Summary
यहाँ हम इन विट्रो में propriospinal कनेक्शन के कार्यात्मक उत्थान का अध्ययन करने के लिए बहु-इलेक्ट्रोड सरणियों पर संवर्धित रीढ़ की हड्डी की स्लाइस पर आधारित है कि एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे।
Introduction
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के organotypic टुकड़ा संस्कृतियों neuronal विकास से neurodegeneration तक पहुँचने के लिए विभिन्न शारीरिक और रोग की घटनाओं का अध्ययन करने के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है। अलग सेल संस्कृतियों की तुलना में, organotypic स्लाइस एक अक्षुण्ण cytoarchitecture और स्थानीय अन्तर्ग्रथनी circuitry के साथ अधिक जटिलता का लाभ प्रदान करते हैं। इसी समय, ऊतक विवो संदर्भ में पूरी की जटिलता को फंसाने के लिए आवश्यकता के बिना एक अलग तरह से विश्लेषण किया जा सकता है। इसके अलावा, चुनाव की कोशिकाओं के लिए आसान और बार-बार उपयोग, warranted है बाह्य वातावरण ठीक से नियंत्रित किया जा सकता है और आम तौर पर, इन विट्रो मॉडल उनके इन विवो समकक्षों की तुलना में कम महंगे हैं। हाल के वर्षों में, विभिन्न अध्ययनों इसी रहने वाले जानवरों 1,2 बनाम दीर्घकालिक संस्कृतियों के विकास की प्रोफाइल के बीच हड़ताली समानता प्रस्तुत किया। यह विभिन्न सीएनएस Regio की कि neuronal सर्किट दिखाया गया हैएनएस विकास के दौरान सहज नेटवर्क गतिविधि को व्यक्त करने और organotypic स्लाइस आंशिक रूप से इस घटना 3 -7 का कहना है कि। पृथक रीढ़ की हड्डी की तैयारी विशेष रूप से ताल पीढ़ी 6 और neuronal सर्किट 1 के गठन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।
Organotypic स्लाइस की सहज गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए एक रास्ता बहु इलेक्ट्रोड सरणियों (MEAS) के शीर्ष पर संस्कृति उनके लिए है। इन उपकरणों के कई एक साथ कोशिकाओं (बहु इकाई रिकॉर्डिंग) से कार्रवाई की क्षमता के द्वारा उत्पन्न बाह्य क्षमता की निगरानी कर सकते हैं कि कई इलेक्ट्रोड होते हैं। विदेश मंत्रालय रिकॉर्डिंग के उच्च अस्थायी समाधान के लिए एक दिया न्यूरोनल सर्किट के भीतर सटीक गतिविधि गतिशीलता को फिर से संगठित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, के विपरीत पैच-clamping तकनीक न्यूरॉन्स उनके व्यवहार में प्रभावित नहीं कर रहे हैं कि वास्तव में लंबी अवधि के माप और परिणाम परमिट है, जो गैर-आक्रामक है।
एफया इस अध्ययन का उद्देश्य, organotypic रीढ़ की हड्डी सह संस्कृतियों और एकाधिक रिकॉर्डिंग के संयोजन रीढ़ की हड्डी के भीतर कार्यात्मक उत्थान जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। वयस्क उच्च रीढ़ रीढ़ की हड्डी के नुकसान से उबरने के लिए संभावित सीमित है के बाद से, विभिन्न रणनीतियों रीढ़ की हड्डी में चोट के बाद उत्थान को बढ़ावा देने के लिए अध्ययन किया गया है। अब तक, corticospinal पथ आमतौर पर इस तरह की जाँच के लिए पसंद की मॉडल प्रणाली की गई है। इन प्रयोगों आम तौर पर समय लेने वाली है, महंगे हैं और कारण एकल समूहों के भीतर उच्च परिवर्तनशीलता के लिए बड़े जानवर साथियों की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, सबूत propriospinal कनेक्शन (पूरी तरह से रीढ़ की हड्डी के भीतर ही सीमित कर रहे हैं कि न्यूरॉन्स) रीढ़ की हड्डी घावों 8 निम्नलिखित वसूली की प्रक्रिया में एक निर्णायक भूमिका निभा सकते हैं कि पता चलता है। इन तंतुओं आरोही और फाइबर इलाकों उतरते के हस्तक्षेप के बिना विवो में अध्ययन करने के लिए मुश्किल हो जाता है। Bonnici और Kapfhammer 9 अनुदैर्ध्य रीढ़ की हड्डी का इस्तेमाल कियाएक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में प्रसव के बाद चूहों की टुकड़ा संस्कृतियों। यांत्रिक घावों प्रदर्शन करने के बाद वे अर्द्ध मात्रात्मक रीढ़ की हड्डी क्षेत्रों के बीच axons की रूपात्मक उत्थान का विश्लेषण किया। वे एक परिपक्व उम्र में कटौती संस्कृतियों में घाव साइट पार करने में कम नहीं है लेकिन कोई भी एक्सोन मनाया। 7 दिन क्षति के बाद - इसके विपरीत, एक युवा अवस्था में lesioned थे कि संस्कृतियों 5 axonal उत्थान के एक उच्च राशि का प्रदर्शन किया। हालांकि, कार्यात्मक कनेक्शन के लिए प्रमाण प्रस्तुत नहीं किया गया।
इसलिए, कार्यात्मक उत्थान की जांच की अनुमति देता है कि propriospinal फाइबर के इन विट्रो मॉडल में एक प्रतिनिधि के विकास के रीढ़ की हड्डी में पुनर्योजी प्रक्रियाओं के बारे में हमारे ज्ञान का विस्तार करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण हो सकता है।
Protocol
जानवरों की देखभाल स्विस स्थानीय अधिकारियों (राशि फर Landwirtschaft अंड प्रकृति डेस Kantons बर्न, Veterinärdienst, Sekretariat Tierversuche, अनुमोदन एनआरएस। 52/11 और 35/14) द्वारा अनुमोदित दिशा निर्देशों के अनुसार किया गया था। ये दिशा-निर्देश यूरोपीय समुदाय निर्देशक 2010/63 / यूरोपीय संघ के साथ समझौता कर रहे हैं।
नोट: बाँझ उपकरणों और समाधान के साथ एक लामिना का प्रवाह हुड में काम के लिए सभी कदम 1 के लिए - उप-कदम सहित 5।
Meas के 1. तैयारी
नोट: Meas एक कांच के अध, सूक्ष्म गढ़े धातु इलेक्ट्रोड और एक एसयू 8 बहुलक इन्सुलेशन परत से बना रहे हैं। (यह भी Tscherter एट अल 3 देखें)। इस अध्ययन का उद्देश्य के लिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध Meas एक स्वनिर्धारित इलेक्ट्रोड सरणी लेआउट (चित्रा 1 ए और बी) के साथ आदेश दिए थे। 68 इलेक्ट्रोड इलेक्ट्रोड से मुक्त एक 300 माइक्रोन विस्तृत नाली, electr द्वारा दो जोनों में विभाजित किया गया है कि एक आयताकार ग्रिड में व्यवस्थित कर रहे हैंराजनैतिक होता है और इन्सुलेशन। प्रत्येक इलेक्ट्रोड आकार में 40 x 40 माइक्रोन है और वे केंद्र के लिए केंद्र से 200 माइक्रोन से अलग स्थान दिया गया। चार बड़े जमीन इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग स्थल के आसपास तैनात कर रहे हैं। वे अपने आकार (21 मिमी x 21 मिमी) में अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मानक Meas से अलग है और वे कोई निश्चित रिकार्डिंग कक्ष है।
- कम से कम 30 सेकंड प्रत्येक के लिए 100% इथेनॉल (2x), 70% इथेनॉल (1x) और आसुत जल (2x) में कीटाणुशोधन कुल्ला Meas लिए। सूखाएं। एक साफ ग्लास पेट्री डिश (150 मिमी x 25 मिमी) में 12 Meas और ढक्कन बंद - 10 रखो।
- 120 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए आटोक्लेव MEAS। आरटी पर स्टोर।
- -20 डिग्री सेल्सियस पर Meas और दुकान aliquots के लिए कोटिंग समाधान (सामग्री की सूची देखें) तैयार करें।
- एक व्यक्ति बाँझ पेट्री डिश (35 मिमी x 10 मिमी) में प्रत्येक विदेश मंत्रालय रखो।
- इलेक्ट्रोड के शीर्ष पर 150 μl ठंडा कोटिंग समाधान डाल दिया और पेट्री डिश के ढक्कन को बंद करने के लिए एक ठंडा पिपेट का प्रयोग करें। लगभग 10 मिनट के बाद, के शीर्ष पर हवा के बुलबुले के लिए जाँचयदि आवश्यक हो तो इलेक्ट्रोड और धीरे से एक रबर से ढके रंग के साथ उन्हें हटा दें। आरटी पर 1 घंटे के लिए आराम करते हैं।
- महाप्राण कोटिंग समाधान के अवशेष, आसुत, बाँझ पानी के साथ जन्म के पूर्व और भ्रूण न्यूरॉन्स और 2x के लिए अनुकूलित माध्यम के साथ 1x धो लें। Meas अगले दिन तक इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं, तो इनक्यूबेटर हे / एन में 37 डिग्री सेल्सियस पर आसुत, बाँझ पानी में रहते हैं। अन्यथा, आरटी पर सीधे सूखी।
Organotypic संस्कृति की तैयारी और विकास के लिए आवश्यक 2. सामग्री
- कैल्शियम मुक्त धोने समाधान (सामग्री की सूची देखें) तैयार करें।
- लगभग 20 मिनट के लिए 3,000 XG पर,: (बुलबुले के गठन से बचने के लिए, धीरे हिला, 1 1) सेंट्रीफ्यूज और एक बाँझ ट्यूब में स्पष्ट सामग्री छानना धोने के समाधान में चिकन प्लाज्मा Reconstitute। अशेष -20 डिग्री सेल्सियस पर cryotubes और दुकान में 200 μl।
- तदनुसार गोजातीय प्लाज्मा (200 यू / एमएल) और बाँझ फिल्टर (0.2 माइक्रोन ताकना फिल्टर) से थ्रोम्बिन Reconstitute। Cryt में विभाज्य 200 μl-20 डिग्री सेल्सियस पर otubes और दुकान।
- 30 संस्कृतियों के लिए पोषक तत्व माध्यम के 100 मिलीलीटर (सामग्री की सूची देखें) तैयार करते हैं।
3. रीढ़ की हड्डी ऊतक विच्छेदन
के बारे में 25 के लिए भ्रूण, रीढ़ की हड्डी स्लाइस की संख्या पर निर्भर करता है, प्रक्रिया पैदावार - 35 सह संस्कृतियों और बाँझ शर्तों के तहत एक लामिना का प्रवाह हुड के अंदर तैयार किया जाता है: ध्यान दें।
- इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन द्वारा मां जानवर को pentobarbital (0.4 एमएल) की एक घातक खुराक लागू करें। पेडल वापसी पलटा जाँच करके गहरी संज्ञाहरण की पुष्टि करें। कत्ल द्वारा सीजेरियन सेक्शन और बलिदान से E14 चूहा भ्रूण वितरित करें।
- बाँझ, ठंडा, धोने के समाधान के साथ भरा एक पेट्री डिश में भ्रूण के शव स्थानांतरण।
- Hindlimbs ऊपर एक छुरी और आगे के हाथ के ऊपर एक और एक के साथ एक पूरा आड़ा कट प्रदर्शन और शरीर से अंग को हटा दें। इसके बाद, ललाट विमान में कटौती रीढ़ की सह युक्त वापस टुकड़ा से विसरा को अलग करने के लिए बनाआरडी।
- टुकड़ा करने की क्रिया के लिए, एक बढ़ते डिस्क पर एक समय में रीढ़ की हड्डी के एक युक्त वापस टुकड़े हस्तांतरण और 225 की मोटाई में कटौती - एक ऊतक हेलिकॉप्टर के साथ 250 माइक्रोन। कटा हुआ ऊतक पर धोने के समाधान की एक बूंद रखो और 35 मिमी बाँझ, ठंडा, धोने के समाधान के साथ भरा x 10 मिमी पेट्री डिश में एक रंग के साथ स्लाइस हस्तांतरण।
- अलग से एक टुकड़ा के लिए, ऊतक शेष से दूर रीढ़ की हड्डी काटना। संलग्न पृष्ठीय रूट ganglia छोड़ दें।
- स्लाइस 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए आराम करते हैं।
4. Meas पर रीढ़ की हड्डी ऊतक स्लाइस बढ़ते
- इनक्यूबेटर में बाँझ पोषक तत्व मध्यम ऊपर गर्म (37 डिग्री सेल्सियस, हल्के से ऑक्सीजन के लिए ढक्कन unscrewed)।
- ध्यान में इलेक्ट्रोड सरणी के साथ एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत पेट्री डिश में आरटी पर रबर से ढके सुझावों के साथ बाँझ चिमटी के साथ स्थिति विदेश मंत्रालय। स्वच्छ, धूल से मुक्त, और बाँझ इलेक्ट्रोड सरणी पर चिकन प्लाज्मा की एक 6 μl छोटी बूंद केंद्र। ध्यान से स्लाइड, एक छोटा सा रंग का प्रयोगउदर पक्षों प्लाज्मा छोटी बूंद में एक-दूसरे का सामना करना पड़ के साथ दो रीढ़ की हड्डी वर्गों। रंग के साथ इलेक्ट्रोड मत छुओ।
- चिकन प्लाज्मा छोटी बूंद के आसपास थ्रोम्बिन के 8 μl जोड़ें। , थ्रोम्बिन विंदुक टिप का उपयोग सावधानी से मिश्रण और दो स्लाइस के आसपास चिकन प्लाज्मा / थ्रोम्बिन मिश्रण फैला। फिर, सीधे भंगुर इलेक्ट्रोड सरणी नहीं टिकते। बस जमावट से पहले, अतिरिक्त चिकन प्लाज्मा / थ्रोम्बिन महाप्राण।
- विदेश मंत्रालय / संस्कृति विधानसभा 37 डिग्री सेल्सियस पर मशीन के अंदर एक humidified कक्ष में लगभग 1 घंटे के लिए बैठता है, जबकि उच्च आर्द्रता बनाए रखने के लिए पेट्री डिश टोपी।
- ध्यान से पेट्री डिश टोपी और के बारे में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में वापस डाल दिया, संस्कृति कक्ष के लिए पोषक तत्वों के माध्यम के 10 μl जोड़ें।
- एक रोलर ट्यूब में बाँझ, रबर से ढके सुझावों के साथ प्रत्येक विदेश मंत्रालय / संस्कृति विधानसभा की जगह 3 पोषक तत्व माध्यम की मिलीलीटर और कसकर बंद ढक्कन जोड़ें। एक 5% सीओ में इनक्यूबेटर में 2 आरपीएम - 1 पर घूर्णन रोलर ड्रम में रोलर ट्यूब रखें
- प्रति सप्ताह 2 बार - इन विट्रो में 7 दिन (div) और बाद में 1 के बाद पोषक तत्व मध्यम के आधे बदलें।
5. यांत्रिक घावों
- ध्यान में ऊतक के साथ एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत पोषक तत्व माध्यम के बिना एक पेट्री डिश में रोलर ट्यूब और जगह से बाहर बाँझ, रबर से ढके सुझावों के साथ विदेश मंत्रालय / संस्कृति विधानसभा लो। दिखने में दो स्लाइस में जुड़े हुए हैं कि सत्यापित करें।
- विदेश मंत्रालय पर रबर से ढके सुझावों के साथ चिमटी रखकर विधानसभा स्थिर विदेश मंत्रालय / संस्कृति पकड़ो।
- ऊतक स्लाइस के करीब विदेश मंत्रालय की नाली में एक छुरी ब्लेड रखें। बल्कि क्षैतिज छुरी पकड़ो।
- छुरी संभाल लेकिन स्केलपेल ब्लेड आधार से ब्लेड "रोल" टिप और जिससे नाली को कवर ऊतक के माध्यम से कटौती करने के लिए कि इस तरह से विदेश मंत्रालय की नाली में रहने लिफ्ट।
- एक 25 जी सुई की नोक necess यदि साथ गंभीर किसी भी अवशिष्ट ऊतक कनेक्शनआरे। नाली के भीतर क्षेत्र में ही काम करते हैं और निविदा किनारों पर नहीं टिकते।
- रोलर ट्यूब में वापस विदेश मंत्रालय / संस्कृति विधानसभा रखो। संस्कृतियों के लिए नए सिरे से पोषक तत्व माध्यम के 3 मिलीग्राम प्रदान करें और इनक्यूबेटर में रोलर ड्रम में उन्हें वापस जगह है।
सहज गतिविधि का 6. electrophysiological रिकॉर्डिंग
- DIV के चुने संख्या के बाद दो रीढ़ की हड्डी की स्लाइस के बीच कार्यात्मक उत्थान की जांच करने के लिए, एक माइक्रोस्कोप पर एक रिकार्डिंग कक्ष में विदेश मंत्रालय / संस्कृति विधानसभा माउंट और लगभग 500 μl कोशिकी समाधान (सामग्री की सूची देखें) लागू होते हैं।
- प्रणाली को स्थिर करने के लिए अनुमति देने के लिए पहली रिकॉर्डिंग से पहले 10 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
- आरटी पर विदेश मंत्रालय की प्रत्येक गतिविधि का पता लगाने इलेक्ट्रोड से लगभग 10 मिनट के लिए रिकार्ड बुनियादी सहज गतिविधि 2x।
- स्थिर, बाह्य स्थिति सुनिश्चित हर रिकॉर्डिंग सत्र के बाद कोशिकी समाधान का आदान-प्रदान करने के लिए।
- नेटवर्क disinhibit करने के लिए, बाह्य समाधान सह लागूबच्छनाग (1 माइक्रोन) और gabazine (10 माइक्रोन) ntaining। रिकॉर्डिंग शुरू करने से पहले कम से कम 2 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें।
7. डेटा विश्लेषण
नोट: extracellularly दर्ज कार्रवाई की क्षमता का पता लगाने के लिए प्रत्येक इलेक्ट्रोड मानक विचलन और बाद में एक discriminator के आधार पर एक डिटेक्टर के लिए इस्तेमाल करते हैं। यह प्रक्रिया Tscherter एट अल। 3 में विस्तार से वर्णन किया गया है।
- मानक प्रक्रियाओं 3 (चित्रा 1F) के अनुसार एक रेखापुंज साजिश में प्रत्येक इलेक्ट्रोड का पता लगाया neuronal गतिविधि प्रदर्शित करें।
- निर्धारित और 1 मिसे कदम से स्थानांतरित कर दिया 10 मिसे के एक स्लाइडिंग खिड़की के भीतर अनुसार चैनलों में घटनाओं की संख्या को संक्षेप द्वारा प्रत्येक टुकड़ा के लिए कुल नेटवर्क गतिविधि प्रदर्शित (चित्रा 1G और Tscherter एट अल। 3 देखें)।
- प्रत्येक टुकड़ा व्यक्तिगत फटने (कई इलेक्ट्रोड पर आने वाले गतिविधि के समूहों) का पता लगाने में। इसलियेइसी कुल नेटवर्क गतिविधि में एक न्यूनतम शिखर गतिविधि सीमा निर्धारित करने और प्रत्येक फट शुरुआत और फट अंत परिभाषित। उदाहरण के लिए, एक उचित सीमा औसत फट आयाम का 25% है और एक फट शुरू में की एक समय खिड़की में पिछले घटना होने से कम से कम 5 मिसे, एक फट अंत के समय खिड़की में पहली घटना होने से परिभाषित किया जा सकता कम से कम 25 मिसे (हीडेमैन एट अल। 10 देखें)।
- कार्यात्मक उत्थान दो स्लाइस के बीच सिंक्रनाइज़ फटने के प्रतिशत की गणना करने के लिए यों। ऐसा करने के लिए, एक टुकड़ा में एक पटाखे और अन्य टुकड़ा में निम्नलिखित फट के बीच विलंबता की गणना।
नोट: विलंबता औसत फट लंबाई की तुलना में छोटा होता है जब एक फट जोड़ी करार दिया "सिंक्रनाइज़" है। विशेष रूप से गतिविधि का एक बहुत साथ सह संस्कृतियों में, संभावना दोनों पक्षों संयोग चुना विलंबता खिड़की में एक फट आरंभ है कि मौजूद है। इस तथ्य को एसवाई का प्रतिशत की मात्रा का ठहराव में ध्यान में रखा जाना हैnchronized फटने। गणना की एक विस्तृत वर्णन के लिए हीडेमैन एट अल देखते हैं। 10।
संस्कृति और immunohistochemistry 8. फिक्सेशन
- कपड़े धोने या ऊष्मायन शामिल है कि सभी चरणों के लिए ऊतक के माध्यम से समाधान का उचित प्रसार सुनिश्चित करने के लिए एक झुकाव मेज पर संस्कृतियों डाल करने के लिए सुनिश्चित करें।
- रिकॉर्डिंग सत्र सेटअप से बाहर विदेश मंत्रालय / संस्कृति विधानसभा लेने के लिए समाप्त हो गया है के बाद सीधे, एक पेट्री डिश (35 मिमी x 10 मिमी) में डाल दिया और के बारे में 2 मिलीलीटर कोशिकी समाधान की जोड़ें।
- इन विट्रो में समय के दौरान का गठन किया है कि आसपास के सेल परतों से स्लाइस को अलग करने के लिए, एक 10 μl विंदुक टिप लेने के लिए और स्लाइस चक्र। संस्कृतियों को नुकसान नहीं ध्यान दे। यह इस कदम न आना, लेकिन यह किया जाता है जब बाद में एम्बेड करने के लिए आसान है करना संभव है।
- एक पतली nonmetallic सिरिंज सुई का प्रयोग बाह्य soluti से भरा एक 1 मिलीलीटर सिरिंज के साथ संयोजन में (सामग्री की सूची देखें)पर धीरे विदेश मंत्रालय बंद संस्कृति को उड़ाने के लिए।
- एक पाश्चर विंदुक की नोक निकालें और कटे अंत पर रबर बल्ब फिट बैठते हैं। (फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस, 0.1 एम) के साथ 4% paraformaldehyde) लगानेवाला में संस्कृति हस्तांतरण करने के लिए पीछे के अंत का प्रयोग करें। यह बहुत छोटा है और संस्कृतियों तह किया जाएगा और शायद क्षतिग्रस्त क्योंकि हस्तांतरण के लिए पाश्चर विंदुक के मानक टिप का प्रयोग न करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटा - 1 के लिए ठीक करें। आसुत जल के साथ विदेश मंत्रालय कुल्ला और उंगलियों के साथ ऊतक अवशेषों को हटाने लेकिन कील के साथ खरोंच नहीं है। 4 डिग्री सेल्सियस पर आसुत जल में स्टोर Meas
- कम से कम 10 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस में संस्कृतियों 3x धो लें। 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में दुकान या सीधे धुंधला प्रक्रिया के साथ शुरू करते हैं।
- समाधान (5% बकरी सीरम, 1% गोजातीय सीरम albumin, पीबीएस में 0.3% डिटर्जेंट) को रोकने में कम से कम 90 मिनट के लिए संस्कृतियों सेते हैं।
- अवरुद्ध समाधान में पतला पहली एंटीबॉडी जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 रातों के लिए सेते हैं।
- एल में लिए पीबीएस में धो 3xपूर्व 30 मिनट प्रत्येक।
- आरटी पर 2 घंटे के लिए पीबीएस में पतला दूसरी एंटीबॉडी जोड़ें।
- कम से कम 30 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस में धो 3x।
- एक वस्तु स्लाइड पर हटाया टिप के साथ एक पाश्चर विंदुक के साथ स्लाइस स्थानांतरण। अतिरिक्त पीबीएस निकालें और मध्यम बढ़ते के साथ एम्बेड।
Representative Results
E14 चूहा भ्रूण की रीढ़ की हड्डी से निकाली गई सह संस्कृतियों के कार्यात्मक वसूली के लिए क्षमता की जाँच करने के लिए, घावों 28 div करने के लिए 8 के एक समय खिड़की में प्रदर्शन किया गया। 2 से 3 हफ्ते बाद, सहज neuronal गतिविधि Meas (चित्रा 1 सी और डी) के साथ दर्ज किया गया था। extracellularly दर्ज कार्रवाई क्षमता प्रत्येक व्यक्ति इलेक्ट्रोड (चित्रा 1E) के लिए ऑफ़लाइन पहचान की गई। नेटवर्क गतिविधि भूखंडों के द्वारा पीछा रास्टर भूखंडों उत्पन्न किया गया इन आंकड़ों (चित्रा 1F), से साइड (चित्रा 1G) के अनुसार अलग से कुल गतिविधि कल्पना करने के लिए। प्रत्येक टुकड़ा में सहज गतिविधि आमतौर पर धारा में आयोजित किया जाता है। स्लाइस कार्यात्मक रूप से जुड़े हुए हैं, तो इन फटने से एक टुकड़ा से दूसरे के लिए प्रचार कर सकते हैं। इसलिए, दो स्लाइस के बीच सिंक्रनाइज़ फटने की राशि मात्रात्मक कार्यात्मक उत्थान को मापने के लिए गणना की गई। कैसे परिवर्तन पूर्णांक के एक विस्तृत वर्णन के लिएअलग भूखंडों ओ प्रदर्शन किया और सिंक्रनाइज़ गतिविधि के प्रतिशत की गणना के लिए सूत्र निकाली थी कैसे, हीडेमैन एट अल। 10 देखने के लिए कृपया है।
सभी प्रयोगों में, गतिविधि पहली मानक शर्तों के तहत दर्ज किया गया था। एक दूसरे चरण में, अन्तर्ग्रथनी निषेध बाह्य स्नान समाधान करने के लिए बच्छनाग (1 माइक्रोन) और gabazine (10 माइक्रोन) जोड़कर अवरुद्ध किया गया था। इस disinhibition फटने की परिभाषा और इस तरह स्लाइस के बीच फट तुल्यकालन के निर्धारण सुविधा है, जो लंबे समय तक फटने और फट अंतराल के साथ एक अधिक नियमित गतिविधि पैटर्न, आम तौर पर ले जाता है।
कम उम्र में lesioned संस्कृति - संस्कृतियों बाद के चरणों (> 19 div) (चित्रा 2 एक पुनर्जीवित करने की क्षमता में एक विशिष्ट कमी देखी गई पर lesioned जबकि (7 9 div) 2-3 सप्ताह घाव के बाद सिंक्रनाइज़ गतिविधि के एक उच्च राशि प्रदर्शित - एफ)। इन निष्कर्षों से पता चलता उत्थान की क्षमता है किरीढ़ की हड्डी टुकड़ा संस्कृतियों में कार्यात्मक कनेक्शन की संस्कृति में तीन सप्ताह के भीतर विवो में आगे विकसित राज्य का प्रतिनिधित्व करने के लिए एक कम स्तर पर, विवो में भ्रूण राज्य का प्रतिनिधित्व करने के लिए एक उच्च स्तर से कम हो जाती है।
कनेक्शन की तरह क्या वास्तव में दो स्लाइस के बीच फट तुल्यकालन में शामिल कर रहे हैं? Propriospinal कनेक्शन इसके अलावा, फाइबर भी motoneurons या पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स से पैदा हो सकता है। यह रीढ़ की हड्डी 10 स्लाइस के बीच पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स कार्यात्मक कनेक्टिविटी के लिए प्रासंगिक नहीं हैं कि पहले से दिखाया गया है। हालांकि, motoneurons की भागीदारी के लिए एक संभावना बनी हुई है। Motoneurons निकोटिनिक रिसेप्टर्स 13 के माध्यम से रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन्स के लिए कोलीनर्जिक संबंध के रूप में जाना जाता है के बाद से, रीढ़ की हड्डी सह संस्कृतियों की गतिविधि 8 div, संस्कृतियों अत्यधिक गतिविधि 10 सिंक्रनाइज़ दिखाने के लिए जब एक समय, और निकोटिनिक प्रतिपक्षी Mecam पर दर्ज किया गया थाylamine (एमईसी, 100 माइक्रोन) के बाह्य स्नान समाधान के लिए जोड़ा गया था। दो स्लाइस के बीच के संबंध में motoneurons की भागीदारी सिंक्रनाइज़ गतिविधि की एक कम प्रतिशत में नतीजा होगा। हालांकि, इस मामले में ऐसा नहीं था (एमईसी: 91.0 ± 4.5% एन = 7; नियंत्रण: 93.6 ± 4.6%, एन = 7, p> 0.05, Wilcoxon मिलान जोड़े परीक्षण)। इन परिणामों के कोलीनर्जिक synapses के स्लाइस के बीच कार्यात्मक संबंध में योगदान नहीं है कि सुझाव। Motoneurons भी सीएनएस 11, 15 के भीतर synapses पर ग्लूटामेट जारी करने के लिए दिखाया गया है लेकिन, जब से इन प्रयोगों के लिए पूरी तरह से उनकी भागीदारी बाहर नहीं करते।
SMI -32 प्रदर्शन किया गया साथ motoneurons गैर फॉस्फोरिलेटेड neurofilament एच के खिलाफ प्रतिरक्षाऊतकरसायन stainings की पहचान करने के लिए। वे स्लाइस (चित्रा 3) पर वितरित motoneurons के लिए विशिष्ट कई लेबल बड़े सेल निकायों, का पता चला। SMI-32 एंटीबॉडी motoneuro की सेल निकायों लेबल करने के लिए सूचित किया गया हैएनएस 12 और यह निष्कर्ष भी इस्तेमाल किया संस्कृतियों 13 के लिए सच है। इसके अलावा, बी तृतीय ट्यूबिलिन या NeuN के साथ-साथ glial सेल निकायों, उदा। खिलाफ सामान्य, उदा में neuronal सेल निकायों के stainings, GFAP एंटीबॉडी के साथ astrocytes अन्य रिपोर्ट के साथ लाइन में हैं और (इन प्रकार की कोशिकाओं के रूपात्मक विवरणों से मेल खाते चित्रा 3 बी - डी)। फिर भी, SMI-32 एंटीबॉडी के साथ एक्सोन की लेबलिंग (3E चित्रा) के विषय में है। उम्मीदों के खिलाफ, इस एंटीबॉडी का उपयोग करते समय फाइबर का एक विशाल नेटवर्क प्रकट होता है और यह फॉस्फोरिलेटेड neurofilament एच (चित्रा 3F) लेबल कि SMI-31 धुंधला करने के समान दिखता है। इस परिणाम की एक व्याख्या neurofilament फास्फोरिलीकरण / dephosphorylation के विकास विनियमन इन विवो स्थिति की तुलना में इस्तेमाल किया संस्कृतियों में के रूप में तंग नहीं है कि हो सकता है। एक ही अक्षतंतु में फॉस्फोरिलेटेड और गैर फॉस्फोरिलेटेड neurofilaments के एक मिश्रित घटना expl सकाइस खोज ऐन। एक और संभावना SMI-32 लेबल एक्सोन प्रक्षेपण न्यूरॉन्स से उत्पन्न होती है। त्सांग और उनके सहयोगियों ने 16 कि जैसे पता चला है, क्लार्क के स्तंभ और इन्तेर्मेदिओलतेरल सेल स्तंभ न्यूरॉन्स motoneurons के अलावा SMI-32 से दाग रहे हैं। इस तरह के न्यूरॉन्स के उच्चारण किए neurite प्रसार भी SMI -32 सकारात्मक फाइबर की प्रचुरता समझा सकता है।
चित्रा 1. प्रदर्शन और सहज गतिविधि का विश्लेषण। (ए) एक विदेश मंत्रालय का आरेख। प्लैटिनम कवर इलेक्ट्रोड काला, लाल रंग में पारदर्शी तारों और पीले रंग में विदेश मंत्रालय के बीच में नाली में चित्रित कर रहे हैं। (बी) के विदेश मंत्रालय के केंद्र में स्थित इलेक्ट्रोड सरणी के बंद हुआ। आरेख कृपया डा एम Heuschkel द्वारा प्रदान की जाती हैं। (सी) एक 8 DIV पुरानी संस्कृतियों के उज्ज्वल क्षेत्र छविई। स्लाइस हो गई है और एक दूसरे का सामना पक्षों के साथ जुड़े हुए हैं। पीली पट्टी विदेश मंत्रालय की electrode- और इन्सुलेशन मुक्त नाली का प्रतिनिधित्व करता है। प्रयोगों के स्केल बार = 400 माइक्रोन (डी) इस समय। E14 चूहा भ्रूण के दो रीढ़ की हड्डी की स्लाइस Meas पर एक दूसरे के बगल में रखा जाता है। कुछ ही दिनों के भीतर, स्लाइस बढ़ने और फ्यूज एक दूसरे का सामना पक्षों के साथ। 8 के एक समय सीमा में - 28 div, पूरा घावों संलयन साइट के माध्यम से प्रदर्शन कर रहे हैं। दो से तीन सप्ताह बाद में सहज गतिविधि दर्ज की गई है और संस्कृतियों प्रतिरक्षाऊतकरसायन stainings के लिए तय कर रहे हैं। (ई) एक 23 DIV पुरानी संस्कृति के प्रत्येक व्यक्ति इलेक्ट्रोड की सहज गतिविधि के निशान। स्पष्ट दृश्य के लिए, केवल हर दूसरे ट्रेस सचित्र है। ऑरेंज निशान बाईं ओर से दाईं ओर पर टुकड़ा से दर्ज किया गया है कि गतिविधि, नीले निशान को दर्शाती है। फटने से अधिकांश दोनों के बीच सिंक्रनाइज़ कर रहे हैं। छोड़ दिया टुकड़ा है कि केवल पी में होने वाली एक फट करने के लिए तीर अंकartially सही टुकड़ा करने के लिए प्रचार किया। सही टुकड़ा में गतिविधि हालांकि अनुसार पक्ष का औसतन अधिकतम चोटी गतिविधि के कम से कम 25% के चुने हुए सीमा तक पहुँच नहीं था और इसलिए, एक पटाखे के रूप में पहचान नहीं है। सही पर आवर्धन पिछले सिंक्रनाइज़ फट जोड़ी को दर्शाती है। (ई) में दिखाया गया गतिविधि (एफ) रेखापुंज साजिश है। (ई) में दिखाया गया गतिविधि के परिभाषित फटने (आधारभूत नीचे सलाखों) के साथ (जी) नेटवर्क गतिविधि साजिश है। हीडेमैन एट अल। 10 से अनुकूलित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. नहीं सिंक्रनाइज़ गतिविधि बनाम सिंक्रनाइज़। (ए, बी) संस्कृतियों का रास्टर भूखंडों lesioneकम उम्र में डी (7 - 9 div), मानक स्थितियों (ए) और disinhibition के तहत (बी) के तहत सिंक्रनाइज़ गतिविधि दिखा। (सी, डी) मानक की स्थिति (सी) और disinhibition के तहत (डी) के तहत नहीं सिंक्रनाइज़ गतिविधि दिखा (> 19 DIV पर) एक पुराने उम्र में lesioned संस्कृतियों का रास्टर भूखंडों। सिंक्रनाइज़ गतिविधि (ई, एफ) औसत प्रतिशत मानक स्थितियों (ई) और disinhibition के तहत (एफ) के तहत दर्ज की गई प्रत्येक व्यक्ति के घाव दिन के लिए साजिश रची। 3 सप्ताह के घाव के दिन के बाद - रिकॉर्डिंग 2 ले जाया गया। हीडेमैन एट अल। 10 से अनुकूलित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
एफigure 3. इम्युनोहिस्टोकैमिकल विशेषता। SMI-32 के साथ motoneuronal सेल शरीर के (ए) धुंधला हो जाना। (बी) परिपक्व neuronal सेल निकायों और उनकी प्रक्रियाओं की β-III ट्यूबिलिन लेबलिंग। GFAP साथ astrocytes की (सी) पहचान। NeuN के साथ परिपक्व न्यूरोनल सेल शरीर (डी) लेबलिंग। SMI-31 द्वारा की पहचान गैर फॉस्फोरिलेटेड neurofilament एच (एफ) फॉस्फोरिलेटेड neurofilament एच (ई) SMI-32 धुंधला हो जाना। हीडेमैन एट अल। 10 से अनुकूलित। दोनों के साथ ध्यान दें कि, SMI-31 और SMI-32, फाइबर का एक बड़ा नेटवर्क संस्कृतियों में दिखाई दे रहा है। बार्स ई = 20 माइक्रोन, एच एंड एफ = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
प्रस्तुत की प्रक्रिया में कई तत्वों सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रयोगों की सिद्धि के लिए मौलिक हैं। Meas, समाधान की तैयारी और टुकड़ा संस्कृतियों के उत्पादन के दौरान सभी कदम एक लामिना का प्रवाह हुड में बाँझ शर्तों के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं। वे सहज गतिविधि 14 प्रभावित कर सकते हैं, क्योंकि एंटीबायोटिक्स पोषक तत्व मध्यम करने के लिए लागू नहीं कर रहे हैं। विदेश मंत्रालय कोटिंग के दौरान सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा बाह्य मैट्रिक्स जेल समाधान के लिए हर समय ठंड रहती है कि यह सुनिश्चित करना है। फ्रिज में और पूरी प्रक्रिया के लिए बर्फ पर रख यह पिघलना 0 डिग्री सेल्सियस के करीब एक अधिकतम तापमान सुनिश्चित करने के लिए। बर्फ के ठंडे विच्छेदन बफ़र्स का उपयोग करके एक कम तापमान स्लाइस त्वरित अलगाव और सेक्शनिंग की तैयारी, साथ ही ध्यान दे के दौरान स्वस्थ संस्कृतियों का प्रतिशत बढ़ जाती है। इसके अलावा, प्लाज्मा / थ्रोम्बिन जमावट सबसे महत्वपूर्ण कदमों में से एक है। सबसे पहले, प्लाज्मा ठीक से Mixe है कि यह सुनिश्चित कर लेंथ्रोम्बिन के साथ घ। दूसरा, MEAS को स्लाइस की उचित लगाव सुनिश्चित करने के लिए जितना संभव हो उतना अवशेषों को हटाने के लिए विशेष ध्यान देते हैं। यह कदम अत्यंत समय के प्रति संवेदनशील है; समय सीमा के बहुत छोटा है, तो प्लाज्मा / थ्रोम्बिन मिश्रण का बहुत अधिक निकाल दिया जाता है। समय सीमा के बहुत लंबा है, तो जमावट पहले से ही अवशिष्ट प्लाज्मा / थ्रोम्बिन के साथ स्लाइस को हटाने का खतरा बढ़ रही है, क्या हुआ।
यांत्रिक घावों की योजना बनाई है, तो यह एक सटीक डिजाइन के साथ Meas का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। घाव का इरादा है, जहां क्षेत्र इलेक्ट्रोड, तारों और इन्सुलेशन के मुक्त होने की जरूरत है। अन्यथा, विदेश मंत्रालय के electrics क्षतिग्रस्त हो और इसलिए, कोई रिकॉर्डिंग अब और किया जा सकता है जा रहे हैं।
एक और महत्वपूर्ण कदम घाव के आकार का सवाल है। यह घाव के बाद दो जवान स्लाइस reconnecting के बारे में दो दिनों में 10 लेता है कि पहले से दिखाया गया है। सभी प्रयोगों के लिए, अंगूठे का नियम अंतरिक्ष betwe कि इस्तेमाल किया गया थाघाव के बाद स्लाइस एन विदेश मंत्रालय नाली (300 माइक्रोन) की चौड़ाई से बड़ा नहीं होना चाहिए। घाव कोई कनेक्शन है, सब पर बहुत बड़ा है, तो एक बड़ा घाव आकार, कनेक्शन के लिए एक लंबे समय के फ्रेम में परिणाम या हो सकता है। टिप्पणी करने के लिए, पूर्व प्रयोगों से पता चला है कि एक बहुत कम कनेक्शन की दर में एक प्रारंभिक दो स्लाइस के रखने के आगे दूर से 1 मिमी का परिणाम है।
बजाय इनक्यूबेटर से 37 डिग्री सेल्सियस की रिकॉर्डिंग, आरटी के लिए कम से कम 10 मिनट की एक समायोजन समय की शुरुआत से पहले, और बाह्य समाधान करने के लिए, बजाय पोषण माध्यम की सिफारिश की है। इन प्रारंभिक मिनट के दौरान गतिविधि के पैटर्न के करीब अवलोकन मापा डेटा रिकॉर्डिंग शुरू किया गया था उचित रूप से करने के बाद संस्कृति की फोड़ पैटर्न का प्रतिनिधित्व करता है।
गतिविधि, डाटा अधिग्रहण और आगे की प्रक्रिया का पता लगाने के लिए, घर का बना हार्डवेयर, लैब में प्रोग्राम (, एम्पलीफायरों और एम्पलीफायरों के लिए कनेक्शन रिकॉर्डिंग कक्ष)देखें, सी ++ और IgorPro इस्तेमाल कर रहे हैं। वाणिज्यिक विदेश मंत्रालय setups और अन्य सॉफ्टवेयर संकुल इन कार्यों के लिए के रूप में अच्छी तरह से उपयुक्त हैं। इधर, इलेक्ट्रोड के द्वारा देखा संकेतों 1001 बार परिलक्षित, और फिर 6 किलोहर्ट्ज़ की दर से डिजीटल हैं।
विवो में, वे आरोही और फाइबर इलाकों उतरते के हस्तक्षेप के बिना अध्ययन करने के लिए मुश्किल हो जाता है क्योंकि प्रस्तुत मॉडल propriospinal कनेक्शन की जांच के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकता है। दो रीढ़ की हड्डी की स्लाइस की सह संवर्धन सुंदर ढंग से इस मुद्दे को दरकिनार कर सकते हैं। संस्कृतियों कसकर नियंत्रित और आसानी से छेड़छाड़ की जा सकती है कि एक microenvironment प्रदान करते हैं। दूसरी ओर, supraspinal और संवेदी इनपुट लापता पाठ्यक्रम की है। इसके अतिरिक्त, संस्कृति तैयार करने की प्रक्रिया सीएनएस नुकसान की स्थिति का प्रतिनिधित्व करता है। Astrocytes और microglia तरह glial कोशिकाओं इसलिए बढ़ प्रसार और साथ घावों पर प्रतिक्रिया के लिए जाना जाता है, ऊतक पुनर्गठित एक निश्चित सीमा तक है। प्रस्तुत मोड से संबंधितयांत्रिक घावों के प्रदर्शन के बाद एल एक glial निशान के गठन नहीं मनाया गया। एक स्पष्टीकरण astrocytes की अनुकूली तंत्र पहले से ही तैयार करने की प्रक्रिया के दौरान शुरू हो गया है कि और संस्कृतियों के घावों एक और जवाब में परिणाम नहीं था कि हो सकता है। इसके अलावा, माइलिन जुड़े अवरोधकों की भागीदारी है, उदाहरण के लिए कोई सबूत नहीं है।, No गो-ए, एक पुराने उम्र में lesioned संस्कृतियों का कम उत्थान क्षमता में। हालांकि, यह Rolipram, स्लाइस के बीच 10 से 23 DIV बढ़ जाती है कार्यात्मक उत्थान पर घावों के प्रदर्शन के बाद सीधे प्रारंभिक फॉस्फोडाइस्टरेज़ 4 अवरोध करनेवाला के साथ इलाज है कि दिखाया गया था। इन परिणामों के कार्यात्मक वसूली पुरानी संस्कृतियों में बढ़ाया जा सकता है कि प्रदर्शित करता है। घाव साइट को पार एक्सोन की संख्या की गणना करते समय काफ़ी है, एक कम उम्र में lesioned संस्कृतियों और एक पुराने उम्र में lesioned संस्कृतियों के बीच कोई अंतर नहीं है की खोज की थी। इन निष्कर्षों axonal उत्थान की कमी प्रमुख कारण च नहीं है का सुझावया इसलिए संस्कृति में देर घावों के बाद वसूली की हानि और उत्थान का कार्य विश्लेषण की अनुमति देता है कि एक मॉडल की जरूरत पर जोर। Synaptic के गठन और synaptic plasticity वसूली की प्रक्रिया 10 में एक प्रमुख भूमिका निभा सकता है। ये तंत्र हाल के वर्षों के दौरान ध्यान की एक बहुत फायदा हुआ है और यह आजकल व्यापक रूप से वे रीढ़ की हड्डी में चोट के बाद परिणाम पर एक बड़ा असर होता है कि स्वीकार कर लिया जाता है। इसलिए, अलगाव में और महान विस्तार में इन प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए स्थिर स्थिति प्रदान करता है कि एक मॉडल निश्चित रूप से रीढ़ की हड्डी में कार्यात्मक उत्थान के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए कर सकते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Planar multielectrode array | Qwane Biosciences | custom-made according to the design of our lab | |
| Nutrient medium | For 100 ml | ||
| Dulbeccos modified Eagle's medium | Gibco | 31966-021 | 80 ml |
| Horse serum | Gibco | 26050-070 | 10 ml |
| distilled, sterile water | 10 ml | ||
| Nerve growth factor-7S [5 ng/ml] | Sigma-Aldrich | N0513 | 200 µl |
| reconstituted in wash solution with 1% BSA | |||
| Coating solution | |||
| Extracellular matrix gel | BD Biosciences | 356230 | Must stay cold at all times; dilute 1:50 with medium optimized for prenatal and embryonic neurons |
| medium optimized for prenatal and embryonic neurons | Gibco | 21103-049 | |
| Wash solution | [mg/L] | ||
| MgCl2-6H2O | 100 | ||
| MgSO4-7H2O | 100 | ||
| KCl | 400 | ||
| KH2PO4 | 60 | ||
| NaCl | 8,000 | ||
| Na2HPO4 anhydrous | 48 | ||
| D-Glucose (Dextrose) | 1,000 | ||
| According to the protocol on http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html | |||
| Extracellular solution (pH 7.4) | [mM] | ||
| NaCl | 145 | ||
| KCl | 4 | ||
| MgCl2 | 1 | ||
| CaCl2 | 2 | ||
| HEPES | 5 | ||
| Na-pyruvate | 2 | ||
| Glucose | 5 | ||
| Blocking Solution | |||
| Detergent: Triton X-100 | 0.3%, harmful if swallowed | ||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | 1% |
| Goat serum | Gibco | 16210-064 | 5% |
| Chicken Plasma | Sigma-Aldrich | P2366 | Lyophilized, reconstitute with wash solution |
| Gabazine | Sigma-Aldrich | SR-95531 | |
| Mecamylamine hydrochloride | Tocris | 2843 | toxic if swallowed |
| Micropipette | World Precision Instruments, Inc. | MF28G-5 | |
| Paraformaldehyde | harmful, 4% | ||
| SMI-31 | Covance | SMI-31P | |
| SMI-32 | Covance | SMI-32R-500 | |
| Strychnine | Sigma-Aldrich | S0532 | toxic |
| Thrombin | Merck Millipore | 1123740001 | irritant, sensitizing, reconstitute with wash solution |
| Tissue culture flat tube 10 (= roller tube) | Techno Plastic Products AG | 91243 | |
References
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