Abstract
Intravitale microscopie is een werkwijze die kan worden gebruikt om verschillende processen in verschillende regio's en schepen in levende dieren te onderzoeken. In dit protocol beschrijven we intravitale microscopie van mesenterium aderen. Dit kan worden uitgevoerd in een korte tijd met reproduceerbare resultaten tonen leukocyt-endotheel interacties in vivo. We beschrijven een inflammatoire instelling na LPS uitdaging van het endotheel. Maar in dit model kan men veel verschillende soorten van toepassing van inflammatoire aandoeningen, zoals bacteriële, chemische of biologische en onderzoek de toediening van geneesmiddelen en hun directe effecten op het leven van dieren en de impact ervan op leukocyten werving. Dit protocol is met succes toegepast op een aantal verschillende behandelingen muizen en hun effect op ontstekingsreactie in vaten. Hierin beschrijven we de visualisatie van leukocyten en bloedplaatjes door fluorescent labelen die met rhodamine 6G. Bovendien kan een specifieke pe beeldvorming zijnrformed met behulp van gericht fluorescerend gemerkte moleculen.
Introduction
Het doel van dit protocol is een vereenvoudigde methode van intravitale microscopie van mesenterium aderen beschrijven levende muizen directe observatie van leukocyt-endotheel leukocyt en bloedplaatjes interacties onder ontstekingsaandoeningen.
Intravitale microscopie werd ontwikkeld om leukocyt-endotheel interacties in vivo te bestuderen onder ontstekingsaandoeningen 1,2, wat niet triviaal, maar belangrijk voor het begrijpen van inflammatoire leukocyten rekrutering en functie. De werkwijze beschrijven we in dit protocol is ontwikkeld op basis van eerder gepubliceerde publicaties. Soortgelijke visualiseren bloedplaatjes bijmenging in een groeiende trombus 3 en parallel aan wat eerder is gepubliceerd 4, een geëxterioriseerde mesenterium ader wordt onderzocht door doorvallend licht microscopie. Er zijn diverse andere modellen van intra-vitale microscopie zoals de cremaster spier van ratten 5 of lever van muizen en ratten 6.
Intravitale microscopie van mesenterium ader is ontwikkeld en in eerdere studies toegepast door verscheidene groepen. We hebben deze techniek gebruikt om de verschillen in de rekrutering van leukocyten tussen wild type muizen en tryptofaan hydroxylase1 (Tph1) te observeren - / - muizen, die een tekort van niet-neuronale serotonine en vergeleken de resultaten met muizen waarvan de plaatjes serotonine werd farmacologisch uitgeput door de lange termijn zijn de toepassing van de selectieve serotonine heropname remmers fluoxetine 7. We hebben ook onderzocht leukocyten-endotheel interacties na de acute behandeling met fluoxetine 8.
In dit protocol richten we ons op intravitale microscopie van mesenterium aders, omdat dit model snel kan worden uitgevoerd en maakt valide metingen van leukocyt-endotheel en bloedplaatjes-leukocyt interacties. Dit is veel moeilijker en tijdrovender in intravitale microscopie van andere organen, zoals bot, lever, huid of spier cremaster. The model beschreven ideaal voor reproduceerbare beoordeling van inflammatoire interactie cel-cel na challengeing met een inflammatoire stimulus, zoals intraperitoneale injectie van lipopolysaccharide.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Duitse dierenbescherming recht (TierSchG). De muizen werden gehuisvest en behandeld in overeenstemming met de goede praktijken dier, zoals gedefinieerd door FELASA (www.felasa.eu/guidelines.php) en de nationale dierenwelzijn lichaam GV-SOLAS (www.gv-solas.de/index.html). Het dierenwelzijn commissie van de universiteit van Freiburg, evenals de lokale overheden (Regierungspräsidium Freiburg) goedgekeurd alle dierproeven.
1. Dierlijke Handling, Voorbereiding en inductie van de ontsteking
- Gebruik 4-6 weken oude mannelijke muizen met een gewicht bereik van 16 - 20 g. Opmerking: Als de muizen ouder of zwaarder ze aanwezig overtollig vet rond het vat, het beperken van de microscopische observatie.
- Steriliseren alle gereedschappen en microscoop tafel voorafgaand aan de operatie.
- Injecteer 20 mg / kg LPS (lipopolysaccharide) intraperitoneaal 4 uur voorafgaand aan microscopie in het levende muis een bacteriële Inflamm inducerenatie.
- Voorverwarmen een 0,9% zoutoplossing in een waterbad bij 37 ° C om de plastic kamer en het mesenterium weefsel bevochtigen.
- Verdoven de muis met intraperitoneale injectie van ketamine (100 mg / kg) en xylazine (5 mg / kg) direct voor de procedure microscopie. Alternatieve anesthesie worden gebruikt, bijvoorbeeld 2% isofluraan inhalatie. Bevestig de juiste verdoving door het verlies van respons op reflex stimulatie (teen of staart knijpen met stevige druk).
- Ontharen de buik met een scheerapparaat en verwijder losse haren met gaas verzadigd met ethanol 70%.
- Breng vet zalf op de ogen van de muis tot droog te voorkomen, terwijl onder narcose.
2. Chirurgie
- Steriliseer de buik middels 70% ethanol. Deze methode is geen steriel werkwijze en dodelijk eind van het experiment zijn.
- Voer een mediane laparotomie: Open de buikhuid met behulp van kleine, gebogen pincet en een klein schaartje. Identificeer de epigastrical schepen en open het peritoneum in het gebied van de linea alba, om de vaten te beschermen.
- Breng enkele druppels voorverwarmde zoutoplossing in de buikholte om het weefsel vochtig.
- Label leukocyten en bloedplaatjes fluorescent door het injecteren van 50 gl rhodamine 6G (1 mg / ml) retro-orbitaal zoals eerder beschreven 9,10.
- Exterioriseren een lus van ileumand plaats het in een petrischaal met een diameter van 10 cm en zorg ervoor dat het weefsel vochtig te houden door toepassing van de 37 ° C voorverwarmde zoutoplossing (0,9%) om de andere minuut.
3. Intravitale Microscopie
- Plaats de muis onder de microscoop en breng het mesenterium ader met een diameter van 200-300 urn in het midden van weergave. Kies een schip zonder zichtbare vet omgeving.
- Laat het mesenterium vaten waardoor stimulatie van het endotheel te vermijden niet aanraken. Behandel de ileum loop voorzichtig.
- Visualiseer bloedcel-endotheel interactiesmet een omgekeerde of rechtop microscoop en een camera met behulp van een microscoop software. Neem bloedcel-endotheliale interacties 1 min bij 4 verschillende aders per muis.
- Euthanaseren de muizen door cervicale dislocatie na de voltooiing van plaatsbepalingen.
4. Analyse
- Voer de analyse offline en verblind voor alle parameters. Uit te voeren analyse met behulp van een geschikte software-programma.
- Bevestig stabiel en interindividually vergelijkbare bloedstroom omstandigheden in hoog tijd-resolutie cine-clips (maximale frame rate) gericht op intraluminale bloedcellen flow.
- Kwantificeren van het aantal rollende leukocyten. Daarom trek een verticale lijn door de ader en tel alle leukocyten oversteken deze lijn in 1 min.
- Bepaal rolsnelheid door meting van de tijd één leukocyt nodig heeft om een afstand van 50 micrometer passeren, terwijl stabiel rollen op endotheel. Om dit te doen, trek twee verticale lijnen op een afstand van 50 pm through de ader.
- Meet de tijd een vertegenwoordiger leukocyten nodig heeft om van de ene lijn naar de other.Calculate de snelheid van de leukocyten door het verdelen van 50 pm door de tijd die nodig is (um / s).
- Meet leukocyt adhesie op een gebied van 0,04 mm 2. Om dit te doen, trek een vierkant met de zijkant lengte van 200 urn in de ader.
- Tel de firma aanhangend leukocyten, gedefinieerd als geen zichtbare beweging voor 30 sec, binnen dit plein.
- Tel het aantal bloedplaatjes gebonden aan een leukocyt bloedplaatjes-leukocyt interacties te kwantificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een overzicht van de experimentele instelling in dit protocol beschreven in figuur 1. Het toont een muis met een geëxterioriseerde ileum-lus en de vaten, die worden waargenomen in opklaren. Figuur 2 toont zekere activatie in onbehandelde dieren wegens de procedure zelf. Er is bijna geen langzame walsen of stevige adhesie van leukocyten vergeleken met LPS behandelde muizen. Figuur 2 bevat eveneens de resultaten van intravitale microscopie in wildtype muizen hetzij behandeld met fluoxetine gedurende 3 weken in het drinkwater of onbehandelde muizen. Figuur 2A C tonen de resultaten zonder verdere inflammatoire challenge met LPS, terwijl muizen in figuur 2F-H werden behandeld met LPS daarnaast. Hier kunnen we een groter aantal rollen en adherente leukocyten te zien, terwijl het rollen snelheid af na LPS uitdaging. Bij deze experimenten konden wij aantonen dat serotonine- is crucial de eerste stappen van de rekrutering van leukocyten in inflammatie 7.
In figuur 3 werd intravitale microscopie uitgevoerd zonder verdere LPS uitdaging en net na acute behandeling met fluoxetine intraperitoneaal 2 uur voor de operatie. Hier kunnen we hogere aantallen stevig adherente leukocyten en lagere rollende snelheden in fluoxetine behandelde muizen te zien, hetgeen wijst op een invloed van acute behandeling met fluoxetine op leukocyten-endotheel interacties 8.
In figuur 4 bloedplaatjes-leukocyt interacties tijdens lipopolysaccharide geïnduceerde peritonitis gevisualiseerd in een ader. Bloedplaatjes zijn Rozetvorming rond de leukocyten en deze complexen zijn interactie met de vaatwand.
Figuur 1. Overzicht van de experimentele instellingen. (A) Een verdoofde muis met geëxterioriseerde ileum-loop en de mesenterium schepen (zwarte pijl). (B) Intravitale microscoop met geplaatst muis (rode pijl) onder de doelstelling (zwarte pijl). Lichtbron (zwarte pijlpunt) en camera (rode pijlpunt) zijn gemarkeerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Intravitale Microscopie Na 3-weken Toediening van Fluoxetine om Wildtype muizen met of zonder LPS Challenge. Modified van 7 (A) Aantal rollende leukocyten zonder LPS-stimulatie. (B) Leukocyte snelheid zonder LPS stimulatie. (C) Aantal sterk hechtende leukocyten zonder LPS stimulatie.(D) Voorbeeld van een schip van een onbehandelde WT muis zonder LPS uitdaging. (E) Voorbeeld van een schip van een fluoxetine behandelde muizen zonder LPS uitdaging. (F) Aantal rollende leukocyten na LPS-stimulatie. (G) Leukocyt velocity na LPS stimulatie. (H) Aantal sterk hechtende leukocyten na LPS stimulatie. (I) Voorbeeld van een schip van een onbehandelde WT muis na LPS uitdaging. (J) Voorbeeld van een schip van een fluoxetine behandelde muizen na LPS uitdaging. Schaal bar = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Intravitale Microscopie Na Acute Fluoxetine Challenge 2 uur voorafgaand aan de operatie metout LPS Challenge. Modified van 8 A) Aantal rollende leukocyten zonder LPS-stimulatie. B) Leukocyte snelheid zonder LPS stimulatie. C) Aantal stevig adherente leukocyten zonder LPS stimulatie. D) Voorbeeld van een schip van een onbehandelde WT muis zonder LPS uitdaging. E) Voorbeeld van een schip van een acute-fluoxetine behandelde muizen zonder LPS uitdaging. Schaal bar = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4:. Bloedplaatjes-leukocyten interacties in vivo Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Representatief beeld van bloedplaatjes-leukocyten interacties in muizen in vivo tijdens lipopolysaccharide geïnduceerde peritonitis in de aderen. Herdruk van 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hierin beschrijven we de voorbereiding en uitvoering van intravitale microscopie van mesenterium aderen van muizen in vivo. Deze methode geeft ons de mogelijkheid om leukocyten-endotheel en bloedplaatjes-endotheel interacties 11 direct waar te nemen in het levende organisme.
Als een vroege reactie op het endotheel ontsteking wordt geactiveerd en interageert met leukocyten en bloedplaatjes resulteert in rollen, adhesie en transmigratie 12. Maar leukocyten ook interactie met bloedplaatjes vormen van zogenaamde bloedplaatjes-leukocyt complexen, voornamelijk bloedplaatjes-neutrofiel complexen (PNCs) en bloedplaatjes-monocyt complexen (PMC) 13,14 .Deze interacties kunnen worden geobserveerd en gekwantificeerd in deze methode.
Bovendien maakt deze techniek onderzoeken endotheel activatie met markers zoals VCAM-1 of ICAM-1 (bijvoorbeeld na plaatjes / leukocyt interacties) 15.
De fysische prikkel van de procedure zelf veroorzaakt een zekere mate van endotheel activatie, hetgeen leidt tot zichtbare rollen van leukocyten (maar bijna geen langzame walsen en geen stevige adhesie). Dit impliceert dat de onderzoeker moet het mesenterium zeer zorgvuldig omgaan. Als er te veel activering veroorzaakt door ruwe behandeling het zal resulteren in verhoogde aantallen rollen en aanhangend leukocyten. Om een reproduceerbare aantal van 30 te bereiken - 80 rollende leukocyten per minuut de examinator in wild-type muizen moet worden opgeleid.
Blokkering van P-selectine / PSGL-interactie kan als controle dienen om de interactie van leukocyten met het endotheel bevestigen. Zij sluit uit dat leukocyten passief "verbonden" aan het endotheel, een scenario dat kan optreden wanneer de bloedstroom sterk verminderd.
Diameter mesenterium vat varieert ongeveer 200-300 micrometer. Derhalve is deze werkwijze niet geschikt om microcirculatie in haarvaten beoordelen, maar concentreertop leukocyten-endotheel interacties in kleine, ontstoken aderen, de primaire plaats voor transmigratie van leukocyten. Vergeleken met andere intra-vitale microscopie methoden zoals de cremaster model is deze werkwijze gemakkelijker te leren en kan in een kortere tijdsperiode worden uitgevoerd.
Een van de belangrijkste beperkingen van deze methode is dat de muizen hebben jonge om zonder veel mesenterium vet een goed zicht op de schepen hebben, zodat deze werkwijze niet kan worden uitgevoerd na lange feeding of behandeling studies.
Zodra de onderzoeker getraind kunnen verschillende ontstekingsaandoeningen worden onderzocht met deze methode, zoals de toepassing van LPS, thioglycollaat, TNFa of histamine. Specifiekere beeldvorming van bepaalde bloedcellen worden bereikt door gerichte fluorescent gelabelde moleculen. Kortom, deze werkwijze is eenvoudig te leren en een snelle manier om leukocyt-endotheel en bloedplaatjes-leukocyt interacties in een levend organisme te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 989-38-8 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5 | Sigma-Aldrich | L2637 |
References
- Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells. Methods in enzymology. 300, 462-481 (1999).
- Atherton, A., Born, G. V. Quantitative investigations of the adhesiveness of circulating polymorphonuclear leucocytes to blood vessel walls. The Journal of physiology. 222, 447-474 (1972).
- Duerschmied, D., et al. Serotonin stimulates platelet receptor shedding by tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme (ADAM17). Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 7, 1163-1171 (2009).
- Chauhan, A. K., et al. ADAMTS13: a new link between thrombosis and inflammation. The Journal of experimental medicine. 205, 2065-2074 (1084).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvascular research. 5, 384-394 (1973).
- Leister, I., et al. A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum. Surgical endoscopy. 17, 939-942 (2003).
- Duerschmied, D., et al. Platelet serotonin promotes the recruitment of neutrophils to sites of acute inflammation in mice. Blood. 121, 1008-1015 (2013).
- Herr, N., et al. Acute fluoxetine treatment induces slow rolling of leukocytes on endothelium in mice. PloS one. 9, e88316 (2014).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab animal. 40, 155-160 (2011).
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab animal. 37, 26-32 (2008).
- Duerschmied, D., Bode, C., Ahrens, I. Immune functions of platelets. Thrombosis and haemostasis. 112, 678-691 (2014).
- Wagner, D. D., Frenette, P. S. The vessel wall and its interactions. Blood. 111, 5271-5281 (2008).
- Gawaz, M., Fateh-Moghadam, S., Pilz, G., Gurland, H. J., Werdan, K. Platelet activation and interaction with leucocytes in patients with sepsis or multiple organ failure. European journal of clinical investigation. 25, 843-851 (1995).
- Sarma, J., et al. Increased platelet binding to circulating monocytes in acute coronary syndromes. Circulation. 105, 2166-2171 (2002).
- Sumagin, R., Sarelius, I. H. TNF-alpha activation of arterioles and venules alters distribution and levels of ICAM-1 and affects leukocyte-endothelial cell interactions. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 291, H2116-H2125 (2006).
