Summary
Här presenterar vi ett protokoll som bygger på ryggmärgsskivor odlade på flera elektrodanordningar för att studera funktionell regenerering av propriospinal anslutningar in vitro.
Introduction
Organotypic slice kulturer i det centrala nervsystemet (CNS) har använts i stor utsträckning för att studera olika fysiologiska och patologiska fenomen som sträcker sig från neuronal utveckling till neurodegeneration. Jämfört med dissocierade cellkulturer, organotypic skivor erbjuder fördelen med mer komplexitet med en intakt cytoarchitecture och lokal synaptiska kretsar. Samtidigt, kan vävnaden analyseras i ett isolerat sätt utan behov av att blanda in intrikat av hela in vivo sammanhang. Dessutom är enkel och upprepad tillgång till cellerna av val motiverat, den extracellulära miljön kan styras exakt och vanligtvis, in vitro-modeller är mindre kostsamma än deras in vivo motsvarigheter. Under de senaste åren, olika studier presenteras slående likheter mellan de utvecklings profilerna för långtidskulturer jämfört med motsvarande levande djur 1,2. Det har visats att neuronala kretsar av olika CNS-regions uttrycker spontan nätverksaktivitet under utveckling och att organotypic skivor delvis behålla detta fenomen 3 -7. Isolerade ryggmärgs preparat har speciellt använts för att undersöka rytmgenerering 6 och bildandet av neuronala kretsar 1.
Ett sätt att spela den spontana aktiviteten hos organotypiska skivor är att kultur dem ovanpå multi-elektrod arrayer (MEA). Dessa enheter innehåller flera elektroder som kan övervaka extracellulära potentialer som genereras av aktionspotentialer från många celler samtidigt (multi-enhet inspelning). Den höga tidsupplösning av MEA inspelningar kan användas för att rekonstruera de exakta aktivitets dynamiken inom en given neuronal krets. Dessutom,-kläm patch tekniken står i kontrast till icke-invasiv, vilket möjliggör långtidsmätningar och resultat i det faktum att nervceller inte påverkas i sitt beteende.
Feller syftet med denna studie var kombinationen av organotypic ryggmärgs samkulturer och flera platser inspelningar som används för att undersöka funktionell förnyelse inom ryggmärgen. Eftersom vuxna högre ryggradsdjur har begränsad potential att återhämta sig från skador på ryggmärgen, har olika strategier studerats för att främja regenerering efter ryggmärgsskada. Hittills har kortikospinala vägarna oftast stått modell valfrihetssystem för sådana undersökningar. Dessa experiment är typiskt tidsödande, kostsamma och kräver stora djur kohorter på grund av hög variabilitet inom enskilda grupper. Dessutom tyder allt på att propriospinal anslutningar (neuroner som helt är begränsade i ryggmärgen) kan spela en central roll i återhämtningsprocessen efter ryggmärgsskador 8. Dessa fibrer är svåra att studera in vivo utan inblandning av stigande och fallande fiber skrifter. Bonnici och Kapfhammer 9 används längsgående ryggmärgenslice kulturer av postnatal möss som ett alternativt tillvägagångssätt. Efter att ha utfört mekaniska skador de analyserade halv kvantitativt morfologiska regenerering av axoner mellan ryggmärgssegmenten. De observerade mindre men inte ingen axoner korsar lesionsstället i kulturer skurna på en mogen ålder. Däremot kulturer som skadade vid en yngre skede visade en stor mängd av axonal regeneration 5 - 7 dagar efter skadan. Men bevis för funktionella anslutningar presenterades inte.
Därför kan utvecklingen av en representant i modell av propriospinal fibrer vitro som gör utredningen av funktionell regenerering vara ett värdefullt verktyg för att utöka vår kunskap om regenerativa processer i ryggmärgen.
Protocol
Djuromsorg var i enlighet med riktlinjer som godkänts av schweiziska lokala myndigheter (Amt für Landwirtschaft und Natur des Kantons Bern, Veterinärdienst, Sekretariat Tierversuche, godkännande NRS. 52/11 och 35/14). Riktlinjerna är i överensstämmelse med Europeiska gemenskapens direktiv 2010/63 / EU.
Obs: Arbeta i ett laminärt flöde huva med sterila instrument och lösningar för alla steg 1 - 5 inklusive delsteg.
1. Framställning av MEA
Anmärkning: MEA består av ett glassubstrat, mikrometallelektroder och en SU-8 polymerisoleringsskikt (även se Tscherter m fl 3.). För syftet med denna studie var kommersiellt tillgängliga MEA beställs med en anpassad elektroduppsättning layout (figur 1 A & B). De 68 elektroderna är anordnade i ett rektangulärt rutnät som är uppdelad i två zoner genom en 300 | im brett spår fri från elektroderna, elektrtiska ledningar och isolering. Varje elektrod är 40 x 40 ^ m i storlek och de är åtskilda från varandra med 200 | am från centrum till centrum. Fyra stora jordelektroder är placerade runt inspelningsplatsen. De skiljer sig från andra kommersiellt tillgängliga standard MEA i deras storlek (21 mm x 21 mm) och de har ingen fast inspelningen kammaren.
- För desinfektion skölj MEA i 100% etanol (2x), 70% etanol (1 x) och destillerat vatten (2x) under minst 30 sekunder vardera. Låt torka. Sätt 10 - 12 MEA i ett rent glas petriskål (150 mm x 25 mm) och stäng locket.
- Autoklav MEA för 20 minuter vid 120 ° C. Förvara vid RT.
- Framställa bestrykningslösningen (se material lista) för MEA och lagra alikvoter vid -20 ° C.
- Lägg varje MEA i en individuell steril petri-skål (35 mm x 10 mm).
- Använd en kyld pipett att sätta 150 il kyld beläggningslösning ovanpå elektroderna och stäng locket på petriskål. Efter ca 10 minuter, kontrollera om det finns luftbubblor ovanpåelektroderna och försiktigt bort dem med en gummiklädd spatel om det behövs. Låt vila i 1 timme vid RT.
- Aspirera beläggningslösningsrester, tvätta 1x med medium optimerad för prenatal och embryonala nervceller och 2x med destillerat, sterilt vatten. Om MEA inte används förrän nästa dag, hålla dem i destillerat, sterilt vatten vid 37 ° C i inkubatorn O / N. Annars låt direkt torka vid RT.
2. ingredienser som krävs för utformning och Tillväxt av Organotypiska kulturer
- Förbered kalciumfri tvättlösning (se materiallista).
- Bered kyckling plasma i tvättlösning (1: 1, skaka försiktigt, undvika bildning av bubblor), centrifugera vid 3000 xg under ca 20 minuter och dekantera den klara innehåll i ett sterilt rör. Alikvotera 200 pl i cryotubes och förvara vid -20 ° C.
- Rekonstituera trombin från bovint plasma därefter (200 U / ml) och sterilfilter (0,2 | im por-filter). Alikvotera 200 ^ till crytotubes och förvara vid -20 ° C.
- För 30 kulturer förbereda 100 ml näringsmedium (se materiallista).
3. Ryggmärgs Tissue Dissection
Obs: procedur ger, beroende på antalet embryon, ryggmärg skivor i ca 25 - 35 samodlingar och framställs i en huv med laminärt flöde under sterila betingelser.
- Applicera en letal dos av pentobarbital (0,4 ml) till moderdjuret genom intramuskulär injektion. Bekräfta djup anestesi genom att kontrollera pedaltillbakadragande reflex. Leverera E14 råtta embryon genom kejsarsnitt och offer genom halshuggning.
- Överför kroppar embryona i en petriskål fylld med steril, kylda, tvättlösning.
- Utför en komplett tvärgående snitt med en skalpell över bakbenen och en annan en ovanför frambenen och ta bort benen från kroppen. Därefter gör ett snitt i frontalplanet för att separera inälvor från bakstycket innehåller spinal cord.
- För skivning, överföra bakstyckena innehållande ryggmärgen en i taget på en monteringsskiva och skär vid en tjocklek av 225 - 250 | im med en vävnadskvarn. Sätt en droppe av tvättlösning på den hackade vävnaden och överföra skivor med en spatel i 35 mm x 10 mm petriskålar fyllda med sterilt, kylda, tvättlösning.
- För varje skiva för sig, dissekera ryggmärg från kvarvarande vävnad. Lämna dorsalrotsganglier bifogas.
- Låt skivorna vila i 1 h vid 4 ° C.
4. Montering ryggmärgsvävnad skivor på MEA
- Värm upp sterilt näringsmedium i inkubatorn (37 ° C, lätt skruvas locket för syresättning).
- Position MEA med sterila pincett med gummiklädda tips vid RT i petriskålen under ett stereomikroskop med elektroduppsättningen i fokus. Centrera en 6 il droppe av kyckling plasma på den rena, dammfri och steril elektrodgruppen. Med hjälp av en liten spatel, försiktigt glidatvå ryggmärgs sektioner med ventrala sidor mot varandra i plasma droppen. Rör inte elektroderna med spateln.
- Tillsätt 8 | il trombin runt kycklingplasma droppen. Använda trombin pipettspetsen försiktigt blanda och sprida kyckling plasma / trombin blandning runt de två skivorna. Återigen, inte röra spröda elektrodgruppen direkt. Strax före koagulering, aspirera överskott kyckling plasma / trombin.
- Cap petriskålen för att bibehålla hög fuktighet medan MEA / odlingsaggregatet sitter i ungefär en timme i en fuktad kammare inuti inkubator vid 37 ° C.
- Försiktigt 10 pl av näringsmedium till odlingskammaren, cap petriskålen och läggs tillbaka i inkubatorn i ca 30 min.
- Placera varje MEA / kultur montering med sterila, gummiklädda tips till en rulle rör, tillsätt 3 ml näringsmedium och tätt stänga locket. Placera rullgardinsröret i valstrumma roterar med en - två varv per minut i inkubatorn i en 5% CO
- Ändra hälften av näringsmediet efter 7 dagar in vitro (DIV) och efteråt 1 - 2 gånger per vecka.
5. Mekaniska Lesioner
- Ta MEA / kulturenhet med sterila, gummiklädda tips ur rullröret och placera i en petriskål utan näringsmedium under ett stereomikroskop med vävnaden i fokus. Visuellt kontrollera att de två skivorna är sammansmälta.
- Håll MEA / kultur enheten stadigt genom att placera pincett med gummiklädda tips på MEA.
- Placera ett skalpellblad i spåret av MEA nära vävnadsskivor. Håll skalpell snarare horisontellt.
- Lyft skalpell hantera upp men låt skalpellbladet stannar i spåret av MEA på ett sådant sätt att blad "rullar" från bas till spets och därigenom skär genom vävnad som täcker spåret.
- Svåra eventuella kvarvarande vävnad anslutningar med en 25 G-nål tips om necessary. Arbeta endast i området i spåret och inte röra förfrågnings kanterna.
- Sätt MEA / kulturenhet tillbaka till rullröret. Ge 3 ml färskt näringsmedium till kulturerna och placera dem tillbaka in i rulltrumman i inkubatorn.
6. elektrofysiologiska inspelningar av spontan aktivitet
- För att undersöka funktionell förnyelse bland de två ryggmärgsskivor efter det valda antalet DIV, montera MEA / kulturenhet i en inspelning kammare på ett mikroskop och tillämpa cirka 500 pl extracellulärt lösning (se materiallista).
- Vänta 10 minuter innan den första inspelningen att tillåta systemet att stabilisera sig.
- Rekord grundläggande spontan aktivitet 2x för ca 10 min från varje verksamhet detekteringselektrod av MEA vid RT.
- För att säkerställa stabila extracellulära förhållanden, utbyta extracellulärt lösning efter varje inspelningssession.
- Att disinhibit nätverket tillämpa extracellulärt lösning containing stryknin (1 M) och gabazine (10 M). Vänta minst 2 minuter innan du startar inspelningen.
7. Data Analysis
Obs: För detektion av de extracellulärt inspelade aktionspotentialer använda för varje elektrod en detektor baserad på standardavvikelser och en efterföljande diskriminator. Denna procedur beskrivs i detalj i Tscherter et al., 3.
- Visa den detekterade neuronal aktivitet hos varje elektrod i ett rasterdiagram enligt standardförfaranden 3 (figur 1F).
- Bestäm och visa den totala nätverksaktivitet för varje skiva genom att summera antalet händelser i enlighet kanalerna inom ett skjutfönster på 10 ms, flyttas med 1 ms steg (Figur 1G och se et al. Tscherter 3).
- Identifiera i varje skiva individuella skurar (kluster av aktivitet som visas på flera elektroder). Därför, Ställa in en minimal toppaktivitet tröskel motsvarande totala nätverksaktivitet och definiera varje brast start och brast slut. Till exempel är en lämplig tröskel 25% av den genomsnittliga skur amplitud och en sprängstart kan definieras genom att vara den första händelsen i ett tidsfönster på minst 5 ms, en brast ände genom att vara den sista händelsen i ett tidsfönster på minst 25 msek (se Heidemann et al. 10).
- För att kvantifiera funktionell regenerering beräkna den procentuella synkroniserade skurar mellan de två segment. För att göra detta, beräkna latensen mellan en skur i en skiva och följande brast i andra segment.
Anmärkning: En skurparet benämns "synkroniserad", när latensen är mindre än den genomsnittliga skurlängden. Särskilt i co-kulturer med en hel del aktivitet, finns möjligheten att båda sidor initiera tillfällighet en explosion i den valda latens fönstret. Detta faktum måste tas i beaktande vid kvantifiering av den procentuella andelen av SYnchronized skurar. För en detaljerad beskrivning av beräkningarna se Heidemann et al., 10.
8. Fixering av kulturer och immunohistokemi
- För alla åtgärder som inkluderar tvätt eller inkubation se till att sätta odlingarna på ett lutande bord för att säkerställa korrekt diffusion av lösningen genom vävnaden.
- Direkt efter inspelningen är klar tar MEA / kultur montering av installationen, placera den i en petriskål (35 mm x 10 mm) och tillsätt ca 2 ml extracellulärt lösning.
- För att separera skivorna från de omgivande skikten cell som har bildats under den tid in vitro, ta en 10 mikroliter pipettspets och cirkeln skivorna. Uppmärksamma att inte skada kulturer. Det är möjligt att hoppa över detta steg, men bädda senare är lättare när det sker.
- Använd en tunn icke-metalliskt sprutnål (se material lista) i kombination med en 1 ml spruta fylld med extracellulärt solutipå att försiktigt blåsa kulturen utanför MEA.
- Avlägsna spetsen av en Pasteurpipett och montera gummi lampan på slivered änden. Använd den bakre änden för att överföra odlingen i fixativ (4% paraformaldehyd med fosfatbuffrad saltlösning (PBS, 0,1 M)). Använd inte standard spetsen av pasteurpipett för överföringen, eftersom den är för liten och kulturerna skulle vikas och förmodligen skadas. Fix för ett - två h vid 4 ° C. Skölj MEA med destillerat vatten och avlägsna vävnadsrester med fingertopparna men inte repa med nageln. Förvara MEA i destillerat vatten vid 4 ° C
- Tvätta kulturerna 3x i PBS under minst 10 min vardera. Förvara i PBS vid 4 ° C eller direkt börja med färgningsproceduren.
- Inkubera kulturerna under minst 90 minuter i blockeringslösning (5% getserum, 1% bovint serumalbumin, 0,3% detergent i PBS).
- Lägg till det första antikropp utspädd i blockeringslösning och inkubera under 3 nätter vid 4 ° C.
- Tvätta 3x i PBS under löster 30 min vardera.
- Tillsätt andra antikropp spädd i PBS under 2 h vid RT.
- Tvätta 3x i PBS under minst 30 min vardera.
- Överför skivorna med en Pasteur-pipett med avlägsnad spets på ett objektglas. Ta bort överflödigt PBS och bädda med monteringsmedium.
Representative Results
För att undersöka potentialen för funktionell återhämtning av samodlingar härrör från ryggmärg från E14 råttembryon, har skador som utförs i ett tidsfönster på 8-28 DIV. 2 till 3 veckor senare var den spontana nervaktivitet registrerades med MEA (Figur 1 C & D). De extracellulärt inspelade aktionspotentialer identifierades offline för varje enskild elektrod (Figur 1E). Från dessa data raster tomter genererades (Figur 1F), följt av nätverksaktivitet tomter att visualisera den totala aktiviteten separat per sida (figur 1G). I varje skiva den spontana aktiviteten vanligtvis organiserad i skurar. Om skivorna är funktionellt anslutna, kan dessa skurar fortplanta sig från en skiva till en annan. Därför bestämdes mängden synkroniserade skurar mellan de två segment beräknas för att kvantitativt mäta den funktionella regenerering. För en detaljerad beskrivning av hur omvandlingen into de olika tomterna utförs och hur formeln för att beräkna andelen synkroniserade aktivitet härleddes, se Heidemann et al. 10.
I alla experiment, bestämdes aktiviteten första registrerade under standardbetingelser. I ett andra steg, var synaptisk hämning blockerades genom tillsats av stryknin (1 | iM) och gabazine (10 | iM) till den extracellulära badlösningen. Denna avhämning leder vanligtvis till en mer regelbunden aktivitetsmönstret med förlängda skurar och skurintervall, vilket underlättar definitionen av skurar och därmed bestämningen av skursynkronisering mellan skivorna.
Kulturer skadade vid en ung ålder (7-9 DIV) uppvisade en stor mängd synkroniserad aktivitet 2-3 veckor efter skada medan kulturer skadade i senare skeden (> 19 DIV) visade en tydlig minskning i förmågan att regenerera (Figur 2 A - F). Dessa fynd tyder på att regenereringsförmågafunktionella anslutningar i ryggmärgen slice kulturer minskar från en hög nivå, som representerar embryonala tillstånd in vivo, till en låg nivå, vilket motsvarar den vidareutvecklade tillstånd in vivo, inom tre veckor i odling.
Vilka typer av anslutningar faktiskt inblandade i brast synkronisering mellan de två skivorna? Förutom propriospinal anslutningar, kan fibrerna också uppstå från motoneurons eller dorsalrot ganglieneuroner. Det har tidigare visats att dorsala ganglieneuroner inte är relevanta för den funktionella anslutning mellan ryggmärgen skär 10. Men medverkan av motoneuroner förblev en möjlighet. Eftersom motoneurons är kända för att bilda kolinerga anslutningar till ryggmärgs nervceller genom nikotinreceptorer 13, var aktiviteten hos ryggmärgs samkulturer registreras vid 8 DIV, en tid då kulturerna visar starkt synkroniserad aktivitet 10 och nikotin antagonisten Mecamylamin (MEC, 100 pM) sattes till den extracellulära badlösningen. En deltagande motoneuroner i samband mellan de två skivorna skulle leda till en minskad andel av synkroniserad aktivitet. Men detta var inte fallet (MEC: 91,0 ± 4,5%, n = 7, kontroll: 93,6 ± 4,6%, n = 7, p> 0,05, matchade Wilcoxon par test). Dessa resultat tyder på att kolinerga synapser inte bidrar till den funktionella kopplingen mellan skivor. Eftersom emellertid motoneuroner har också visats frisätta glutamat vid synapser i CNS 11, 15, dessa experiment inte helt utesluter deras engagemang.
För att identifiera motoneurons immunhistokemiska färgningar mot icke-fosforylerade neurofilament H med SMI-32 genomfördes. De avslöjade flera märkta stora cellkroppar som är typiska för motoneuroner, fördelade över skivor (figur 3A). SMI-32-antikropp har rapporterats för att märka cellkroppar motoneurons 12 och detta fynd gäller även för de använda kulturer 13. Även färgningar av neuronala cellkroppar i allmänhet, till exempel, mot B-III-tubulin eller Neun samt gliaceller cellkroppar, t ex., Astrocyter med GFAP antikropp är i linje med andra rapporter och matcha morfologiska beskrivningar av dessa celltyper ( Figur 3 B - D). Ändå är märkningen av axoner med SMI-32-antikropp om (figur 3E). Mot förväntningar, visas ett stort nätverk av fibrer vid användning av denna antikropp och det liknar SMI-31 färgning som märker fosforylerad neurofilament H (Figur 3F). En tolkning av detta resultat kan vara att utvecklings reglering av neurofilament fosforylering / defosforylering är inte lika hårt i de använda kulturer jämfört med in vivo situationen. En blandad förekomst av fosforylerade och icke-fosforylerade neurofilament i samma axon kan EXPLain detta konstaterande. En annan möjlighet är att SMI-32 märkta axoner härrör från projektions nervceller. Tsang och kollegor 16 har visat att till exempel, är Clarks kolumn och intermediolateral cellkolonn nervceller färgas av SMI-32 förutom motoneurons. Uttalade neurite spridning av sådana nervceller kan också förklara det överflöd av SMI-32 positiva fibrer.
Figur 1. Visa och analys av spontan aktivitet. (A) Diagram av en MEA. Platina belagda elektroder visas i svart, de transparenta trådar i rött och spåret i mitten av MEA i gult. (B) Närbild av elektroduppsättningen beläget i centrum av MEA. Diagrammen vänligen tillhandahållen av Dr. M. Heuschkel. (C) Bright fält bilden av en 8 DIV gammal culture. Skivorna har vuxit och fuseras längs sidorna vända mot varandra. Det gula fältet representerar electrode- och isolering fritt spår av MEA. Skala bar = 400 m (D) Timeline av experiment. Två ryggmärgs skivor av E14 råttembryon är placerade bredvid varandra på MEA. Inom några dagar, skivorna växa och säkring längs sidorna vända mot varandra. I en tidsram på 8-28 DIV är kompletta skador utförs genom fusionsstället. Två till tre veckor senare spontan aktivitet registreras och kulturerna fastställs för immunohistokemiska färgningar. (E) spontan aktivitet spår av varje enskild elektrod av en 23 DIV gammal kultur. För klarare visualisering, endast varannan spår illustreras. Orange spår visar aktivitet som har spelats in från skivan på höger sida, blå spår från den vänstra sidan. De flesta av de skurar synkroniseras mellan de två. Pilen pekar på en skur som förekommer i den vänstra skiva som bara partially fortplantas till rätt skiva. Aktiviteten i rätt skiva men inte når den valda tröskeln till minst 25% av den genomsnittliga maximala toppaktivitet av enligt sida och därför inte detekteras som en skur. Förstoringar till höger visar den sista synkroniserade skur par. (F) Raster diagram över aktiviteten som visas i (E). (G) Nätverks tomt med definierade skurar (staplar under baslinjen) för den verksamhet som visas i (E). Anpassad från Heidemann et al. 10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Synkroniserad kontra Inte Synkroniserad aktivitet. (A, B) Raster tomter kulturer lesioned vid en ung ålder (vid 7-9 DIV), visar synkroniserad aktivitet under standardbetingelser (A) och under disinhibition (B). (C, D) Raster tomter av kulturer skadade vid en hög ålder (vid> 19 DIV), visar inte synkroniserade aktivitet under standardbetingelser (C) och under disinhibition (D). (E, F) Genomsnittlig procentsats av synkroniserad aktivitet ritas upp för varje enskild skada dag registrerats under standardbetingelser (E) och under disinhibition (F). Inspelningar togs 2 - 3 veckor efter dagen för lesionen. Anpassad från Heidemann et al. 10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figure 3. Immunohistokemisk karakterisering. (A) Färgning av motoneuronal cellkroppar med SMI-32. (B) β-III tubulin märkning av mogna neuronal cellkroppar och deras processer. (C) Identifiering av astrocyter med GFAP. (D) Märkning av mogna neuronal cellkroppen med Neun. (E) SMI-32 färgning av icke-fosforylerade neurofilament H. (F) Fosforylerat neurofilament H identifierats av SMI-31. Anpassad från Heidemann et al. 10. Notera att med båda, är SMI-31 och SMI-32, ett stort nätverk av fibrer synliga i odlingarna. Barer AD = 20 pm, H & F = 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Flera inslag i den presenterade förfarandet är grundläggande för att utföra exakta och reproducerbara experiment. Alla steg under framställningen av MEA, lösningar och produktionen av de slice kulturer utförs under sterila förhållanden i ett dragskåp med laminärt flöde. Antibiotika tillämpas inte på näringsmediet, eftersom de kan påverka den spontana aktivitet 14. Under MEA beläggningen är den viktigaste delen för att se till att den extracellulära matrisen gellösningen förblir kallt hela tiden. Tina den i kylskåpet och hålla den på is för hela förfarandet för att säkerställa en maximal temperatur nära 0 ° C. Under beredningen av skivor snabb isolering och sektionering, samt att uppmärksamma en låg temperatur med hjälp av iskalla dissektion buffertar ökar andelen friska kulturer. Dessutom är plasma / trombin koagulation en av de mest kritiska stegen. Se först till att plasma är korrekt mixed med trombin. För det andra, ägna särskild uppmärksamhet åt att ta bort så mycket återstod som möjligt för att säkerställa korrekt fastsättning av skivorna till MEA. Detta steg är extremt tidskänsliga; om tidsramen är för kort, för mycket av plasmat / trombin blandningen avlägsnas. Om tidsramen är för lång, koagulation redan skett, vilket ökar risken för att ta bort skivorna tillsammans med den kvarvarande plasma / trombin.
Om mekaniska skador planeras, är det viktigt att använda MEA med en noggrann design. Området där lesionen är avsett måste vara fria från elektroder, trådar och isolering. Annars är el av MEA kommer att vara skadad och därför kan inga inspelningar utföras längre.
En annan avgörande steg avser storleken av lesionen. Det har visats att återansluta två unga skivor efter lesionen tar ungefär två dagar 10 tidigare. För alla experiment tumregeln används att utrymmet betwesv skivorna efter lesionen bör inte vara större än bredden hos MEA spåret (300 | im). En större lesionsstorlek kan resultera i ett längre tidsperspektiv för återanslutning eller om skadan är för stor, ingen återkoppling alls. För att kommentera, avslöjade tidigare experiment som ett första utsläppandet av de två skivor längre bort än 1 mm resulterar i en mycket låg anslutningshastighet.
Innan starten av inspelningarna, en justering av åtminstone 10 minuter till RT, i stället för 37 ° C i inkubatorn, och till den extracellulära lösningen, i stället för den nutrition medium rekommenderas. Noggrann observation av aktivitetsmönstret under dessa initiala minuter säkerställer att de uppmätta data representerar bristningsmönstret av kulturen på lämpligt sätt efter inspelningen påbörjades.
För detektion av aktiviteten, datainsamling och vidareförädling, hemlagad hårdvara (inspelning kammare, anslutningar till förstärkare och förstärkare), program i LabVIEW, C ++ och IgorPro används. Kommersiella MEA uppställningar och andra mjukvarupaket lämpar sig även för dessa operationer. Här är signalerna ses av elektrod amplifierade 1001 gånger, och digitaliseras sedan med en hastighet av 6 kHz.
Den presenterade modellen kan vara ett användbart verktyg för att undersöka propriospinal anslutningar eftersom in vivo, de är svåra att studera utan inblandning av stigande och fallande fiber skrifter. Samtidig odling av två ryggmärgsskivor kan elegant kringgå denna fråga. Kulturerna ger en mikromiljö som kan vara hårt kontrollerad och lättmanipulerade. Å andra sidan, är supraspinala och sinnesintryck naturligtvis saknas. Dessutom representerar förfarandet enligt odlings beredningen en situation av CNS-skada. Gliaceller som astrocyter och mikroglia är kända för att svara på lesioner med ökad proliferation och därför är vävnaden i viss utsträckning omorganiseras. Avseende den presenterade lägetl bildandet av en gliaceller ärr efter att ha utfört mekaniska skador observerades inte. En förklaring kan vara att adaptiva mekanismer för astrocyter redan utlöstes under förberedelsearbetet och att skador på kulturerna inte resultera i en ytterligare svar. Dessutom finns det inga bevis för att involvera myelin tillhörande hämmare, t ex., Nogo-A, i det låga regenereringspotential kulturer skadade vid en hög ålder. Men visade det sig att behandling med fosfodiesteras 4-hämmare Rolipram, startar direkt efter att ha utfört skador på 23 DIV ökar funktionell regenerering mellan skivorna 10. Dessa resultat visar att funktionell återhämtning kan ökas i gamla kulturer. Märkbart, när man räknar antalet axoner korsar lesionsstället, ingen skillnad mellan kulturer skadade vid en ung ålder och kulturer skadade vid en ålder upptäcktes. Dessa fynd tyder på att bristen på axonal regenerering är inte den största anledningen feller förlust av återhämtning efter sena skador i kultur och därför understryka behovet av en modell som gör det möjligt för funktionell analys av förnyelse. Synaptic bildning och synaptisk plasticitet skulle kunna spela en viktig roll i återhämtningsprocessen 10. Dessa mekanismer fått en hel del uppmärksamhet under de senaste åren och det är numera allmänt accepterat att de har en stor inverkan på resultatet efter ryggmärgsskada. Därför kan en modell som ger stabila förutsättningar för att undersöka dessa processer i isolering och i detalj säkert bidra till att få insikt om funktionell förnyelse i ryggmärgen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Planar multielectrode array | Qwane Biosciences | custom-made according to the design of our lab | |
| Nutrient medium | For 100 ml | ||
| Dulbeccos modified Eagle's medium | Gibco | 31966-021 | 80 ml |
| Horse serum | Gibco | 26050-070 | 10 ml |
| distilled, sterile water | 10 ml | ||
| Nerve growth factor-7S [5 ng/ml] | Sigma-Aldrich | N0513 | 200 µl |
| reconstituted in wash solution with 1% BSA | |||
| Coating solution | |||
| Extracellular matrix gel | BD Biosciences | 356230 | Must stay cold at all times; dilute 1:50 with medium optimized for prenatal and embryonic neurons |
| medium optimized for prenatal and embryonic neurons | Gibco | 21103-049 | |
| Wash solution | [mg/L] | ||
| MgCl2-6H2O | 100 | ||
| MgSO4-7H2O | 100 | ||
| KCl | 400 | ||
| KH2PO4 | 60 | ||
| NaCl | 8,000 | ||
| Na2HPO4 anhydrous | 48 | ||
| D-Glucose (Dextrose) | 1,000 | ||
| According to the protocol on http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html | |||
| Extracellular solution (pH 7.4) | [mM] | ||
| NaCl | 145 | ||
| KCl | 4 | ||
| MgCl2 | 1 | ||
| CaCl2 | 2 | ||
| HEPES | 5 | ||
| Na-pyruvate | 2 | ||
| Glucose | 5 | ||
| Blocking Solution | |||
| Detergent: Triton X-100 | 0.3%, harmful if swallowed | ||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | 1% |
| Goat serum | Gibco | 16210-064 | 5% |
| Chicken Plasma | Sigma-Aldrich | P2366 | Lyophilized, reconstitute with wash solution |
| Gabazine | Sigma-Aldrich | SR-95531 | |
| Mecamylamine hydrochloride | Tocris | 2843 | toxic if swallowed |
| Micropipette | World Precision Instruments, Inc. | MF28G-5 | |
| Paraformaldehyde | harmful, 4% | ||
| SMI-31 | Covance | SMI-31P | |
| SMI-32 | Covance | SMI-32R-500 | |
| Strychnine | Sigma-Aldrich | S0532 | toxic |
| Thrombin | Merck Millipore | 1123740001 | irritant, sensitizing, reconstitute with wash solution |
| Tissue culture flat tube 10 (= roller tube) | Techno Plastic Products AG | 91243 | |
References
- Avossa, D., Rosato–Siri, M., Mazzarol, F., Ballerini, L. Spinal circuits formation: a study of developmentally regulated markers in organotypic cultures of embryonic mouse spinal cord. Neuroscience. 122 (2), 391-405 (2003).
- Cifra, A., Mazzone, G. L., Nani, F., Nistri, A., Mladinic, M. Postnatal developmental profile of neurons and glia in motor nuclei of the brainstem and spinal cord, and its comparison with organotypic slice cultures. Dev Neurobiol. 72 (8), 1140-1160 (2012).
- Tscherter, A., Heuschkel, M. O., Renaud, P., Streit, J. Spatiotemporal characterization of rhythmic activity in rat spinal cord slice cultures. Eur. J. Neurosci. 14 (2), 179-190 (2001).
- Czarnecki, A., Magloire, V., Streit, J. Local oscillations of spiking activity in organotypic spinal cord slice cultures. Eur. J. Neurosci. 27 (8), 2076-2088 (2008).
- Kirkby, L. A., Sack, G. S., Firl, A., Feller, M. B. A role for correlated spontaneous activity in the assembly of neural circuits. Neuron. 80 (5), 1129-1144 (2013).
- Ballerini, L., Galante, M., Grandolfo, M., Nistri, A. Generation of rhythmic patterns of activity by ventral interneurones in rat organotypic spinal slice culture. J. Physiol. (Lond.). 517 ((Pt 2)), 459-475 (1999).
- Hanson, M. G., Landmesser, L. T. Normal patterns of spontaneous activity are required for correct motor axon guidance and the expression of specific guidance molecules). Neuron. 43 (5), 687-701 (2004).
- Courtine, G., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nat. Med. 14 (1), 69-74 (2008).
- Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model. Eur. J. Neurosci. 27 (10), 2483-2492 (2008).
- Heidemann, M., Streit, J., Tscherter, A. Functional regeneration of intraspinal connections in a new in vitro model. Neuroscience. 262, 40-52 (2014).
- Nishimaru, H., Restrepo, C. E., Ryge, J., Yanagawa, Y., Kiehn, O. Mammalian motor neurons corelease glutamate and acetylcholine at central synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (14), 5245-5249 (2005).
- Tsuji, S., et al. Proteasome inhibition induces selective motor neuron death in organotypic slice cultures. J. Neurosci. Res. 82 (4), 443-451 (2005).
- Magloire, V., Streit, J. Intrinsic activity and positive feedback in motor circuits in organotypic spinal cord slice cultures. Eur. J. Neurosci. 30 (8), 1487-1497 (2009).
- Bahrami, F., Janahmadi, M. Antibiotic supplements affect electrophysiological properties and excitability of rat hippocampal pyramidal neurons in primary culture. Iran. Biomed J. 17 (2), 101-106 (2013).
- Mentis, G., et al. Noncholinergic excitatory actions of motoneurons in the neonatal mammalian spinal cord. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A.. 20 (102), 7344-7349 (2005).
- Tsang, Y. M., Chiong, F., Kuznetsov, D., Kasarskis, E., Geula, C. Motor neurons are rich in non–phosphorylated neurofilaments: Cross– species comparison and alterations in ALS. Brain Res. 861 (45–58), (2000).
