Abstract
圆锥角膜是双边和渐进的角膜扩张。为了减缓其进展，角膜胶原交联（CXL）最近已推出了作为有效的治疗选择。在生物和化学科学，交联是指活性分子之间形成新的化学键。因此，角膜胶原CXL的目的是合成地增加在角膜基质中的交联的胶原原纤维之间的形成。尽管常规CXL（C-CXL）协议的效率已经在若干临床研究表明，它可能会受益于改进的过程和除去角膜上皮的持续时间。因此，为了提供两个新的和优化的CXL协议一致的评估，我们研究圆锥角膜患者谁经历了三个CXL治疗之一：离子电渗疗法（Ⅰ-CXL），加速CXL（A-CXL），和常规CXL（ C-CXL）。 A-CXL是6时间快CXL程序ü唱了十次提高的UVA辐射，但仍然包括上皮去除。离子电渗疗法是在其中一个小电流施加到改善整个角膜核黄素渗透跨上皮非侵入性技术。使用眼前段光学相干断层扫描（AS OCT）和体内共焦显微镜（IVCM），我们的结论是关于治疗穿透深度，常规CXL协议仍然用于治疗进行性圆锥形角膜的标准。加速CXL似乎是一个快速，有效，安全的替代治疗角膜薄。利用离子导入还在调查中，应该考虑更加谨慎。
Introduction
圆锥角膜是一个双边和渐进的角膜扩张通常在一般人群1导致角膜形状的变形例中报告1 2000，从而视力下降2。圆锥角膜通常存在于早期青春期的进展，直到第三次生命不惑之年发病时通常趋于稳定，但进展可以在整个病人的生命变量。通过阻止圆锥角膜进展，交联的目的是推迟或避免角膜移植术。
到目前为止，唯一的有效和安全的治疗进步圆锥角膜证明在临床研究中是常规的角膜胶原交联（C-CXL）协议，其目的是提高刚度，从而制止圆锥角膜级数3-8。为了减少操作时间和对C-CXL其它可能的危险因素，如感染性角膜炎或基质混浊9，几种改进协议具有已有描述。首先，在加速CXL（A-CXL），UVA的更高的辐照度被传递到角膜通过减少的时间10。其次，为了避免的必要性上皮清创，跨上皮的方法已被采用。遗憾的是，他们已经时比现有协议11有限的成功。最近的跨上皮方法CXL期间角膜核黄素递送是离子电渗疗法（Ⅰ-CXL），但这种治疗方法的严格评价还未执行的12。离子电渗疗法是一种在其中一个小电流被施加穿过组织来提高离子化的药物的渗透非侵入性技术。在CXL通过离子电渗，核黄素被离子化通过上皮渗透角膜。
体内共焦显微镜（IVCM）是成像，可以突出显示异常的角膜中的疾病，如圆锥角膜13的细胞改变角膜的方法。事实上，IVCM已经证明改建在圆锥角膜的角膜所有层与在子基底神经丛的密度特定还原和基质角膜13-15。加，IVCM已被证明是对后的C-16 CXL角膜微观结构分析非常方便。
角膜分界线被描述为一个高反射线见于眼前段光学相干断层扫描（OCT AS）1个月后的C-CXL在300微米17,18的深度。 IVCM下面的C-CXL提供有关角膜的结构改变，包括缺乏角膜基质的至300μm的深度信息。此无细胞区域的深度，以及在角膜基质内的分界线的深度显示在AS OCT中，似乎与CXL治疗19和角膜分界线深度的测量的有效深度的AS OCT中1到相关联的一个月后CXL已被提出作为一种有效的临床方法的CXL效力18的评价。
在本研究中，我们使用角膜基质分界线测量由AS OCT和共聚焦显微镜研究了三种不同的角膜胶原交联的协议（常规的，加速，离子电渗疗法）的效率。此外，我们使用IVCM定量分析的三种治疗后，角膜组织变化。
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Protocol
这些协议遵循我院的人类研究伦理委员会的指导方针。
1.常规角膜胶原蛋白CXL（C-CXL）
1.患者准备
- 在手术前5天，放了一天的治疗眼1％毛果芸香碱滴两次。
- 在手术室，在无菌条件下，趴在他/她的背部病人。
- 辖表面麻醉，如奥布卡0.4％。
- 清洁眼睛和眼睛周围的皮肤用碘防腐剂两次。
- 使用盖窥器，以保持眼睛睁开。
2.上皮去除
- 马可中心9.0毫米用圆圈标记角膜角膜。
- 取出角膜上皮用生硬的抹刀中央7.0至9.0毫米乘机械清除。
3.核黄素应用
- 适用于日与20％葡聚糖0.1％核黄素 Ë角膜每分钟为20分钟。
4. UVA照射
- 照射具有370nm的波长的UVA光的角膜以3毫瓦/厘米2（5.4焦耳/厘米2表面剂量）的辐照，并在一个5厘米的工作距离为30分钟。
图1：在C-CXL UVA照射的角膜以3毫瓦/厘米2（5.4焦耳/厘米2表面剂量）的辐照，并在一个5厘米的工作距离30分钟照射370nm的波长的UVA光。 请点击此处查看该图的放大版本。
- 在辐照过程中，应用核黄素角膜每隔5分钟滴。
- 在辐照过程中，添加表面麻醉（奥布卡0.4％），如果有必要的。
- 把抗生素滴眼液（妥布霉素0.3％）和人工泪液（透明质酸下降0.18％），到运营的眼睛。
- 将软绷带隐形眼镜在手术结束，直到再上皮化完成。再上皮化通常需要3天。
- 处方止痛药如对乙酰氨基酚（500毫克）加可待因（30毫克），每日6药片。
- 后角膜再上皮，发起局部治疗与类固醇（地塞米松局部为1mg / ml），并继续进行3-4周。此外，使用人工泪液，每天4次，1个月。
2.加速角膜胶原CXL（A-CXL）
1.患者准备
- 在手术前5天，放了一天的治疗眼1％毛果芸香碱滴两次。
- 在手术室，在无菌条件下，趴在他/她的背部病人。
- 辖表面麻醉，如奥布卡0.4％。
- 清洁电子你们和眼睛周围的碘消毒剂皮肤的两倍。
- 使用盖窥器，以保持眼睛睁开。
2.上皮去除
- 标记中央9.0毫米角膜的带圈角膜标记
- 取出角膜上皮用生硬的抹刀中央7.0至9.0毫米乘机械清除。
3.核黄素应用
- 在角膜上施加0.1％的核黄素，而不葡聚糖每2分钟进行10分钟。
4. UVA照射
- 照射具有370nm的波长的UVA光的角膜以30毫瓦/厘米2（5.4焦耳/厘米2表面剂量），并在一个5厘米的工作距离为3分钟的辐照。
- 在照射，增加局部麻醉（oxybuproca＆＃239，是ne 0.4％），如果有必要的。
5.结束手术
- 将抗生素滴眼液（妥布霉素0.3％）和人工泪液（透明质酸下降0 0.18％）进入操作眼睛。
- 将软绷带隐形眼镜在手术结束，直到再上皮化完成。再上皮化通常需要3天。
- 处方止痛药如对乙酰氨基酚（500毫克）加可待因（30毫克），每日6药片。
- 后角膜再上皮，发起局部治疗与类固醇（地塞米松局部为1mg / ml），并继续进行3-4周。此外，使用人工泪液，每天4次，1个月。
3，离子透入（I-CXL）
1.患者准备
- 在手术前5天，放了一天的治疗眼1％毛果芸香碱滴两次。
- 在手术室，在无菌条件下，趴在他/她的背部病人。
- 辖表面麻醉，如奥布卡0.4％。
- 清洁眼睛和眼睛周围的皮肤用碘防腐剂两次。
- 使用盖窥器，以保持眼睛睁开。
- 应用粘被动电极的手术视野下的额头。
- 应用活性电极，一个吸环，到打开眼。释放所述抽吸之前围绕角膜的周边上的吸环。
图2.离子导入装置，该无源电极施加在手术视野下的额头和活性电极，一个吸环，适用于开放的眼睛。 请点击此处查看该图的放大版本。
3.核黄素应用
- 填写吸入环与低渗0.1％核黄素无葡聚糖。
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在I-CXL图3.核黄素的应用 。吸入环充满了低渗0.1％核黄素没有葡聚糖。 请点击此处查看该图的放大版本。
- 启动电流在0.2 mA和逐步增加至1.0毫安的5分钟（图4），总离子电渗疗法的时间。
图4.离子导入设备核黄素渗透的电流最初是0.2 mA和逐渐增加至1.0毫安。总离子导入时间为5分钟。 请点击此处查看该图的放大版本。
EP“> 4。UVA照射- 照射具有370nm的波长的UVA光的角膜以10毫瓦/厘米2（5.4焦耳/厘米2表面剂量），并在一个5厘米的工作距离为9分钟的辐照。
- 在照射，增加局部麻醉（oxybuproca＆＃239，是ne 0.4％），如果有必要的。
5.结束手术
- 将抗生素滴眼液（妥布霉素0.3％）和人工泪液（透明质酸下降0.18％），到运营的眼睛。
- 处方止痛药如对乙酰氨基酚（500毫克）加可待因（30毫克），每日6药片。
- 手术后，发起局部治疗与类固醇（地塞米松局部为1mg / ml）和持续3-4周。此外，使用人工泪液，每天4次，1个月。
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Representative Results
角膜分界线是华侨城可见的情况下，92％在301.6微米的平均深度（SD，73.6）
C-CXL后图5.分界线。高分辨率的角膜眼前段光学相干断层扫描（华侨城）可视化角膜基质分界线在358微米（白色箭头）1个月传统的角膜胶原蛋白交叉后，平均深度链接（C-CXL）。比例尺250微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
1个月后C-CXL，而之后A-CXL它在183.1微米（SD，39.6）平均深度见过的病例的85.5％。
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A-CXL后图6.分界线。高分辨率的角膜眼前段光学相干断层扫描（华侨城）可视化角膜基质分界线在176微米（白色箭头）1个月加速角膜胶原蛋白交叉后，平均深度联（A-CXL）。比例尺：250微米请点击此处查看该图的放大版本。
最后，我-CXL后，角膜分界线仅在214微米（SD，37.5）平均深度见过的病例的46.5％。下面无论是C-CXL，A-CXL或I-CXL角膜分界线深度差异有统计学显著（P <0.001和p = 0.01）。经过C-CXL和A-CXL比我-CXL（P = 0.005）后的分界线存在显著更加频繁。
I-CXL后，图7分界线。高分辨率的角膜眼前段光学相干断层扫描（华侨城）可视化角膜基质分界线的238.5微米（白色箭头）1个月后，离子导入（I-CXL平均深度）。比例尺：250微米请点击此处查看该图的放大版本。
患者随访检测到6个月应用程序的任何的三个协议，其中包括内皮细胞计数无显著差异后的任何内部或术后并发症。此外，最大K值（的Kmax）后6个月的随访保持稳定为每个协议。
表1.疗效和CXL，进化的最大K值（屈光度，D）和内皮细胞密度以下的常规（C-CXL）， 每个协议的安全加速（A-CXL）和离子导入（I-CXL）交联。
对于每个协议，在1-3个月手术后，前基质水肿与细胞外缺陷和零散的角膜基质细胞的细胞核，观察与IVCM。在6个月，前部基质与角膜细胞核复育被看见和更大之后的I-CXL比后两个其他协议。交联和非交联的角膜基质之间的分界被看作是一个区域，其中角膜变得细长，并通过大超反光基质带包围。
图8：微观CC后角膜变化XL常规胶原交联（C-CXL）后获得1个月角膜基质的体内共焦显微镜扫描（IVCM）：前基质水肿与超反射细胞质（白色箭头）和细胞外腔隙（星号）中观察到。比例尺：50μm左右。
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Discussion
用UVA照射和核黄素CXL的标准治疗为阻止圆锥角膜的进展。核黄素是光敏剂诱导化学共价键（交联）时的UVA 3照射。在角膜上，这种现象造成的胶原纤维能够提高角膜刚度之间交联。虽然这种现象被很好地描述，到现在为止已有角膜内交联的直接证据。然而，一些研究已经报道了的Kmax的稳定化从而显示出的C-CXL 3-8的有效性的步骤之后。这个效果是否是由于交联或在角膜基质等微观结构的变化的问题仍然没有答案。
其中一个CXL疗效的间接临床结果是检测为OCT和IVCM1个月CXL后角膜分界线。近日，Kymionis等。表明hyperreflectance EVAluated采用华侨城相当于无细胞和看到的共聚焦显微镜20的蜂窝区之间的过渡区。因此，看到华侨城角膜分界线必须对应于激活的角膜基质和fibroblastes的区域下脱细胞基质及以上正常的。尽管如此，山药及联营公司21未能证明CXL分界线深度之间的相关性最大K值6个月C-CXL后视力的变化。的较大量的CXL是否可导致视力和更大的减少角膜曲率的更大的增强的问题仍然是较长的术后随访研究的主题。另外，关于上IVCM平均前基质角膜密度计，在6个月内观察到显著减少，具有正常化在12个月的具有C CXL和A-CXL，并在6个月与I-CXL 22-24 。因此，不同的微观角膜变化似乎依赖于所用的胶原交联的协议的类型。这一结果和事实，即角膜分界线出现显著更深层次的C-CXL后比后，A-CXL或I-CXL让我们来讨论这三种协议的指示和有效性。
常规的协议已经证明其有效性和安全性，最大的后续的6年3-8。 C-CXL需要具有至少400微米的角膜厚度测量法，以保护内皮细胞25。其主要缺点是与持续时间（1小时），并有必要去除上皮。实际上，这导致患者的不适和疼痛，并可能导致几个并发症如感染性角膜炎和基质混浊9。然而，就目前而言，这个协议仍然建议治疗进行性圆锥角膜，尤其是在进化是积极的。
鉴于对C-CXL的主要缺点之一是第该过程电子工期，加快协议的最初目的是减少操作时间通过提供更高的辐照度角膜26。然而，减少浸泡时间至10分钟可限制核黄素进入角膜的帧内基质的渗透，从而导致所观察到的角膜浅层分界线。即使尚未见报道，尽管事实光子数相同触摸原纤维，它可能是在A-CXL的高出10倍的辐照延伸内皮损伤27的风险，28，在这方面，它是重要此言，缺乏葡聚糖的用于A-CXL核黄素可以解释，尽管高照度的情况下内皮损伤。的确，葡聚糖已知具有通向角膜变薄的过程中，并因此潜在内皮损伤29的渗透作用。因此，加速CXL似乎是一个安全CXL模式。此外，在A-CXL协议小号EEMS是有效;不愧是最大K值保持稳定在6个月随访。然而，作为C-CXL，它的主要限制是导致疼痛和潜在的并发症，如雾度和角膜感染9 desepithelialization。 Touboul 等人进行了使用与A-23 CXL治疗的患者共聚焦显微镜定性研究。事实上，相对于C-CXL的UVA-核黄素的加强效果似乎是最突出于前150-200微米以更大的角膜细胞凋亡和增加的基质的反射率的角膜。这一发现表明，患者角膜薄（350-400微米最小厚度）可以从加速CXL受益。这时，一个防低渗核黄素，导致角膜薄之前C-CXL的肿胀使用，因为该协议仍需要至少400微米的角膜测厚仪，防止血管内皮损伤25。尽管如此，加速CXL可能会喜欢entially用于在未来作为一个更快，更渗透治疗圆锥角膜稳定更薄的角膜。然而，还需要长期的研究，以决定性地关联与对角膜生物力学效果的分界线的深度。
离子电渗疗法CXL是最近开发的，以避免上皮清创12，30。应用的电流力的防低渗核黄素穿透角膜基质1跨上皮协议。 Vinciguerra和同事检查20眼而进行离子导入CXL前瞻性研究。他们表明的Kmax是稳定的1年后的程序。然而，分界线并不清楚衡量与华侨城在后续31。同样的，在我们的研究中，角膜分界线评估具有AS十月在不到一半的患者（46.5％），几乎看不到在214微米的平均深度。另外，激光共聚焦显微镜显示少得多角膜APoptosis并增加基质反射后，我-CXL后比其他两个协议。事实上，使用共聚焦显微镜和改性核黄素（Ricrolin TE）Caporossi等。研究跨上皮交联的其他协议。至于离子导入，他们发现角膜基质细胞凋亡是肤浅的（平均140微米的深度）和不均匀见于前基质11。另外，他们确认这外延ON协议导致圆锥角膜进化随访24个月后，加入了值得注意的问题，以它的儿童患者的应用程序，往往从疾病32的更积极的方式受到影响。的确，对于其他跨上皮协议，离子电渗疗法似乎并不保证在地形指标的儿科患者33的改进。此缺席疗效可以通过有限核黄素和UVA渗透原位 11,34-36上皮进行说明。的确，上皮是一个physi校准屏障为核黄素和UVA渗透，限制细胞凋亡的深度，从而角膜生物力学效应11。此外，核黄素伴随用作UV曝光28中的光敏剂和UV阻断剂。因此可以想到的是，作为其他跨上皮协议，离子电渗期间不足核黄素渗透将不仅限制了程序的功效，同时也增加的内皮细胞受损的风险。然而，没有内皮细胞丢失指出尚未离子导入后。最后，在我们的研究中，类似于Vinciguerra 等 31，6个月的I-CXL后的最高K值出现稳定。但是，它仍然从长期随访看到这个新的程序是否依然可靠。因此，与其他外延上的协议，谨慎使用离子导入时需要。尽管如此，热情跨上皮CXL是可以理解的，考虑到潜在的下降CXL并发症。与外延关CXL，发生并发症的基本上是由临时霾9造成箱子的约1％。不幸的是，这种阴霾偶尔留下角膜瘢痕。因此，我们认为，目前，离子导入CXL应慎用于儿童患者使用，我们主要提出这个协议给患者角膜薄，慢慢进展圆锥角膜。
得出结论，对于渗透，传统的CXL协议仍是治疗圆锥角膜进步的标准选项。加速CXL似乎是一种快速，有效，安全的替代治疗尤其是角膜薄。离子电渗疗法用前角膜的损伤小和较不可见分界线相关联，并且因此应考虑以更大的谨慎。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Riboflavin Product number | |||
| C-CXL | Sooft SPA, Montegiorgio, Italy | Ricrolin 468465-6 | |
| A-CXL | Avedro Inc, Waltham, Massachusetts | VibeX 520-01863-006 | |
| I-CXL | Sooft SPA, Montegiorgio, Italy | Ricrolin+ 975481-6 | Passive electrode: PROTENS ELITE 4848LE/ Active electrode: IONTOFOR CXL |
| UVA Machine | |||
| X-Vega | UVA: 3 mW/cm2 30 min | ||
| KXL System | UVA: 30 mW/cm2 10 min | ||
| X-Vega | UVA: 10 mW/cm2 9 min |
References
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