Abstract
Intravital mikroskopi är en metod som kan användas för att undersöka olika processer i olika regioner och fartyg i levande djur. I detta protokoll, beskriver vi intravital mikroskopi av tarmkäx ådror. Detta kan utföras på en kort tid med reproducerbara resultat visar leukocyt-endoteliala interaktioner in vivo. Vi beskriver en inflammatorisk miljö efter LPS utmaningen av endotel. Men i denna modell kan man använda många olika typer av inflammatoriska tillstånd, som bakterier, kemiska eller biologiska och undersöka administrering av läkemedel och deras direkta effekter på levande djur och dess inverkan på leukocytrekrytering. Detta protokoll har tillämpats framgångsrikt på ett antal olika behandlingar av möss och deras effekter på inflammatorisk respons i kärl. Häri beskriver vi visualisering av leukocyter och blodplättar genom fluorescerande märkning dessa med rodamin 6G. Dessutom kan någon specifik avbildning vara performed använda riktade fluorescerande molekyler.
Introduction
Syftet med detta protokoll är att beskriva en förenklad teknik för intravital mikroskopi av tarmkäxet vener i levande möss för direkt observation av leukocyt-endotel och leukocyter plätt interaktioner i inflammatoriska tillstånd.
Intravital mikroskopi har utvecklats för att studera leukocyt-endoteliala interaktioner in vivo enligt inflammatoriska tillstånd 1,2, vilket inte är trivialt, men viktigt för att förstå inflammatoriska leukocytrekrytering och funktion. Den metod vi beskriver i detta protokoll har utvecklats baserat på tidigare publicerade publikationer. I likhet med visualisera plätt inkorporering i en växande tromb 3 och parallellt med det som har publicerats tidigare 4, är en exterioriserad tarmkäx ven granskas av överförd ljusmikroskop. Det finns flera andra modeller av intra-vital mikroskopi såsom kremastermuskeln av råttor 5 eller levern hos mus och råtta 6.
Intravital mikroskopi av tarmkäxet ven har utvecklats och tillämpats i tidigare studier av flera grupper. Vi har använt denna teknik för att observera skillnader i leukocytrekrytering mellan vildtypsmöss och tryptofan hydroxylase1 (TPH1) - / - möss, som har brist på icke-neuronal serotonin och jämförde resultaten till möss vars plätt serotonin farmakologiskt utarmat av långvarig ansökan en selektiv serotoninåterupptagshämmare fluoxetin 7. Vi har även granskat leukocyt-endotel interaktioner efter akut behandling med fluoxetin 8.
I detta protokoll fokuserar vi på intravital mikroskopi av tarmkäxet vener, eftersom denna modell kan göras snabbt, och tillåter giltiga mätningar av leukocyt-endotel och trombocyter leukocyter interaktioner. Detta är mycket mer utmanande och tidskrävande i intravital mikroskopi av andra organ, såsom ben, lever, hud, eller kremastermuskeln. Lägetl som beskrivs här är perfekt för reproducerbar utvärdering av inflammatorisk cell-cell interaktion efter challengeing det med ett inflammatoriskt stimulus, såsom intraperitoneal injektion av lipopolysackarid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med den tyska djurskyddslagen (TierSchG). Mössen inhystes och hanteras i enlighet med god djurpraxis enligt definitionen i FELASA (www.felasa.eu/guidelines.php) och nationella djurskyddskropps GV-SOLAS (www.gv-solas.de/index.html). Djurskyddskommitté vid universitetet i Freiburg, liksom de lokala myndigheterna (Regierungspräsidium Freiburg) godkände alla djurförsök.
1. djurhantering, Förberedelse och induktion av inflammation
- Använd 4 - 6 veckor gamla hanmöss med en vikt intervallet 16 - 20 g. Obs: Om möss är äldre eller tyngre de presenterar överdrivet fett kring fartyget, vilket begränsar mikroskopisk observation.
- Sterilisera alla verktyg och mikroskop bord före operation.
- Injicera 20 mg / kg LPS (lipopolysackarid) intraperitonealt 4 timmar före mikroskopi in i vardags musen för att framkalla en bakteriell Inflammation.
- Prewarm en 0,9% saltlösning i ett vattenbad vid 37 ° C för att fukta plastkammare och tarmkäxet vävnaden.
- Söva musen med intraperitoneal injektion av ketamin (100 mg / kg) och xylazin (5 mg / kg) precis innan mikroskopi förfarandet. Alternativa anestesi kan användas, till exempel, 2% isofluran inandning. Bekräfta korrekt anesthetization av uteblivet svar på reflexstimulering (tå eller svans nypa med fast tryck).
- Vaxning varar buken med hjälp av en rakapparat och ta bort lösa hår med gasväv mättad med etanol 70%.
- Applicera veterinär salva på ögonen på musen för att förhindra torrhet, medan under narkos.
2. Kirurgi
- Sterilisera buken med hjälp av 70% etanol. Denna metod är inte en steril metod och kan vara dödlig vid slutet av experimentet.
- Utför en median laparotomi: Öppna buken huden med hjälp av små, böjda pincett och en liten sax. Identifiera epigastrical fartyg och öppna bukhinnan i regionen av linea alba, för att skydda fartyg.
- Applicera några droppar förvärmd saltlösning i bukhålan för att hålla vävnaden fuktig.
- Märknings leukocyter och blodplättar med fluorescens genom att injicera 50 | al rodamin 6G (1 mg / ml) retroorbitalt såsom beskrivits tidigare 9,10.
- Exteriorize en slinga av ileumand placera den i en petriskål med en diameter på 10 cm och se till att hålla vävnaden fuktig genom att tillämpa 37 ° C förvärmd saltlösning (0,9%) varannan minut.
3. Intravital Mikroskopi
- Placera musen under mikroskop och bringa tarmkäxet venen med en diameter på 200-300 | j, m i centrum av vyn. Välj ett fartyg utan synligt fett omgivningar.
- Rör inte tarmkäxet kärlen och därmed undvika stimulering av endotel. Hantera ileum slingan försiktigt.
- Visualisera blodkroppar-endoteliala interaktionermed en inverterad eller upprätt mikroskop och en kamera med hjälp av ett mikroskop programvara. Spela blodkroppar-endotel interaktioner för 1 min i 4 olika vener per mus.
- Euthanize musen genom cervikal dislokation efter slutförandet av avbildning experiment.
4. Analys
- Utför analysen offline och förblindade för alla parametrar. Utföra analyser med användning av vilken som helst lämplig programvara.
- Bekräfta stabila och interindividually jämförbara blodflödesförhållandena i hög tidsupplösning Cine-clips (maximal bildhastighet) med fokus på intraluminal blodkroppar flöde.
- Kvantifiera antalet rullande leukocyter. Därför dra en vertikal linje genom venen och räkna alla leukocyter som passerar denna linje i 1 min.
- Bestäm rullhastigheten genom att mäta den tid som ett enda leukocyt måste passera en sträcka av 50 ^ m, medan stabilt rullar på endotel. För att göra detta, dra två vertikala linjer på ett avstånd av 50 um through venen.
- Mät den tid en representant leukocyt behöver komma från en rad till other.Calculate hastigheten på leukocyter genom att dividera 50 pm genom den tid som krävs (im / s).
- Mät leukocytadhesion i ett fält av 0,04 mm 2. För att göra detta, rita en kvadrat med sidan längd 200 um i venen.
- Räkna de fasta vidhäftande leukocyter, som definieras som inga synliga rörelse för 30 sek, inom denna ruta.
- Räkna antalet trombocyter som är bundna till en leukocyt att kvantifiera trombocyt-leukocyt-interaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En översikt över den experimentella inställning som beskrivs i detta protokoll visas i figur 1. Det visar en mus med en exterioriserad ileum-slinga och dess fartyg, som kan observeras i intravital mikroskopi. Figur 2 visar viss aktivering i obehandlade djur på grund av själva förfarandet. Men det finns nästan ingen långsam valsning eller fast vidhäftning av leukocyter jämfört med LPS-behandlade möss. Figur 2 visar också de olika resultaten av intravital mikroskopi i vildtyp möss antingen behandlades med fluoxetin i 3 veckor i dricksvattnet eller obehandlade möss. Figur 2A C visar resultaten utan ytterligare inflammatorisk utmaning med LPS, medan möss i figur 2F-H behandlades med LPS dessutom. Här kan vi se högre antal valsning och vidhäftande leukocyter, medan rullande hastigheten minskade efter LPS utmaningen. Med dessa experiment kunde vi visa att trombocyter serotonin är crucial för de första stegen av leukocytrekrytering i inflammation 7.
I Figur 3, var intravital mikroskopi utförs utan ytterligare LPS utmaningen och strax efter akut behandling med fluoxetin intraperitonealt 2 timmar före operation. Här kan vi se högre antal fast vidhäftande leukocyter och lägre rullhastigheter i fluoxetin behandlade möss, vilket tyder på en påverkan av akut behandling med fluoxetin på leukocyt-endotel interaktioner 8.
I Figur 4 plätt leukocyter interaktioner under lipopolysackarid-inducerad peritonit visualiseras i en ven. Trombocyter rosette runt leukocyterna och dessa komplex interagerar med kärlväggen.
Figur 1. Översikt över Experimentella inställningar. (A) En bedövad mus med exterioriserad ileum-slinga och dess tarmkäx fartyg (svart pil). (B) Intravital mikroskop med placerad mus (röd pil) under målet (svart pil). Ljuskälla (svart pil) och kameran (röd pil) markeras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Intravital mikroskopi Efter 3 veckor av fluoxetin till vildtyp möss antingen med eller utan LPS Challenge. Modifierad från 7 (A) Antal rullande leukocyter utan LPS-stimulering. (B) Leukocyt hastighet utan LPS-stimulering. (C) Antal fast vidhäftande leukocyter utan LPS-stimulering.(D) Exempel på ett fartyg av en obehandlad WT mus utan LPS utmaningen. (E) Exempel på ett fartyg av en fluoxetin behandlad mus utan LPS utmaningen. (F) Antal rullande leukocyter efter LPS-stimulering. (G) Leukocyt hastighet efter LPS-stimulering. (H) Antal starkt adherenta leukocyter efter LPS-stimulering. (I) Exempel på ett fartyg av en obehandlad WT mus efter LPS utmaningen. (J) Exempel på ett fartyg av en fluoxetin behandlad mus efter LPS utmaningen. Skala bar = 100 nm. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Intravital mikroskopi efter akut Fluoxetin Challenge 2 timmar före operation medut LPS Challenge. Modifierad från 8 A) Antal rullande leukocyter utan LPS-stimulering. B) Leukocyt hastighet utan LPS-stimulering. C) Antal fast vidhäftande leukocyter utan LPS-stimulering. D) Exempel på ett fartyg av en obehandlad WT mus utan LPS utmaningen. E) Exempel på ett fartyg av en akut fluoxetin-behandlad mus utan LPS utmaningen. Skala bar = 100 nm. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Platelet-leukocyter interaktioner in vivo Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Representativ bild av blodplätts leukocyter interåtgärder i möss in vivo under lipopolysackarid-inducerad peritonit i venerna. Reprint från 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Häri beskriver vi förberedelser och genomförande av intravital mikroskopi av tarmkäxet vener hos möss in vivo. Denna metod ger oss möjlighet att observera leukocyt-endotel och trombocyter-endotel interaktioner 11 direkt i den levande organismen.
Som en tidig reaktion på inflammation endotelet blir aktiverad och interagerar med leukocyter och trombocyter resulterar i rullning, vidhäftning och trans 12. Men leukocyter samverkar även med blodplättar bildar så kallade, blodplätts leukocyter komplex, huvudsakligen plätt neutrofila komplex (PNCs) och blodplätts monocyt komplex (PMC) 13,14 .Dessa interaktioner kan observeras och kvantifieras i denna metod.
Dessutom Denna teknik medger att undersöka endotel aktivering med markörer såsom VCAM-1 eller ICAM-1 (t ex, efter blodplätt / leukocyt interaktioner) 15.
Den fysiska stimulans av förfarandet i sig orsakar en viss grad av endotel-aktivering, vilket leder till synlig rullning av leukocyter (men nästan ingen långsam valsning och ingen fast vidhäftning). Detta innebär att kontrollanten behöver hantera tarmkäxet med stor omsorg. Om det är för mycket aktivering orsakas av råolja hanterar det kommer att resultera i ökat antal valsning och vidhäftande leukocyter. För att nå ett reproducerbart antal 30-80 rullande leukocyter per minut i vildtypsmöss examinator måste utbildas.
Blockering av P-selektin / PSGL-interaktion skulle kunna fungera som en kontroll för att bekräfta interaktionen av leukocyter med endotel. Det utesluter att leukocyter passivt "fästa" till endotel, ett scenario som kan uppstå om blodflödet är starkt reducerad.
Tarmkäx kärldiameter varierar ca 200-300 | im. Därför är denna metod inte är lämplig att bedöma mikro i kapillärerna, men fokuserarpå leukocyt-endotel interaktioner i små, inflammerade vener, den primära platsen för trans av leukocyter. Jämfört med andra intra-vitala mikroskopimetoder såsom cremaster modellen är denna metod enklare att lära sig och kan utföras på en kortare tidsperiod.
En av de viktigaste begränsningarna med denna metod är att mössen måste vara ung utan mycket tarmkäx fett att ha en bra vy i kärlen, så att denna metod inte kan utföras efter långa utfodrings- och behandlingsstudier.
När examinator är utbildad, kan olika inflammatoriska tillstånd undersökas med denna metod, såsom tillämpning av LPS, tioglykolat, TNFa eller histamin. Mer specifik avbildning av vissa blodceller kan åstadkommas med hjälp av riktade fluorescerande molekyler. Totalt sett är denna metod lätt att lära och ett snabbt sätt att undersöka leukocyt-endotel och trombocyter leukocyter interaktioner i en levande organism.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 989-38-8 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5 | Sigma-Aldrich | L2637 |
References
- Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells. Methods in enzymology. 300, 462-481 (1999).
- Atherton, A., Born, G. V. Quantitative investigations of the adhesiveness of circulating polymorphonuclear leucocytes to blood vessel walls. The Journal of physiology. 222, 447-474 (1972).
- Duerschmied, D., et al. Serotonin stimulates platelet receptor shedding by tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme (ADAM17). Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 7, 1163-1171 (2009).
- Chauhan, A. K., et al. ADAMTS13: a new link between thrombosis and inflammation. The Journal of experimental medicine. 205, 2065-2074 (1084).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvascular research. 5, 384-394 (1973).
- Leister, I., et al. A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum. Surgical endoscopy. 17, 939-942 (2003).
- Duerschmied, D., et al. Platelet serotonin promotes the recruitment of neutrophils to sites of acute inflammation in mice. Blood. 121, 1008-1015 (2013).
- Herr, N., et al. Acute fluoxetine treatment induces slow rolling of leukocytes on endothelium in mice. PloS one. 9, e88316 (2014).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab animal. 40, 155-160 (2011).
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab animal. 37, 26-32 (2008).
- Duerschmied, D., Bode, C., Ahrens, I. Immune functions of platelets. Thrombosis and haemostasis. 112, 678-691 (2014).
- Wagner, D. D., Frenette, P. S. The vessel wall and its interactions. Blood. 111, 5271-5281 (2008).
- Gawaz, M., Fateh-Moghadam, S., Pilz, G., Gurland, H. J., Werdan, K. Platelet activation and interaction with leucocytes in patients with sepsis or multiple organ failure. European journal of clinical investigation. 25, 843-851 (1995).
- Sarma, J., et al. Increased platelet binding to circulating monocytes in acute coronary syndromes. Circulation. 105, 2166-2171 (2002).
- Sumagin, R., Sarelius, I. H. TNF-alpha activation of arterioles and venules alters distribution and levels of ICAM-1 and affects leukocyte-endothelial cell interactions. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 291, H2116-H2125 (2006).
