Abstract
Microscopia intravitale è un metodo che può essere utilizzato per studiare processi diversi in diverse regioni e vasi negli animali viventi. In questo protocollo, si descrive la microscopia intravitale delle vene mesentere. Questo può essere eseguito in un breve periodo di tempo con risultati riproducibili mostrano interazioni leucociti-endotelio in vivo. Descriviamo un ambiente infiammatorio dopo LPS sfida dell'endotelio. Ma in questo modello si può applicare diversi tipi di patologie infiammatorie, come batteri, chimica o biologica e indagare la somministrazione di farmaci e dei loro effetti diretti sul animale vivente e il suo impatto sul reclutamento dei leucociti. Questo protocollo è stato applicato con successo per un certo numero di diversi trattamenti di topi ei loro effetti sulla risposta infiammatoria nei vasi. Qui, si descrive la visualizzazione dei leucociti e piastrine etichettando fluorescente questi con rodamina 6G. Inoltre, qualsiasi immagini specifico può essere performed utilizzando mirati molecole fluorescente.
Introduction
Lo scopo di questo protocollo è quello di descrivere una tecnica semplificata della microscopia intravitale delle vene mesentere in topi viventi per l'osservazione diretta di interazioni leucociti-endoteliale e leucociti-piastrine in condizioni infiammatorie.
Microscopia intravitale è stato sviluppato per studiare le interazioni leucociti-endotelio in vivo in condizioni infiammatorie 1,2, che non è banale, ma importante per la comprensione infiammatorio reclutamento e la funzione dei leucociti. Il metodo che descriviamo in questo protocollo è stato sviluppato sulla base di pubblicazioni precedentemente pubblicati. Simile alla visualizzazione piastrinica incorporazione in un trombo crescente 3 e parallelo a quello che è stato pubblicato in precedenza 4, un mesentere vena esteriorizzato viene esaminato al microscopio luce trasmessa. Ci sono vari altri modelli di microscopia intra-vitale, come il muscolo cremastere di ratti 5 o al fegato di topo e ratti 6.
Microscopia intravitale di mesentere vena è stata sviluppata e applicata in precedenti studi da diversi gruppi. Abbiamo usato questa tecnica per osservare le differenze nel reclutamento dei leucociti tra topi wild-type e triptofano hydroxylase1 (TPH1) - / - topi, che sono carenti di serotonina non neuronale e confrontato i risultati al topo il cui serotonina piastrinica è stata farmacologicamente impoverito da a lungo termine la domanda di un inibitore selettivo della ricaptazione della serotonina fluoxetina 7. Abbiamo anche esaminato le interazioni leucociti-endotelio dopo il trattamento con fluoxetina acuta 8.
In questo protocollo ci concentriamo sulla microscopia intravitale di vene mesentere, perché questo modello è possibile eseguire in modo rapido, e consente misure valide di interazioni leucociti-endotelio e piastrine-leucociti. Questo è molto più difficile e in microscopia intravitale di altri organi, come le ossa, fegato, pelle, o muscolo cremastere richiede tempo. La modal qui descritto è ideale per la valutazione riproducibile di interazione cellula-cellula infiammatoria dopo stimolante con uno stimolo infiammatorio, come l'iniezione intraperitoneale di lipopolisaccaride.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità alla legge sulla protezione degli animali tedesca (TierSchG). I topi sono stati alloggiati e trattati in conformità alle buone pratiche di origine animale come definito da FELASA (www.felasa.eu/guidelines.php) e il corpo al benessere degli animali nazionale GV-SOLAS (www.gv-solas.de/index.html). Il comitato benessere degli animali dell'Università di Friburgo, così come le autorità locali (Regierungspräsidium Freiburg) ha approvato tutti gli esperimenti su animali.
1. Animal Handling, Preparazione e induzione di infiammazione
- Utilizzare 4-6 settimane di età topi maschi con una gamma di peso di 16 - 20 g. Nota: se i topi sono più vecchi o più pesante che presentano grasso eccessivo che circonda la nave, limitando l'osservazione microscopica.
- Sterilizzare tutti gli strumenti e tavolo microscopio prima di un intervento chirurgico.
- Iniettare 20 mg / kg LPS (lipopolisaccaride) per via intraperitoneale 4 ore prima di microscopia nel mouse vivente di indurre un inflamm battericazione.
- Preriscaldare una soluzione salina allo 0,9% a bagnomaria a 37 ° C per umidificare la camera di plastica e il tessuto mesentere.
- Anestetizzare il mouse con iniezione intraperitoneale di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (5 mg / kg) subito prima della procedura di microscopia. Anestesia alternativi possono essere utilizzati, ad esempio, 2% inalazione isoflurano. Verificare il corretto anestesia dalla perdita di risposta alla stimolazione riflessa (punta o la coda pizzico di pressione costante).
- Depilate l'addome con un rasoio elettrico e rimuovere i capelli sciolti con una garza saturato con etanolo al 70%.
- Applicare veterinario pomata sugli occhi del mouse per prevenire la secchezza, mentre sotto anestesia.
2. Chirurgia
- Sterilizzare l'addome, utilizzando il 70% di etanolo. Questo metodo non è un metodo sterile e potrebbe essere letale alla fine dell'esperimento.
- Eseguire una laparotomia mediana: Aprire la pelle addominale con piccoli, pinze curve e forbicine. Identificare il epivasi gastrical e aprire il peritoneo nella regione della linea alba, per proteggere i vasi.
- Applicare alcune gocce di soluzione salina preriscaldata nella cavità addominale per mantenere il tessuto umido.
- Leucociti etichette e piastrine fluorescently iniettando 50 microlitri rodamina 6G (1 mg / ml) retro-orbitale come descritto prima 9,10.
- Esteriorizzarmi un'ansa ileumand posto in un petridish con un diametro di 10 cm e assicurarsi di mantenere il tessuto umido applicando il 37 ° C preriscaldata soluzione salina (0,9%) ogni minuto.
3. intravitale Microscopia
- Posizionare il mouse sotto il microscopio e portare la vena mesentere con un diametro di 200-300 micron nel centro di vista. Scegliere una nave senza un ambiente grasso visibile.
- Non toccare i vasi mesentere evitando in tal modo la stimolazione dell'endotelio. Maneggiare il ciclo ileo cautela.
- Visualizza interazioni delle cellule endoteliali nel sanguecon un microscopio invertito o verticale e una telecamera utilizzando un software microscopio. Record di sangue interazioni delle cellule endoteliali per 1 minuto a 4 diverse vene per mouse.
- Euthanize il mouse per dislocazione cervicale dopo il completamento di esperimenti di imaging.
4. Analisi
- Effettuare l'analisi offline e accecato per tutti i parametri. Effettuare analisi utilizzando qualsiasi programma software adatto.
- Confermare condizioni stabili e interindividually comparabili flusso sanguigno in alta risoluzione tempo cine-clip (frame rate massimo) incentrati sul flusso di globuli endoluminale.
- Quantificare il numero di leucociti rotolamento. Perciò tracciare una linea verticale attraverso la vena e contare tutti i leucociti che attraversano questa linea in 1 min.
- Determinare velocità di rotazione misurando il tempo di un singolo leucociti deve passare una distanza di 50 micron mentre stabilmente rotola su endotelio. Per questo, tracciare due linee verticali in una distanza di 50 micron tttraverso la vena.
- Misurare il tempo di leucociti rappresentante deve ottenere da una riga alla other.Calculate la velocità dei leucociti dividendo 50 micron attraverso il tempo necessario (micron / s).
- Misurare adesione dei leucociti in un campo di 0,04 mm 2. Per fare questo, disegnare un quadrato con la lunghezza del lato 200 micron nella vena.
- Contare i leucociti aderenti dell'impresa, definiti come nessun movimento visibile per 30 secondi, all'interno di questa piazza.
- Contare il numero di piastrine legate a uno dei leucociti quantificare le interazioni di piastrine-leucociti.
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Representative Results
Una panoramica dell'impostazione sperimentale descritto in questo protocollo è mostrato in Figura 1. Essa mostra un mouse con un ileo-loop esteriorizzato e sue navi, che può essere osservata in microscopia intravitale. Figura 2 mostra certo grado di attivazione in animali non trattati a causa la procedura stessa. Ma non c'è quasi rotolamento lento o ferma adesione dei leucociti, rispetto ai topi LPS-trattati. La figura 2 mostra anche i diversi risultati della microscopia intravitale nei topi di tipo selvatico o trattati con fluoxetina per 3 settimane in acqua potabile o topi non trattati. Figura 2A- c mostrano i risultati senza ulteriore sfida infiammatoria con LPS, mentre i topi in Figura 2F-H sono stati trattati con LPS in aggiunta. Qui possiamo vedere un maggior numero di rotolamento e leucociti aderenti, mentre la velocità di rotolamento diminuito dopo LPS sfida. Con questi esperimenti abbiamo potuto dimostrare che la serotonina è piastrinica crucial per le fasi iniziali di reclutamento dei leucociti in infiammazione 7.
Nella figura 3, la microscopia intravitale è stata eseguita senza ulteriori LPS sfida e subito dopo un trattamento acuto con fluoxetina intraperitoneale 2 ore prima dell'intervento. Qui possiamo vedere un maggior numero di leucociti fermamente aderenti e velocità di rotolamento inferiore in topi trattati con fluoxetina, indicando un influenza del trattamento con fluoxetina acuta sulle interazioni leucociti-endotelio 8.
In Figura 4 interazioni piastrine-leucociti durante lipopolisaccaride indotta peritonite sono visualizzati all'interno di una vena. Le piastrine sono rosette attorno ai leucociti e questi complessi interagiscono con la parete del serbatoio.
Figura 1. Panoramica delle impostazioni sperimentali. (A) Un mouse anestetizzato con esteriorizzato ileo-loop e le sue navi mesentere (freccia nera). (B) microscopio intravitale con il mouse posizionato (freccia rossa) sotto l'obiettivo (freccia nera). Fonte di luce (freccia nera) e la fotocamera (freccia rossa) sono marcati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. intravitale Microscopia Dopo 3 settimane somministrazione di Fluoxetina tipo selvatico topo con o senza LPS Challenge. Modificato da 7 (A) Numero di leucociti rotolamento senza LPS-stimolazione. (B) la velocità dei leucociti senza stimolazione LPS. (C) Numero di leucociti saldamente aderenti senza stimolazione con LPS.(D) Esempio di una nave di un mouse WT trattata senza LPS sfida. (E) Esempio di una nave di un mouse fluoxetina-trattata senza LPS sfida. (F) Numero di leucociti laminazione dopo LPS-stimolazione. (G) la velocità dei leucociti dopo stimolazione con LPS. (H) Numero di leucociti saldamente aderenti dopo la stimolazione con LPS. (I) Esempio di una nave di un mouse WT trattato dopo LPS sfida. (J) Esempio di una nave di un mouse fluoxetina trattati dopo LPS sfida. Scala bar = 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: intravitale Microscopia Dopo acuta Fluoxetina Challenge 2 ore prima dell'intervento chirurgico conout LPS Challenge. Modificato da 8 A) Numero di leucociti rotolamento senza LPS-stimolazione. B) la velocità dei leucociti senza stimolazione LPS. C) Numero di leucociti saldamente aderenti senza stimolazione con LPS. D) Esempio di una nave di un mouse WT non trattata senza LPS sfida. E) Esempio di una nave di un mouse fluoxetina trattati acuta senza LPS sfida. Scala bar = 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4:. Interazioni piastrine-leucociti in vivo Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Quadro rappresentativo di piastrine-leucociti traazioni in topi in vivo durante lipopolisaccaride indotta peritonite nelle vene. Ristampa da 11.
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Discussion
Qui si descrive la preparazione e l'esecuzione di microscopia intravitale delle vene mesentere di topi in vivo. Questo metodo ci dà l'opportunità di osservare le interazioni leucociti-endotelio e piastrine-endotelio 11 direttamente nell'organismo vivente.
Come risposta precoce alla infiammazione dell'endotelio viene attivato e interagisce con leucociti e piastrine con conseguente rotolamento, aderenza e la trasmigrazione 12. Ma leucociti interagiscono anche con le piastrine formando così chiamati, complessi piastrine-leucociti, prevalentemente complessi piastrine-neutrofili (PNC) e complessi piastrine-monociti (PMC) 13,14 .Questi interazioni possono essere osservate e quantificate in questo metodo.
Inoltre questa tecnica permette di indagare l'attivazione dell'endotelio con pennarelli come VCAM-1 o ICAM-1 (ad esempio, dopo le interazioni piastrine / leucociti) 15.
Lo stimolo fisico della procedura stessa provoca un certo grado di attivazione endoteliale, che porta a rotolamento visibile dei leucociti (ma quasi nessuna laminazione lenta e nessuna adesione ferma). Ciò implica che l'esaminatore ha bisogno per gestire il mesentere con grande cura. Se c'è troppo attivazione causata da greggio movimentazione si tradurrà in numeri elevati di rotolamento e leucociti aderenti. Per raggiungere un numero riproducibile di 30-80 leucociti volventi per minuto in topi wild-type, l'esaminatore deve essere addestrato.
Blocco di P-selectina / PSGL-interazione potrebbe servire come controllo per confermare l'interazione tra leucociti con endotelio. Si esclude che i leucociti sono passivamente "attaccati" per l'endotelio, uno scenario che potrebbe verificarsi se il flusso di sangue è fortemente ridotta.
Diametro del vaso Mesentere varia circa 200-300 micron. Quindi, questo metodo non è adatto per valutare la microcircolazione nei capillari, ma si concentrasulle interazioni leucociti-endotelio in piccole vene infiammate, il luogo primario per la trasmigrazione dei leucociti. Rispetto ad altri metodi di microscopia intra-vitali come il modello cremastere, questo metodo è più facile da imparare e può essere eseguita in un periodo di tempo più breve.
Uno dei limiti più importanti di questo metodo è che i topi devono essere giovani senza molto grasso mesentere avere una buona vista nei vasi, in modo che questo metodo non può essere eseguita dopo studi di alimentazione o di trattamento lunghi.
Una volta che l'esaminatore è addestrato, condizioni infiammatorie differenti possono essere esaminate con questo metodo, come l'applicazione di LPS, tioglicolato, TNFa o istamina. Ulteriori specifiche imaging particolari globuli può essere ottenuto utilizzando mirati molecole fluorescente. In generale, questo metodo è facile da imparare e un modo rapido per esaminare le interazioni leucociti-endotelio e piastrine-leucociti in un organismo vivente.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 989-38-8 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5 | Sigma-Aldrich | L2637 |
References
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