www.gv-solas.de/index.html). Den dyrevelfærd udvalg universitetet i Freiburg, samt de lokale myndigheder (Regierungspräsidium Freiburg) godkendte alle dyreforsøg.
1. Animalske Handling, Forberedelse og Induktion af inflammation
- Brug 4 - 6 uger gamle hanmus med en vægt vifte af 16-20 g. Bemærk: Hvis musene er ældre eller tungere de frembyder meget fedt omkring skibet, hvilket begrænser mikroskopisk observation.
- Sterilisere alle redskaber og mikroskop bordet før kirurgi.
- Injicere 20 mg / kg LPS (lipopolysaccharid) intraperitonealt 4 timer før mikroskopi ind i den levende mus for at inducere en bakteriel Inflammation.
- Forvarm en 0,9% saltvandsopløsning i et vandbad ved 37 ° C for at befugte plast kammer og mesenterium væv.
- Bedøver musen med intraperitoneal injektion af ketamin (100 mg / kg) og xylazin (5 mg / kg) lige før mikroskopi procedure. Alternative anæstesi kan anvendes, fx 2% isofluran inhalering. Bekræft ordentlig bedøvelse ved tabet af respons på refleks stimulation (toe eller hale knivspids med et fast tryk).
- Fjerne hår maven under anvendelse af en barbermaskine og fjerne løse hår med gaze mættet med ethanol 70%.
- Påfør dyrlæge salve på øjnene af musen til at forebygge tørhed, mens under anæstesi.
2. Kirurgi
- Steriliser underlivet anvendelse af 70% ethanol. Denne metode er ikke en steril fremgangsmåde og kan være dødelige ved slutningen af forsøget.
- Udfør en median laparotomi: Åbn den abdominale hud ved hjælp af små, buede pincet og en lille saks. Identificer epigastrical fartøjer og åbne peritoneum i området af linea alba, for at beskytte fartøjer.
- Påfør et par dråber forvarmet saltvand ind i bughulen for at holde vævet fugtig.
- Label leukocytter og blodplader fluorescens ved at injicere 50 pi rhodamin 6G (1 mg / ml) retro-orbitalt som beskrevet før 9,10.
- Eksteriorisere en løkke af ileumand sted det i en petriskål med en diameter på 10 cm, og sørg for at holde vævet fugtig ved at anvende 37 ° C forvarmet saltvandsopløsning (0,9%) hvert andet minut.
3. Intravital Microscopy
- Placer musen under mikroskop og bringe mesenterium vene med en diameter på 200 - 300 um i centrum af visningen. Vælg et fartøj uden synlige fedt omgivelser.
- Rør ikke mesenterium fartøjer derved undgå stimulering af endotel. Håndtere ileum loop forsigtigt.
- Visualiser blodlegemer-endotel interaktionermed et omvendt eller opret mikroskop og et kamera ved hjælp af et mikroskop software. Optag blodlegemer-endotel-interaktioner i 1 min i 4 forskellige vener per mus.
- Aflive musen ved cervikal dislokation efter afslutningen af billeddannende eksperimenter.
4. Analyse
- Udføre analysen offline og blindet for alle parametre. Udføre analyser ved hjælp af enhver egnet program.
- Bekræft stabile og interindividually sammenlignelige blod strømningsforholdene i høje tid opløsning cine-clips (maksimal billedhastighed) fokuseret på intraluminal blodlegemer flow.
- Kvantificere antallet af rullende leukocytter. Derfor tegne en lodret linje gennem venen og tælle alle leukocytter krydser denne linje i 1 min.
- Bestemme rullende hastighed ved at måle tiden en enkelt leukocyt mangler at bestå en afstand på 50 um, mens stabilt rullende på endotel. For at gøre dette, tegne to lodrette linjer i en afstand på 50 um through venen.
- Den tid, en repræsentativ leukocyt brug for at komme fra den ene linje til other.Calculate hastigheden af leukocytter ved at dividere 50 um gennem den nødvendige tid (um / s).
- Måle leukocytadhæsion i et felt på 0,04 mm2. For at gøre dette, tegne et kvadrat med sidelængde på 200 um ind i venen.
- Tæl faste vedhængende leukocytter, defineret som ingen synlig bevægelse i 30 sek, inden denne firkant.
- Tæl antallet af blodplader er bundet til én leukocyt at kvantificere blodplade-leukocyt interaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En oversigt over den eksperimentelle omgivelser er beskrevet i denne protokol er vist i figur 1. Den viser en mus med en eksterioriseret ileum-loop og dens fartøjer, som kan observeres i intravital mikroskopi. Figur 2 viser vis grad af aktivering i ubehandlede dyr på grund af selve proceduren. Men der er næsten ingen langsom rulning eller faste adhæsion af leukocytter i forhold til LPS-behandlede mus. Figur 2 viser også de forskellige resultater af intravital mikroskopi i vildtypemus enten behandlet med fluoxetin i 3 uger i drikkevandet eller ubehandlede mus. Figur 2a- C viser resultaterne uden yderligere inflammatorisk udfordring med LPS, mens mus i figur 2F-H blev behandlet med LPS desuden. Her kan vi se højere antal rullende og vedhængende leukocytter, mens rullende hastighed faldt efter LPS udfordring. Med disse eksperimenter kan vi vise, at trombocyt serotonin er crucial for de indledende trin i leukocytrekruttering i inflammation 7.
I figur 3 blev intravital mikroskopi udføres uden yderligere LPS-provokationen og lige efter akut behandling med fluoxetin intraperitonealt 2 timer før kirurgi. Her kan vi se højere antal fast adhærerende leukocytter og lavere rullende hastighed i fluoxetin-behandlede mus, hvilket indikerer en påvirkning af akut fluoxetin behandling på leukocyt-endotel-interaktioner 8.
I figur 4 blodplade-leukocyt-interaktioner under lipopolysaccharid induceret peritonitis visualiseres i en vene. Blodplader rosettering omkring leukocytterne og disse komplekser interagerer med karvæggen.
Figur 1. Oversigt over eksperimentelle indstillinger. (A) En bedøvede mus med eksterioriseret ileum-loop og dens mesenterium fartøjer (sort pil). (B) Intravital mikroskop med tilføjet mus (rød pil) under den omhandlede (sort pil). Lyskilde (sort pilespids) og kamera (rød pilespids) er markeret. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Intravital Microscopy Efter 3-ugers Administration af fluoxetin til vildtypemus enten med eller uden LPS Challenge. Modificeret fra 7 (A) Antal rullende leukocytter uden LPS-stimulering. (B) Leukocyt hastighed uden LPS-stimulering. (C) Antal fast adhærerende leukocytter uden LPS-stimulering.(D) Eksempel på et fartøj af en ubehandlet WT mus uden LPS udfordring. (E) Eksempel på et fartøj af et fluoxetin-behandlede mus uden LPS udfordring. (F) Antal rullende leukocytter efter LPS-stimulering. (G) Leukocyt hastighed efter LPS-stimulering. (H) Antal fast adhærerende leukocytter efter LPS-stimulering. (I) Eksempel på et fartøj af en ubehandlet WT mus efter LPS-udfordring. (J) Eksempel på et fartøj af et fluoxetin-behandlede mus efter LPS udfordring. Scale bar = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Intravital Microscopy Efter akut Fluoxetin Challenge 2 timer før kirurgi medud LPS Challenge. Modificeret fra 8 A) Antal rullende leukocytter uden LPS-stimulering. B) Leukocyt hastighed uden LPS-stimulering. C) Antal fast adhærerende leukocytter uden LPS-stimulering. D) Eksempel på et fartøj af en ubehandlet WT mus uden LPS udfordring. E) Eksempel på et fartøj af en akut fluoxetin-behandlede mus uden LPS udfordring. Scale bar = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:. Blodplade-leukocyt Interaktioner in vivo Klik her for at se en større version af dette tal.
Repræsentativt billede af blodplade-leukocyt interhandlinger i mus in vivo under lipopolysaccharid induceret peritonitis i venerne. Genoptryk fra 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Heri beskrives forberedelsen og udførelsen af intravital mikroskopi af mesenterium vener i mus in vivo. Denne metode giver os mulighed for at observere leukocyt-endotel og blodplader-endotel interaktioner 11 direkte i den levende organisme.
Som en tidlig reaktion på betændelse endotelet bliver aktiveret, og interagerer med leukocytter og blodplader resulterer i rullende, vedhæftning og transmigration 12. Men leukocytter også interagere med blodplader danner såkaldte, trombocyt-leukocyt-komplekser, overvejende trombocyt-neutrofile komplekser (PNCs) og blodplade-monocyt komplekser (PMCs) 13,14 .Disse interaktioner kan observeres og kvantificeres i denne metode.
Derudover Denne teknik tillader at undersøge endothel aktivering med markører såsom VCAM-1 eller ICAM-1 (f.eks efter blodplade / leukocyt-interaktioner) 15.
Den fysisk stimulus af selve proceduren forårsager en vis grad af endotel aktivering, hvilket fører til synlige rulning af leukocytter (men næsten ingen langsom rulning og ingen faste adhæsion). Dette indebærer, at undersøgeren skal håndtere mesenterium med stor omhu. Hvis der er for meget aktivering forårsaget af rå håndterer det vil resultere i forhøjede antal rullende og adhærerende leukocytter. For at nå en reproducerbar antal 30-80 rullende leukocytter per minut i vildtypemus eksaminator skal trænes.
Blokering af P-selectin / PSGL-interaktion kunne tjene som en kontrol for at bekræfte interaktionen af leukocytter med endotel. Det udelukker, at leukocytter passivt er "knyttet" til endotel, et scenario, der kan opstå, hvis blodgennemstrømningen er stærkt reduceret.
Mesenterium kardiameter spænder ca. 200-300 um. Derfor er denne metode ikke er egnet til at vurdere mikrocirkulationen i kapillærer, men fokusererpå leukocyt-endotel interaktioner i små, betændte vener, det primære sted for transmigration af leukocytter. Sammenlignet med andre intra-vitalmikroskopi metoder såsom cremaster model, denne metode er lettere at lære og kan udføres i et kortere tidsrum.
Et af de vigtigste begrænsninger ved denne fremgangsmåde er, at musene skal være unge uden meget mesenterium fedt at have en god udsigt i karrene, således at denne fremgangsmåde ikke kan udføres efter lange fodrings- eller behandlingsundersøgelser.
Når sagsbehandleren er uddannet, kan forskellige inflammatoriske tilstande undersøges med denne metode, såsom anvendelsen af LPS, thioglycollat, TNF eller histamin. Mere specifik billeddannelse af bestemte blodceller kan opnås ved hjælp af målrettede fluorescerende mærkede molekyler. Samlet set er denne metode er let at lære og en hurtig måde at undersøge leukocyt-endotel og blodplade-leukocyt interaktioner i en levende organisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 989-38-8 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5 | Sigma-Aldrich | L2637 |
References
- Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells. Methods in enzymology. 300, 462-481 (1999).
- Atherton, A., Born, G. V. Quantitative investigations of the adhesiveness of circulating polymorphonuclear leucocytes to blood vessel walls. The Journal of physiology. 222, 447-474 (1972).
- Duerschmied, D., et al. Serotonin stimulates platelet receptor shedding by tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme (ADAM17). Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 7, 1163-1171 (2009).
- Chauhan, A. K., et al. ADAMTS13: a new link between thrombosis and inflammation. The Journal of experimental medicine. 205, 2065-2074 (1084).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvascular research. 5, 384-394 (1973).
- Leister, I., et al. A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum. Surgical endoscopy. 17, 939-942 (2003).
- Duerschmied, D., et al. Platelet serotonin promotes the recruitment of neutrophils to sites of acute inflammation in mice. Blood. 121, 1008-1015 (2013).
- Herr, N., et al. Acute fluoxetine treatment induces slow rolling of leukocytes on endothelium in mice. PloS one. 9, e88316 (2014).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab animal. 40, 155-160 (2011).
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab animal. 37, 26-32 (2008).
- Duerschmied, D., Bode, C., Ahrens, I. Immune functions of platelets. Thrombosis and haemostasis. 112, 678-691 (2014).
- Wagner, D. D., Frenette, P. S. The vessel wall and its interactions. Blood. 111, 5271-5281 (2008).
- Gawaz, M., Fateh-Moghadam, S., Pilz, G., Gurland, H. J., Werdan, K. Platelet activation and interaction with leucocytes in patients with sepsis or multiple organ failure. European journal of clinical investigation. 25, 843-851 (1995).
- Sarma, J., et al. Increased platelet binding to circulating monocytes in acute coronary syndromes. Circulation. 105, 2166-2171 (2002).
- Sumagin, R., Sarelius, I. H. TNF-alpha activation of arterioles and venules alters distribution and levels of ICAM-1 and affects leukocyte-endothelial cell interactions. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 291, H2116-H2125 (2006).
