Abstract
생체 내에 현미경 살아있는 동물에서 다른 상이한 영역에서의 프로세스와 혈관을 조사하는데 사용될 수있는 방법이다. 이 프로토콜에서는, 우리는 장간막 정맥의 생체 내에 현미경을 설명합니다. 이는 생체 내에서 내피 백혈구 작용을 도시 재현 결과 단시간에 행할 수있다. 우리는 내피 세포의 LPS 도전 후 염증 설정을 설명합니다. 그러나이 모델에 하나, 세균 화학 또는 생물학적 같은 염증성 질환의 많은 다른 유형을 적용하고 약물의 관리 및 살아있는 동물에 미치는 직접 효과와 백혈구 채용에 미치는 영향을 조사 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 마우스 및 혈관 염증 반응에 미치는 영향의 다른 치료의 숫자에 성공적으로 적용되고있다. 여기서, 우리는 형광 로다 민 6G 이러한 레이블에 의해 백혈구 및 혈소판의 시각화를 설명합니다. 또한, 특정 영상은 PE 될 수 있습니다대상 형광 표지 된 분자를 사용하여 rformed.
Introduction
이 프로토콜의 목적은 염증 조건에서 백혈구 - 내피 백혈구 및 혈소판의 상호 작용의 직접적인 관찰을 위해 쥐를 거주 장간막 정맥의 생체 내에 현미경의 간략화 된 기법을 설명하기위한 것이다.
생체 내에 현미경은 염증 백혈구 모집 및 기능을 이해하는 사소한하지만 중요하지 않은 염증성 질환 1, 2에서 생체 내에서 백혈구 - 내피 상호 작용을 연구하기 위해 개발되었다. 이 프로토콜에서 우리가 설명하는 방법은 이전에 발행 된 출판물을 기반으로 개발되었다. 발표 된 내용에 성장 혈전 3 병렬로 혈소판 통합을 시각화 유사 이전 4 표면화 장간막 정맥은 투과광 현미경으로 검사한다. 이러한 쥐 5 마우스의 간 및 쥐 (6)의 cremaster 근육으로 내 생명 현미경의 다양한 모델이 있습니다.
장간막 정맥의 생체 내에 현미경이 개발되고 여러 그룹에 의해 이전의 연구에 적용되어왔다. - / - 누구의 혈소판 세로토닌 약리학 장기 고갈 된 쥐에 연구 결과 비 신경 세로토닌의 결핍과 비교 마우스, 우리는 야생형 마우스 및 트립토판의 hydroxylase1 (Tph1) 사이의 백혈구 모집의 차이를 관찰하기 위해이 기술을 사용했다 애플리케이션 선택적 세로토닌 재 흡수 억제제 인 플루옥세틴 7. 우리는 또한 급성 플루옥세틴 치료 (8) 후 백혈구 - 내피 상호 작용을 조사 하였다.
이 모델은 신속하게 수행하고, 백혈구 - 내피 백혈구 및 혈소판의 상호 작용의 유효 측정을 허용 할 수 있기 때문 프로토콜에서는, 장간막 정맥의 생체 내에 초점 현미경. 이것은 훨씬 더 어렵고 시간이 소요되는 등의 뼈, 간, 피부, 근육 등 cremaster 또는 다른 장기의 생체 내에 현미경이다. 모드여기에 설명 된 L은 리포 폴리 사카 라이드의 복강 내 주사로 염증 자극, 그것을 challengeing 후 염증 세포 - 세포 상호 작용의 재현성 평가에 이상적입니다.
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Protocol
모든 동물 실험은 독일의 동물 보호 법률 (TierSchG)을 준수 하였다. FELASA (www.felasa.eu/guidelines.php) 및 국가 동물 복지 몸 GV-SOLAS (www.gv-solas.de/index.html)에 의해 정의 된 마우스는 보관과 좋은 동물 관행에 따라 처리되었다. 프라이 부르크 대학의 동물 복지위원회뿐만 아니라 지방 자치 단체 (Regierungspräsidium 프라이 부르크)는 모든 동물 실험을 승인했다.
1. 동물 취급, 준비 및 염증의 유도
- 16-20g의 무게 범위 6 주령의 수컷 마우스 - 4를 사용합니다. 참고 : 마우스는 이전 또는 무거운 경우가 현미경 관찰을 제한, 선박을 둘러싼 과도한 지방을 제시한다.
- 수술에 앞서 모든 도구와 현미경 테이블을 소독.
- 주사 20 ㎎ / ㎏ LPS (리포 폴리 사카 라이드) 복강 4 세균 inflamm을 유도하는 생활 마우스로는 현미경하기 전에 시간ATION.
- 플라스틱 챔버 및 장간막 조직 가습 37 ℃에서 수조에서 0.9 % 식염수 Prewarm.
- 바로 현미경 절차 전에 복강 케타민 주사 (100 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (5 ㎎ / ㎏)와 마우스를 마취. 대안 마취는, 예를 들면, 2 % 이소 플루 란 흡입을 사용할 수있다. 반사 자극 (회사의 압력과 발가락 또는 꼬리 핀치)에 응답의 손실에 의한 적절한 마취를 확인합니다.
- 면도기를 사용하여 복부를 털을 뽑다 에탄올 70 %로 포화 거즈로 느슨하게 머리를 제거합니다.
- 마취 동안 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈에 수의사 연고를 적용합니다.
2. 수술
- 70 % 에탄올을 사용하여 복부 멸균. 이 방법은 멸균 방법 아니며 실험의 마지막에 치명적일 수있다.
- 중간 개복술을 수행 작은 곡선 집게와 작은 가위를 사용하여 복부 피부를 엽니 다. 에피을 확인gastrical 용기는 용기를 보호하기 위해, 원격 교육 알바의 영역에서 복막을 열고.
- 습윤 티슈 유지 복강 데워진 식염수 몇 방울을 적용한다.
- 형광 50 μL의 로다 민 6G 9, 10 전에 설명 된 바와 같이 역 궤도 (1 ㎎ / ㎖)을 주입하여 라벨 백혈구 및 혈소판.
- 10cm의 직경을 갖는 페트리 디쉬에 ileumand 장소 그것의 외면 화하다 루프 및 37 ° C를 도포하여 습윤 티슈 유지 확인은 식염수 (0.9 %), 다른 모든 순간 데워진.
3. 생체 내에 현미경
- 현미경 아래에 마우스를 위치시키고 (200)의 직경과 장간막 정맥을 가지고 - 뷰의 중심에서 300 μm의. 눈에 보이는 지방 환경과 용기를 선택합니다.
- 하여 내피 세포의 자극을 피 장간막 혈관을 만지지 마십시오. 조심스럽게 회장 루프를 처리합니다.
- 혈액 세포 내피 상호 작용을 시각화반전 또는 직립 현미경 및 현미경 소프트웨어를 사용하여 카메라. 녹음 혈액 마우스 당 4 개의 정맥에 1 분 동안 세포 내피 세포의 상호 작용.
- 촬상 실험 종료 후 경추 탈구하여 마우스를 안락사.
4. 분석
- 분석 오프라인을 수행하고 모든 매개 변수에 대한 눈을 멀게. 임의의 적합한 소프트웨어 프로그램을 사용하여 분석을 수행.
- 관내 피 세포의 흐름에 집중 높은 시간 해상도 씨네 클립에서 안정하고 interindividually 필적 혈류 상태 (최대 프레임 율)을 확인한다.
- 롤링 백혈구의 수를 정량화. 그 때문에 정맥을 통해 수직선을 그리고 1 분에이 선을 넘어 모든 백혈구를 계산합니다.
- 하나의 백혈구가 안정적으로 내피 세포에 롤링 동안 50 ㎛의 거리를 통과하는 데 필요한 시간을 측정하여 회전 속도를 결정합니다. 이 작업을 수행하려면, 50 μm의 t의 거리에 두 개의 수직 라인을 그릴정맥 hrough.
- 대표적인 백혈구 필요한 시간 (μm의 / s)으로 50 μm의 분할함으로써 other.Calculate 한 행에서 백혈구의 속도를 얻기 위해 필요한 시간을 측정한다.
- 0.04 mm (2)의 필드에 백혈구 부착을 측정한다. 이를 위해, 정맥에 200 ㎛, 변의 길이와 사각형을 그린다.
- 이 광장 내에서 30 초 동안 눈에 보이는 운동으로 정의 된 회사 부착 백혈구, 계산합니다.
- 혈소판, 백혈구 작용을 정량화하는 하나의 백혈구 결합 혈소판의 개수를 카운트.
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Representative Results
이 프로토콜에 설명 된 실험 환경의 개요가도 1에 도시되어있다. 이것은 생체 내에 현미경에서 관찰 할 수 표면화 회장 루프 및 그 용기와 마우스를 보여준다.도 2 인해 미처리 동물에서 활성화의 어느 정도를 나타낸다 절차 자체. 그러나 거의 느린 압연 또는 LPS 처리 쥐에 비해 백혈구의 회사 접착이있다. 또한 야생형 마우스 중 마시는 물이나 치료 쥐 3 주 동안 플루옥세틴 처리 하였다. 그림 2A-에서 생체 내에 현미경의 다른 결과를 보여줍니다 그림 2 도 2F-H에 추가하여 마우스를 LPS로 처리하면서, LPS와 더 염증성 도전없이 결과를 표시 하였다. 회전 속도가 LPS 도전 후 감소하는 동안 여기에서 우리는, 압연 및 부착 백혈구의 높은 숫자를 볼 수 있습니다. 이 실험을 통해 우리는 혈소판의 세로토닌이 C 것을 보여줄 수염증 7 백혈구 모집의 초기 단계를 rucial.
그림 3에서, 생체 내에 현미경은 더 LPS 도전하지 않고, 단지 복강 2 시간 전에 수술 플루옥세틴 급성 치료 후 시행 하였다. 여기에서 우리는 백혈구 - 내피 상호 작용 8 급성 플루옥세틴 치료의 영향을 나타내는 단단히 부착 백혈구 및 플루옥세틴 처리 생쥐의 낮은 회전 속도의 높은 숫자를 볼 수 있습니다.
그림에서 리포 다당류에 의한 복막염 동안 4 혈소판 백혈구 상호 작용은 정맥 내 시각입니다. 혈소판은 백혈구 주위 로제트 형성되고 이들 착물은 용기 벽과 상호 작용한다.
실험 설정 1. 개요를 그림. (B)를 배치 마우스 (빨간색 화살표)와 생체 내에 현미경. 광원 (검은 색 화살표)와 카메라 (빨간색 화살표)로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 생체 내에 현미경 또는 LPS에 도전한다. LPS 자극없이 롤링 백혈구의 7 (a) Number에서 수정없이 어느 야생형 마우스에 플루옥세틴의 3 주 투여 후. LPS 자극없이 (B) 백혈구 속도. LPS 자극없이 단단히 부착 백혈구의 (C) 수.(D) LPS 챌린지없이 WT 비 처리 된 마우스의 혈관의 예. (E) LPS 챌린지없이 플루옥세틴 처리 된 마우스의 혈관의 예. LPS 자극 후 롤링 백혈구 (F) 수. LPS 자극 후 (G) 백혈구 속도. LPS 자극 후 단단히 부착 백혈구 (H) 수. (I) LPS 챌린지 후의 WT 비 처리 된 마우스의 혈관의 예. LPS 도전 후 플루옥세틴 처리 된 마우스의 용기 (J) 예. 스케일 바 = 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 생체 내에 현미경 수술에 급성 플루옥세틴 도전 2 시간 전 후LPS에 도전한다. 8에서 수정 된) LPS 자극없이 롤링 백혈구의 수는 부족합니다. LPS 자극없이 B) 백혈구 속도. LPS 자극없이 단단히 부착 백혈구 C) 수. D) LPS 챌린지없이 WT 비 처리 된 마우스의 혈관의 예. E) LPS 도전없이 급성 플루옥세틴 처리 된 마우스의 선박의 예. 스케일 바 = 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 :. 생체 내에서 혈소판 - 백혈구 상호 작용 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
혈소판 백혈구 간 대표 사진혈관에 지질 다당류에 의한 복막염 동안 생체 내에서 마우스 액션. (11)에서 다시 인쇄.
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Discussion
여기에서 우리는 준비 및 생체 내에서 쥐의 장간막 정맥의 생체 내에 현미경의 성능을 설명합니다. 이 방법은 우리에게 살아있는 유기체에 직접 백혈구가 내피 세포와 혈소판 내피 세포의 상호 작용 (11)을 관찰 할 수있는 기회를 제공합니다.
내피 세포를 염증 초기 반응으로 활성화됩니다 압연, 접착력과 윤회 (12)의 결과 백혈구 및 혈소판과 상호 작용한다. 그러나 백혈구는 혈소판이 소위 형성하는 상호 작용, 혈소판, 백혈구 단지, 주로 혈소판 - 호중구 단지 (PNCs) 및 혈소판 - 단핵구 단지 (PMCS) 13, 14 .These 상호 작용이 관찰이 방법으로 정량화 할 수있다.
또한이 기술은 (혈소판 / 백혈구 작용 후의 예) VCAM-1, ICAM-1과 같은 마커 내피의 활성화 (15)을 조사 허용한다.
절차 자체의 물리적 자극은 백혈구의 볼 롤링 (그러나 거의 느린 압연 및 확고한 접착)로 연결 내피 세포 활성화의 어느 정도를 발생합니다. 이 심사관은 큰 관심과 장간막을 처리 할 필요가 있다는 것을 의미한다. 그것은 압연 및 부착 백혈구의 높은 숫자가 발생합니다 처리 원유에 의한 너무 많이 활성화가됩니다. (30)의 재생 가능한 수에 도달하기 위해 - 야생형 생쥐에서 심사관을 분당 80 회전 백혈구하는 훈련을해야합니다.
P 셀렉틴 / PSGL-상호 작용의 막힘은 내피 세포와 백혈구의 상호 작용을 확인하는 제어부로서 기능 할 수있다. 이것은 백혈구 수동적, 내피로의 혈류가 크게 감소하는 경우 발생할 수있는 시나리오를 "부착"되는 것을 배제한다.
300㎛ 인 - 장간막 혈관 직경은 약 200의 범위이다. 따라서,이 방법에서 미세 모세관을 평가하기에 적합하지 않지만 집중작은 염증 정맥, 백혈구의 윤회에 대한 기본 장소에서 백혈구 - 내피 상호 작용에 대한. 이러한 cremaster 모델과 같은 다른 인트라 중요한 현미경 방법에 비해,이 방법을 배우고 짧은 시간주기에서 수행 될 수 쉽다.
이 방법의 가장 중요한 제약 중 하나는 마우스는이 방법이 오랫동안 연구 급송 또는 치료 후에 수행 될 수 없도록, 혈관으로 좋은 볼을 가지고 많은 장간막 지방없이 어린 될 필요가있다.
심사관이 훈련되면, 다른 염증 상태는 이러한 LPS의 응용 프로그램, 티오 글리콜 레이트, TNFα 또는 히스타민으로,이 방법으로 검사 할 수 있습니다. 특히 혈액 세포의보다 구체적인 촬상 대상이 형광 표지 된 분자를 사용하여 달성 될 수있다. 전반적으로,이 방법은 쉽게 배울 수 및 살아있는 유기체에서 백혈구 - 내피 세포와 혈소판 백혈구의 상호 작용을 조사하는 빠른 방법입니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 989-38-8 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5 | Sigma-Aldrich | L2637 |
References
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