Abstract
活体显微镜是一种可用于研究在不同的区域在活的动物不同的工艺和容器的方法。在这个协议中，我们描述肠系膜静脉的活体显微镜。这可以在时间与重复的结果示出在体内白细胞-内皮相互作用短时间内进行。我们描述了内皮的LPS攻击后的炎性设置。但在此模型中可以应用许多不同类型的炎性病症，如细菌，化学或生物和调查药物的给药以及它们对活的动物直接影响及其对白细胞募集的影响。此协议已被成功地应用到了许多小鼠和它们对血管炎症反应的影响的不同处理。在此，我们描述了通过荧光罗丹明6G标记这些白细胞和血小板的可视化。另外，任何特定的成像可以是PErformed使用有针对性的荧光标记分子。
Introduction
此协议的目的是描述在活的小鼠的炎症性条件下直接观察的白细胞 - 内皮和白细胞 - 血小板相互作用肠系膜静脉的活体显微镜的简化技术。
活体显微镜的开发是为了研究炎性病症1,2，这是不平凡的，但重要的是理解的炎性白细胞募集和作用下在体内白细胞-内皮相互作用。在这个协议中，我们描述了一种基于此前公布的出版物开发。类似于可视化血小板结合在越来越血栓3和平行于什么已经公布早4，形象化肠系膜静脉通过透射光显微镜检查。也有内部的重要显微镜等各种模式，如大鼠5或小鼠肝和大鼠6的提睾肌。
肠系膜静脉的活体显微镜已经开发和由几组在以前的研究中的应用。我们已经用这种方法来观察在野生型小鼠和色氨酸hydroxylase1（TPH1）之间白细胞募集的差异 - / - 小鼠，这是不足型非神经元血清素和比较结果，以小鼠的血小板血清素药理学由长期贫应用的选择性血清素再摄取抑制剂氟西汀7。我们也研究白细胞-内皮相互作用后急性氟西汀治疗8。
在这个协议中，我们集中在肠系膜静脉的活体显微镜，因为该模型可迅速地进行，并允许白细胞 - 内皮和血小板白细胞相互作用测量值有效。这是更大的挑战和耗时在其他器官，如骨，肝，皮肤，或提睾肌的活体显微镜。该模式升这里描述是具有炎性刺激物，如腹腔内注射脂多糖challengeing后的理想的炎性细胞 - 细胞相互作用的重现性的评价。
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Protocol
所有的动物实验均遵照执行与德国动物保护法（TierSchG）。小鼠安置，并按照良好的动物的做法来处理由FELASA（www.felasa.eu/guidelines.php）和国家动物福利的身体GV-SOLAS（www.gv-solas.de/index.html）定义。弗莱堡大学的动物福利委员会以及地方当局（Regierungspräsidium弗赖堡）批准的所有动物实验。
1.动物处理，制备和炎症的感应
- 使用4 - 6的周龄雄性小鼠的16重量范围 - 20克。注意：如果老鼠是老年人或较重他们目前周围血管过多的脂肪，限制了显微观察。
- 所有消毒手术前的工具和显微镜下。
- 注射20mg / kg的LPS（脂多糖）腹膜内4至镜检到活小鼠以诱导细菌inflamm事先小时通货膨胀。
- Prewarm在水浴0.9％盐水溶液在37℃下加湿的塑料腔室和肠系膜组织。
- 麻醉小鼠腹腔注射氯胺酮（100毫克/千克）和赛拉嗪（5毫克/千克）的显微镜过程之前。替代麻醉可以使用， 例如，2％异氟醚吸入。确认正确通过麻醉响应反射性刺激（或趾掐尾以坚定的压力）的损失。
- 用剃须刀脱毛腹部并取出松散的头发用纱布用70％乙醇饱和。
- 适用于鼠标的眼睛兽医药膏，以防止干燥，而在麻醉下。
2.手术
- 消毒用70％的乙醇的腹部。此方法不是无菌的方法和可能是致命的在实验结束。
- 执行中位数剖腹探查：用小的，弯曲的镊子和小剪刀打开腹部皮肤。确定外延gastrical船只和白线的区域打开腹膜，保护血管。
- 申请几滴预热盐水进入腹腔，以保持组织湿润。
- 标签白细胞和血小板的荧光通过注入50μl的罗丹明6G作为9,10-之前所述（1毫克/毫升）眼眶。
- Exteriorize ileumand地方它的环中，其直径为10cm的培养皿，并确保通过将37℃，以保持组织湿润预热生理盐水溶液（0.9％），每隔一分钟。
3.活体显微镜
- 放置鼠标在显微镜下，把肠系膜静脉的直径为200 - 在视中心300微米。选择没有看得见的脂肪周围的船只。
- 请勿触摸肠系膜血管从而避免了血管内皮细胞的刺激。谨慎处理回肠循环。
- 可视化血细胞内皮相互作用与一个倒置或直立显微镜和用显微镜软件的相机。记录血液中的每只小鼠4个不同的脉1分钟的细胞内皮的相互作用。
- 完成成像实验安乐死后的小鼠颈椎脱位。
4.分析
- 分析离线贯彻和蒙蔽所有参数。使用任何合适的软件程序进行分析。
- 确认稳定interindividually可比的血流状况高时间分辨率电影，短片（最大帧速率）专注于管腔内血细胞流动。
- 量化轧制白细胞数。为此提请通过静脉的垂直线和计数越过这条线在1分钟内所有的白细胞。
- 通过测量一个单一的白细胞需要传递的50微米的距离，而稳定的滚动内皮细胞上的时间确定滚动速度。要做到这一点，画两条垂直线在50微米吨的距离hrough静脉。
- 测量一个代表白细胞需要从一行除以50微米通过所需要的时间（微米/秒）以获得到other.Calculate白细胞的速度的时间。
- 测量白细胞粘附在0.04 mm 2的字段。要做到这一点，绘制边长为200微米到静脉广场。
- 算上牢固粘附白细胞，定义为不可见的运动进行30秒，这个正方形内。
- 计数血小板绑定到一个白细胞量化血小板白细胞相互作用的次数。
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Representative Results
在这个协议中所描述的实验设置的概述示于图1，它显示了一个鼠标与形象化回肠环和其容器，其可以在活体显微镜进行观察。 图2显示了一定程度的活化在未治疗的动物由于该过程本身。但几乎不存在慢滚动或白细胞相比LPS处理的小鼠的牢固粘结。 图2还示出了活体显微镜在野生型小鼠无论是与氟西汀在饮用水或未经处理的小鼠治疗3周。 图2A-的不同的结果C示出没有任何进一步的炎症挑战与LPS的结果，而小鼠在图2F-H用LPS另外处理。在这里，我们可以看到更高的数字滚动和粘附白细胞，同时滚动速度LPS刺激后下降。通过这些实验，我们可以表明，五羟色胺血小板为crucial为白细胞募集的炎症7的初始步骤。
在图3中，而无需进一步LPS攻击，只是后腹膜内2小时在手术前用氟西汀急性治疗，进行活体显微镜。在这里我们可以看到更高的数字牢牢粘附白细胞和更低的滚动速度在氟西汀治疗的小鼠，表明急性治疗氟西汀对白细胞-内皮相互作用8的影响。
在图中的脂多糖诱导性腹膜炎4血小板白细胞相互作用静脉内显现。血小板玫瑰花结周围的白细胞和这些复合物与血管壁相互作用。
图中的实验设置1.概述。 >（A）的麻醉鼠标形象化回肠环路及其系膜血管（黑色箭头）。 （B）的活体显微镜放置鼠标（红色箭头）的目标（黑色箭头）下方。光源（黑色箭头）和相机（红色箭头）标记。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.活体显微镜经过3周的管理氟西汀对野生型小鼠无论有或没有LPS挑战。从滚动白细胞7（A）号修改而不LPS刺激。 （ 二）白细胞速度没有LPS刺激。牢牢粘附白细胞无LPS刺激（C）的数量。（四）未经处理的WT鼠标无LPS刺激血管的例子。 （E）氟西汀治疗的小鼠没有LPS刺激血管的例子。滚动白细胞（F）数LPS刺激后。 （G）LPS刺激后白细胞速度。对LPS刺激后紧紧贴壁的白细胞（H）的数量。 （Ⅰ）的未处理的WT小鼠LPS攻击后的容器的实施例。氟西汀处理的小鼠LPS攻击后的容器（J）的实施例。比例尺= 100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：活体显微镜后急性氟西汀挑战2小时之前手术出LPS挑战。从8的改进）滚动白细胞数目没有LPS刺激。 B）白细胞速度没有LPS刺激。牢牢粘附白细胞没有LPS刺激C）的数量。 D）未经处理的WT鼠标无LPS刺激血管的例子。 E）急性氟西汀治疗的小鼠没有LPS刺激血管的例子。比例尺= 100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4： 在体内的血小板白细胞相互作用 请点击此处查看该图的放大版本。
血小板白细胞间代表图片期间脉脂多糖诱导性腹膜炎小鼠体内的行动。从11再版。
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Discussion
在这里，我们描述了准备和小鼠体内的肠系膜静脉活体显微镜的性能。这种方法使我们有机会直接在活的有机体观察白细胞，内皮细胞和血小板内皮细胞相互作用11。
作为早期对炎症的反应内皮被激活，并与白细胞和血小板产生的滚动，粘附和轮回12相互作用。但白细胞也与血小板形成所谓的相互作用，血小板白细胞复合物，主要是血小板中性粒复合物（PNCS）和血小板单核配合物（两局）13,14。这些相互作用可以观察和量化在此方法。
另外，该技术允许调查内皮活化与像VCAM-1或ICAM-1的标记物（ 例如，血小板/白细胞相互作用后）15。
该过程本身的物理刺激引起一定程度的内皮细胞活化，这导致白细胞可见轧制（但几乎没有缓慢滚动，没有牢固的粘合）。这意味着考官需要处理非常谨慎的肠系膜。如果存在由粗引起处理它会导致升高的号码轧制和粘附白细胞过多活化。达到30可再现数目 - 80每分钟轧制白细胞在野生型小鼠审查员已被训练。
P-选择/ PSGL-相互作用的堵塞可以作为一个控制确认白细胞与内皮的相互作用。它排除了该白细胞被被动地“附加”到内皮，如果血流量大大减少可能发生的一个场景。
肠系膜血管直径范围从约200 - 300微米。因此，这种方法不适合于评估微循环中的毛细血管，但重点在小静脉发炎，白细胞轮回的主要场所白细胞 - 内皮相互作用。相比其他帧内活体显微镜方法如睾模型，这种方法是更容易学习，并且可以在较短的时间周期来执行。
一个该方法的最重要的限制是，小鼠需要年轻没有太多肠系膜脂肪有一个良好的观点进血管，所以，这种方法不能长期喂养或治疗研究之后进行。
一旦审查员被训练，不同炎性病症可以检查用这种方法，如应用的LPS，巯基乙酸，TNFα或组胺。特定的血细胞的更具体的成像可通过使用靶向荧光标记的分子来实现。总体而言，该方法是简单易学和一个快速的方法来检查在活生物体白细胞 - 内皮和血小板白细胞相互作用。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 989-38-8 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5 | Sigma-Aldrich | L2637 |
References
- Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells. Methods in enzymology. 300, 462-481 (1999).
- Atherton, A., Born, G. V. Quantitative investigations of the adhesiveness of circulating polymorphonuclear leucocytes to blood vessel walls. The Journal of physiology. 222, 447-474 (1972).
- Duerschmied, D., et al. Serotonin stimulates platelet receptor shedding by tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme (ADAM17). Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 7, 1163-1171 (2009).
- Chauhan, A. K., et al. ADAMTS13: a new link between thrombosis and inflammation. The Journal of experimental medicine. 205, 2065-2074 (1084).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvascular research. 5, 384-394 (1973).
- Leister, I., et al. A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum. Surgical endoscopy. 17, 939-942 (2003).
- Duerschmied, D., et al. Platelet serotonin promotes the recruitment of neutrophils to sites of acute inflammation in mice. Blood. 121, 1008-1015 (2013).
- Herr, N., et al. Acute fluoxetine treatment induces slow rolling of leukocytes on endothelium in mice. PloS one. 9, e88316 (2014).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S.
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab animal. 37, 26-32 (2008).
- Duerschmied, D., Bode, C., Ahrens, I.
- Wagner, D. D., Frenette, P. S. The vessel wall and its interactions. Blood. 111, 5271-5281 (2008).
- Gawaz, M., Fateh-Moghadam, S., Pilz, G., Gurland, H. J., Werdan, K. Platelet activation and interaction with leucocytes in patients with sepsis or multiple organ failure. European journal of clinical investigation. 25, 843-851 (1995).
- Sarma, J., et al. Increased platelet binding to circulating monocytes in acute coronary syndromes. Circulation. 105, 2166-2171 (2002).
- Sumagin, R., Sarelius, I. H. TNF-alpha activation of arterioles and venules alters distribution and levels of ICAM-1 and affects leukocyte-endothelial cell interactions. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 291, H2116-H2125 (2006).
