Summary
هنا نقدم البروتوكول الذي يقوم على شرائح النخاع الشوكي مثقف على صفائف متعدد القطب لدراسة تجديد الوظيفي للاتصالات نخاعي مخصوص في المختبر.
Introduction
وقد استخدمت الثقافات شريحة عضوي النمط من الجهاز العصبي المركزي (CNS) على نطاق واسع لدراسة مختلف الظواهر الفسيولوجية والمرضية تمتد من تطوير الخلايا العصبية في التنكس العصبي. مقارنة مع ثقافات الخلية فصلها، وشرائح عضوي النمط توفر ميزة المزيد من التعقيد مع التهندس الخلوي سليمة والدوائر متشابك المحلية. وفي الوقت نفسه، يمكن تحليل الأنسجة بطريقة معزولة دون الحاجة إلى توريط تعقيد كله في سياق الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، هناك ما يبرر الوصول السهل والمتكررة لخلايا الاختيار، يمكن التحكم في البيئة خارج الخلية بدقة وعادة، في المختبر النماذج أقل تكلفة من نظرائهم في الجسم الحي. في السنوات الأخيرة، والدراسات المختلفة المعروضة أوجه الشبه بين ملامح التنموية الثقافات طويلة الأجل مقابل الحيوانات المقابلة يعيشون 1،2. وقد تبين أن الدوائر العصبية من مختلف CNS رجونانوثانية تعبر عن نشاط الشبكة عفوية خلال التنمية، وأن شرائح عضوي النمط حفاظ جزئيا هذه الظاهرة 3 -7. وقد استخدمت معزولة الاستعدادات الحبل الشوكي وخاصة للتحقيق في الجيل إيقاع 6 وتشكيل الدوائر العصبية 1.
وهناك طريقة لتسجيل النشاط العفوي من شرائح عضوي النمط هو ثقافة لهم على رأس صفائف متعدد القطب الأطراف. هذه الأجهزة تحتوي على أقطاب متعددة والتي يمكن رصد إمكانات خارج الخلية الناتجة عن إمكانات العمل من العديد من الخلايا في وقت واحد (تسجيل متعددة الوحدات). القرار زمنية عالية من التسجيلات MEA يمكن استخدامها لإعادة بناء ديناميكية النشاط دقيقة داخل الدوائر العصبية معين. بالإضافة إلى ذلك، وعلى النقيض من التصحيح، تحامل على تقنية هو غير الغازية، والذي يسمح القياسات طويلة الأجل والنتائج في حقيقة أن الخلايا العصبية لا تتأثر في سلوكهم.
Fأو الغرض من هذه الدراسة، تم استخدام مزيج من عضوي النمط الحبل الشوكي المشترك الثقافات والتسجيلات متعددة المواقع للتحقيق تجديد وظيفية داخل الحبل الشوكي. منذ الكبار الفقاريات العليا والقدرة على التعافي من الضرر من الحبل الشوكي محدودة، وقد درس استراتيجيات مختلفة لتشجيع تجديد بعد إصابة الحبل الشوكي. حتى الآن، وقد الجهاز القشري عادة في النظام النموذجي لاختيار لمثل هذه التحقيقات. هذه التجارب عادة ما تكون مضيعة للوقت ومكلفة وتتطلب الأفواج الحيوانات الكبيرة بسبب التباين الشديد ضمن مجموعات واحدة. وعلاوة على ذلك، تشير الدلائل إلى أن الاتصالات نخاعي مخصوص (الخلايا العصبية التي تقتصر تماما داخل الحبل الشوكي) يمكن أن تلعب دورا محوريا في عملية الانتعاش في أعقاب آفات الحبل الشوكي 8. هذه الألياف هي صعبة للدراسة في الجسم الحي دون تدخل تصاعدي وتنازلي مساحات الألياف. بونيسي وKapfhammer 9 يستخدم الحبل الشوكي الطوليالثقافات شريحة من الفئران بعد الولادة كنهج بديل. بعد أداء الآفات الميكانيكية حللوا شبه كمي لتجديد الصرفي من المحاور بين شرائح النخاع الشوكي. لاحظوا أقل ولكن ليس المحاور أيا عبور موقع الآفة في الثقافات قطع في سن ناضجة. في المقابل، الثقافات التي تم lesioned في مرحلة الشابة عرضها على كمية عالية من تجدد المحاور 5 - 7 أيام بعد الضرر. ومع ذلك، لم يعرض دليل للاتصالات وظيفية.
ولذلك، فإن وضع ممثل في نموذج المختبر من الألياف نخاعي مخصوص التي تسمح التحقيق في تجديد وظيفية يمكن أن يكون أداة قيمة لتوسيع معرفتنا حول عمليات التجدد في النخاع الشوكي.
Protocol
وكانت رعاية الحيوان وفقا للمبادئ التوجيهية التي وافقت عليها السلطات المحلية سويسري (آمت FÜR Landwirtschaft اوند الناطور دي Kantons برن، Veterinärdienst، Sekretariat Tierversuche، شمال ولاية أراكان موافقة عليها. 52/11 و35/14). هذه المبادئ التوجيهية هي بالاتفاق مع توجيه الجماعة الأوروبية 2010/63 / الاتحاد الأوروبي.
ملاحظة: العمل في غطاء تدفق الصفحي مع الأدوات والحلول العقيمة لجميع الخطوات 1-5 بما في ذلك الخطوات الفرعية.
1. إعداد الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف
ملاحظة: وتتكون من الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف الركيزة الزجاج، والأقطاب المعدنية ملفقة الصغيرة وSU-8 الطبقة العازلة البوليمر (انظر أيضا Tscherter آخرون 3). لغرض هذه الدراسة، وطلب من الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف المتاحة تجاريا مع تخصيص مجموعة الكهربائي تخطيط (الشكل 1 A & B). يتم ترتيب أقطاب 68 في شبكة مستطيلة التي تنقسم إلى منطقتين من أخدود واسعة 300 ميكرون خال من الأقطاب الكهربائية والكهرباءيؤدي كال والعزل. كل قطب هو 40 × 40 ميكرون في الحجم وأنها متباعدة وبصرف النظر بنسبة 200 ميكرون من مركز لآخر. يتم وضع أربعة أقطاب برية واسعة في جميع أنحاء الموقع تسجيل. وهي تختلف عن غيرها من الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف القياسية المتوفرة تجاريا في حجمها (21 ملم × 21 ملم) وليس لديهم غرفة تسجيل ثابتة.
- الاتفاقات البيئية متعددة الأطراف شطف التطهير في الإيثانول بنسبة 100٪ (2X)، و 70٪ من الإيثانول (1X) والماء المقطر (2X) لا يقل عن 30 ثانية لكل منهما. اسمحوا الجافة. وضع 10-12 الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف في طبق بتري تنظيف الزجاج (150 ملم × 25 ملم) وإغلاق الغطاء.
- الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف الأوتوكلاف لمدة 20 دقيقة في 120 درجة مئوية. تخزين في RT.
- تحضير محلول طلاء (انظر قائمة المواد) عن الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف وتخزين aliquots في -20 ° C.
- وضع كل MEA في طبق بتري معقمة الفردية (35 ملم × 10 ملم).
- استخدام ماصة تبريد لوضع 150 حل طلاء المبردة ميكرولتر على الجزء العلوي من الأقطاب الكهربائية وإغلاق غطاء طبق بتري. بعد حوالي 10 دقيقة، تحقق من وجود فقاعات الهواء على قمةالأقطاب وبلطف إزالتها مع ملعقة المغطاة بالمطاط إذا لزم الأمر. ترك الباقي لمدة 1 ساعة على RT.
- نضح المخلفات حل طلاء، وغسل 1X مع المتوسط الأمثل لفترة ما قبل الولادة والخلايا العصبية الجنينية و2X مع المقطر، الماء المعقم. إذا لم يتم استخدام الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف حتى اليوم التالي، والاحتفاظ بها في المقطر، الماء المعقم عند 37 درجة مئوية في حاضنة O / N. خلاف ذلك، اسمحوا الجافة مباشرة في RT.
2. المكونات المطلوبة لإعداد ونمو الثقافات عضوي النمط
- تحضير محلول الغسيل خالية من الكالسيوم (انظر قائمة المواد).
- إعادة البلازما الدجاج في محلول الغسيل (1: 1، ويهز بلطف، وتجنب تشكيل فقاعات)، الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة حوالي 20 دقيقة وصب مضمون واضح في أنبوب العقيمة. قسامة 200 ميكرولتر في cryotubes وتخزينها في -20 ° C.
- إعادة الثرومبين من البلازما البقري وفقا لذلك (200 U / مل)، ومعقم مرشح (فلتر 0.2 ميكرون المسام). قسامة 200 ميكرولتر في crytotubes وتخزينها في -20 ° C.
- لمدة 30 الثقافات إعداد 100 مل من المتوسط المغذيات (انظر قائمة المواد).
3. الحبل الشوكي الأنسجة تشريح
ملاحظة: عوائد الداخلي، اعتمادا على عدد من الأجنة، وشرائح النخاع الشوكي لمدة 25-35 المشترك الثقافات ومستعدة داخل غطاء تدفق الصفحي تحت ظروف معقمة.
- تطبيق جرعة قاتلة من بنتوباربيتال (0.4 مل) للحيوان أم عن طريق الحقن العضلي. تأكيد التخدير العميق عن طريق التحقق من المنعكس دواسة الانسحاب. تقديم أجنة الفئران E14 بواسطة العملية القيصرية والتضحية بقطع الرأس.
- نقل جثث الأجنة في طبق بتري مليئة العقيمة، المبردة، محلول الغسيل.
- نفذ أحد قطع مستعرضة الكامل مع مشرط فوق hindlimbs وآخر فوق الأمامية وإزالة أطرافه من الجسم. بعد ذلك، اجراء خفض في الطائرة الأمامية للفصل بين الأحشاء من قطعة الظهر التي تحتوي على المشارك الشوكيالثالثة.
- للتشريح، ونقل القطع مرة أخرى تحتوي على النخاع الشوكي في وقت واحد على قرص التركيب و قطع في سمك 225-250 ميكرون مع المروحية الأنسجة. وضع قطرة من محلول الغسيل على النسيج المفروم ونقل شرائح مع ملعقة في 35 ملم × 10 ملم أطباق بتري مليئة العقيمة، المبردة، محلول الغسيل.
- لكل شريحة على حدة، تشريح الحبل الشوكي بعيدا عن الأنسجة المتبقية. ترك العقد الجذرية الظهرية المرفقة.
- السماح للشرائح راحة لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية.
4. تركيب العمود الفقري شرائح الأنسجة الحبل على الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف
- الاحماء العقيمة المتوسطة المغذيات في الحاضنة (37 ° C، مفكوك طفيفة غطاء للالأوكسجين).
- موقف MEA مع ملاقط معقمة مع نصائح المغطاة بالمطاط باتجاه RT في طبق بتري تحت المجهر ستيريو مع مجموعة الكهربائي في التركيز. توسيط قطرة 6 ميكرولتر من البلازما الدجاج على نظيفة، خالية من الغبار، ومعقمة مجموعة الكهربائي. باستخدام ملعقة صغيرة، الشريحة بعنايةقسمين الحبل الشوكي مع الجانبين البطنية التي تواجه بعضها البعض في قطيرة البلازما. لا تلمس الأقطاب مع ملعقة.
- إضافة 8 ميكرولتر من ثرومبين حول قطيرة البلازما الدجاج. استخدام غيض ثرومبين ماصة، مزيج بعناية ونشر خليط الدجاج البلازما / ثرومبين حول شرائح اثنين. مرة أخرى، لا تلمس مجموعة الكهربائي هشة مباشرة. فقط قبل تجلط الدم، ونضح الزائد الدجاج البلازما / ثرومبين.
- سقف طبق بتري للاحتفاظ ارتفاع نسبة الرطوبة في حين أن التجمع MEA / ثقافة يجلس لمدة 1 ساعة في غرفة ترطيب داخل الحاضنة عند 37 درجة مئوية.
- إضافة بعناية 10 ميكرولتر من المتوسطة المغذيات إلى غرفة الثقافة، وكأب طبق بتري وإعادتها إلى الحاضنة لمدة حوالي 30 دقيقة.
- ضع كل جمعية MEA / ثقافة العقيمة مع، نصائح المغطاة بالمطاط في أنبوب أسطواني، إضافة 3 مل من المتوسط المغذيات وثيق محكم الغطاء. وضع أنبوب أسطواني في الأسطوانة الأسطوانة الدوارة في 1-2 دورة في الدقيقة في الحاضنة في CO 5٪
- تغيير نصف المتوسط المغذيات الدقيقة 7 أيام في المختبر (DIV) وبعد ذلك 1-2 مرات في الأسبوع.
5. الآفات الميكانيكية
- تتخذ الجمعية MEA / ثقافة العقيمة مع، نصائح المغطاة بالمطاط من أنبوب بكرة وضعها في طبق بتري دون المتوسطة المغذيات تحت المجهر ستيريو مع الأنسجة في التركيز. التحقق بصريا أن شرائح اثنين وتنصهر.
- عقد MEA / ثقافة ثابتة التجمع من خلال وضع ملاقط مع نصائح المغطاة بالمطاط على MEA.
- ضع شفرة المشرط في أخدود من MEA على مقربة من شرائح الأنسجة. عقد مشرط وليس أفقيا.
- رفع مشرط التعامل مع ما يصل ولكن دعونا نصل مشرط البقاء في أخدود من MEA في مثل هذه الطريقة أن نصل "فات" من القاعدة إلى طرف وبالتالي يخفض من خلال الأنسجة التي تغطي الأخدود.
- شديدة أية اتصالات الأنسجة المتبقية مع طرف 25 G إبرة إذا necessآرى. تعمل فقط في منطقة داخل أخدود وعدم لمس الحواف العطاء.
- وضع MEA / جمعية الثقافة مرة أخرى في أنبوب أسطواني. توفير 3 مل من المتوسط المغذيات جديدة للثقافات ووضعها مرة أخرى في طبلة بكرة في الحاضنة.
6. تسجيلات الكهربية من النشاط العفوي
- للتحقيق في تجديد وظيفية بين اثنين من شرائح النخاع الشوكي بعد الرقم المختار من DIV، جبل الجمعية MEA / الثقافة في غرفة تسجيل على المجهر وتطبيق حوالي 500 حل خارج الخلية ميكرولتر (انظر قائمة المواد).
- انتظر 10 دقيقة قبل أول تسجيل للسماح للنظام لتحقيق الاستقرار.
- سجل الأساسية 2X النشاط العفوي لمدة 10 دقيقة من كل قطب كهربائي للكشف عن نشاط MEA في RT.
- لضمان ظروف خارج الخلية مستقرة، تبادل حل خارج الخلية بعد كل جلسة تسجيل.
- لdisinhibit الشبكة، وتطبيق حل خارج الخلية المشتركntaining الإستركنين (1 ميكرومتر) وgabazine (10 ميكرومتر). الانتظار لمدة 2 دقيقة على الأقل قبل البدء في التسجيل.
تحليل 7. البيانات
ملاحظة: للكشف عن امكانات العمل المسجلة خارج الخلية استخدام لكل القطب كاشف على أساس الانحرافات المعيارية والممي لاحق. يتم وصف هذا الإجراء بالتفصيل في Tscherter وآخرون. 3.
- عرض نشاط الخلايا العصبية الكشف من كل قطب كهربائي في مؤامرة النقطية فقا للاجراءات المتبعة 3 (الشكل 1F).
- تحديد وعرض نشاط الشبكة الإجمالي لكل شريحة من خلال تلخيص عدد من الأحداث في القنوات وفقا داخل نافذة انزلاق 10 ميللي ثانية، تحول بنسبة 1 الخطوات مللي ثانية (الشكل 1G ونرى Tscherter وآخرون. 3).
- كشف في كل شريحة رشقات نارية الفردية (مجموعات من النشاط التي تظهر على العديد من الأقطاب الكهربائية). لذا، تعيين الحد الأدنى من عتبة النشاط ذروته في إجمالي نشاط الشبكة المقابلة وتحديد كل بداية انفجار ونهاية تنفجر. على سبيل المثال، عتبة المناسبة هي 25٪ من متوسط انفجار السعة وبداية انفجار التي يمكن ان تحدد كونه الحدث الأول في نافذة زمنية لا تقل عن 5 ميللي ثانية، نهاية انفجر لكونه الحدث الأخير في إطار وقت في أقل 25 مللي ثانية (انظر هايدمان وآخرون. 10).
- لتحديد تجديد وظيفية حساب النسبة المئوية للرشقات نارية متزامنة بين شرائح اثنين. للقيام بذلك، وحساب الكمون بين انفجار في شريحة واحدة وانفجار التالية في شريحة أخرى.
ملاحظة: زوج انفجار يسمى "متزامنة" عندما الكمون أصغر من متوسط طول انفجار. خصوصا في المشترك الثقافات مع الكثير من النشاط، وهناك احتمال أن كلا الجانبين الشروع قبيل الصدفة انفجار في الإطار الكمون الذي تم اختياره. هذه الحقيقة يجب أن يؤخذ في الاعتبار عند تحديد مقدار النسبة المئوية للسيرشقات نارية nchronized. للحصول على وصف مفصل للحسابات رؤية هايدمان وآخرون. 10.
8. التثبيت من الثقافات والمناعية
- لجميع الخطوات التي تشمل غسل أو الحضانة للتأكد من وضع الثقافات على طاولة إمالة لضمان نشر الصحيح من الحل من خلال الأنسجة.
- مباشرة بعد الانتهاء من تسجيل الدورة تتخذ الجمعية MEA / ثقافة من الإعداد، ووضعها في طبق بتري (35 ملم × 10 ملم) وإضافة حوالي 2 مل من محلول خارج الخلية.
- للفصل بين شرائح من طبقات الخلايا المحيطة التي شكلت خلال الوقت في المختبر، واتخاذ ماصة 10 ميكرولتر ودائرة شرائح. الاهتمام لا يلحق الضرر الثقافات. فمن الممكن أن حذفت هذه الخطوة ولكن التضمين في وقت لاحق من الأسهل عندما يتم تنفيذ ذلك.
- استخدام رقيقة غير المعدنية إبرة حقنة (انظر قائمة المواد) في تركيبة مع حقنة 1 مل مليئة soluti خارج الخليةعلى لتفجير بلطف ثقافة قبالة MEA.
- إزالة غيض من ماصة باستور ويصلح لمبة المطاط على نهاية slivered. استخدام النهاية الخلفية لنقل الثقافة في تثبيتي (4٪ امتصاص العرق مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، 0.1 M)). لا تستخدم طرف المعياري للماصة باستور لنقل لأنه صغير جدا، وسوف تكون مطوية الثقافات وربما تضررت. إصلاح 1 - 2 ساعة في 4 درجات مئوية. شطف MEA مع الماء المقطر وإزالة بقايا الأنسجة مع أطراف الأصابع ولكن لا تخدش مع الظفر. متجر الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف في الماء المقطر عند 4 درجة مئوية.
- غسل الثقافات 3X في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة على الأقل لكل منهما. تخزين في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية أو البدء مباشرة مع إجراء تلطيخ.
- احتضان الثقافات لمدة 90 دقيقة على الأقل في عرقلة الحل (5٪ مصل الماعز، 1٪ ألبومين المصل البقري، والمنظفات بنسبة 0.3٪ في PBS).
- إضافة الجسم المضاد الأول مخففة في حل الحجب واحتضان لمدة 3 ليال في 4 ° C.
- غسل 3X في برنامج تلفزيوني لفي لترالشرقي 30 دقيقة لكل منهما.
- إضافة الجسم المضاد الثاني مخففة في برنامج تلفزيوني لمدة 2 ساعة على RT.
- غسل 3X في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة على الأقل لكل منهما.
- نقل شرائح مع ماصة باستور مع تلميح إزالة على الشريحة الكائن. إزالة PBS الزائدة وتضمين مع تصاعد المتوسط.
Representative Results
للتحقيق في احتمالات الانتعاش وظيفية للثقافات المشتركة المستمدة من الحبل الشوكي للأجنة الفئران E14، أجريت الآفات في إطار الوقت من 8-28 DIV. في وقت لاحق 2-3 أسابيع، تم تسجيل نشاط الخلايا العصبية عفوية مع الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف (الشكل 1 C & D). وقد تم التعرف على امكانات العمل المسجلة خارج الخلية حاليا لكل القطب الفردية (الشكل 1E). من هذه البيانات تم إنشاء المؤامرات النقطية (الشكل 1F)، تليها المؤامرات نشاط الشبكة لتصور النشاط الكلي بشكل منفصل لكل جانب (الشكل 1G). في كل شريحة عادة ما يتم تنظيم النشاط العفوي في رشقات نارية. إذا كنت متصلا شرائح وظيفيا، يمكن لهذه رشقات نارية نشر من شريحة واحدة إلى أخرى. لذلك، تم احتساب مبلغ رشقات نارية متزامنة بين شرائح اثنين لقياس كميا تجديد وظيفية. للحصول على وصف مفصل لكيفية الباحث التحولس المؤامرات مختلفة يتم تنفيذها وكيف تم اشتقاق صيغة لحساب النسبة المئوية للنشاط متزامنة، يرجى الاطلاع هايدمان وآخرون. 10.
في كل التجارب، وكانت قد سجلت أول نشاط تحت الظروف القياسية. في الخطوة الثانية، تم حجب تثبيط متشابك بإضافة الإستركنين (1 ميكرومتر) وgabazine (10 ميكرومتر) إلى حل حمام خارج الخلية. هذا السلوك الفاضح يؤدي عادة إلى نمط النشاط أكثر انتظاما مع رشقات نارية طويلة وفترات تنفجر، مما يسهل تعريف رشقات نارية وبالتالي تحديد تزامن انفجار بين شرائح.
ثقافات lesioned في سن مبكرة (7-9 DIV) المعروضة على كمية عالية من النشاط متزامنة بعد 2-3 أسابيع الآفة في حين أن الثقافات lesioned في مراحل لاحقة (> 19 DIV) أظهرت انخفاض ملحوظ في القدرة على التجدد (الشكل 2 A - F). وتشير هذه النتائج إلى أن القدرة تجديدوصلات وظيفية في العمود الفقري الثقافات شريحة الحبل يقلل من مستوى عال، وتمثيل الدولة الجنينية في الجسم الحي، إلى مستوى منخفض، وتمثيل الدولة بمزيد من التطوير في الجسم الحي، في غضون ثلاثة أسابيع في الثقافة.
ما هي أنواع الاتصالات تشارك فعليا في تزامن انفجار بين شرائح اثنين؟ إلى جانب وصلات نخاعي مخصوص، يمكن أن تنشأ ألياف أيضا من العصبونات الحركية أو الظهرية الخلايا العصبية العقدة الجذرية. وقد تبين أنه سبق أن الظهرية الخلايا العصبية العقدة الجذرية ليست ذات الصلة من أجل الربط الوظيفي بين الحبل الشوكي شرائح 10. ومع ذلك، ظلت مشاركة العصبونات الحركية الاحتمال. منذ معروفة العصبونات الحركية لتشكيل اتصالات كوليني إلى الخلايا العصبية في النخاع الشوكي من خلال مستقبلات النيكوتين 13، تم تسجيل نشاط النخاع الشوكي المشترك الثقافات في 8 DIV، وقت عرض الثقافات النشاط 10 متزامنة للغاية، وخصم النيكوتينيك Mecamوأضاف ylamine (MEC، و 100 ميكرومتر) إلى حل حمام خارج الخلية. ومن شأن مشاركة العصبونات الحركية في العلاقة بين شرائح اثنين يؤدي إلى انخفاض نسبة النشاط متزامنة. ومع ذلك، كان هذا ليس هو الحال (MEC: 91.0 ± 4.5٪، ن = 7؛ التحكم: 93.6 ± 4.6٪، ن = 7، ص> 0.05، يلكوكسن مطابقة أزواج الاختبار). وتشير هذه النتائج إلى أن نقاط الاشتباك العصبي كوليني لا تساهم في الاتصال الوظيفي بين شرائح. ومع ذلك، منذ أن تبين أيضا العصبونات الحركية للافراج عن الغلوتامات في نقاط الاشتباك العصبي داخل الجهاز العصبي المركزي 11، 15، وهذه التجارب لا تستبعد تماما مشاركتها.
لتحديد العصبونات الحركية stainings المناعى ضد غير فسفرته خيط عصبي H مع أجريت SMI-32. وكشفت عدة هيئات وصفت كبيرة خلية نموذجية لالعصبونات الحركية، موزعة على شرائح (الشكل 3A). وقد تم الإبلاغ عن SMI-32 الأجسام المضادة لتسمية الهيئات خلية من motoneuroنانوثانية 12 وهذا الاستنتاج ينطبق أيضا على الثقافات تستخدم 13. أيضا، stainings من أجسام الخلايا العصبية بشكل عام، على سبيل المثال، ضد ب-III-تويولين أو NeuN وكذلك أجسام الخلايا الدبقية، على سبيل المثال، الخلايا النجمية مع GFAP الضد تتماشى مع تقارير أخرى وتطابق الأوصاف المورفولوجية من هذين النوعين من الخلايا ( الرقم 3 B - D). ومع ذلك، فإن وضع العلامات من المحاور مع الأجسام المضادة SMI-32 والمتعلقة (الشكل 3E). مقابل التوقعات، تظهر شبكة ضخمة من الألياف عند استخدام هذه الأجسام المضادة، ويبدو مماثل لتلطيخ SMI-31 التي تصف مفسفر خيط عصبي H (الشكل 3F). تفسير واحد لهذه النتيجة يمكن أن تكون أن تنظيم التنموي للخيط عصبي الفسفرة / نزع الفسفات ليس كما مشددة في الثقافات المستخدمة مقارنة بالوضع في الجسم الحي. A حدوث مختلطة من neurofilaments مفسفر وغير فسفرته في نفس المحور العصبي يمكن أن EXPLعين هذه النتيجة. والاحتمال الآخر هو أن SMI-32 محاور المسمى تنشأ من الخلايا العصبية الإسقاط. وقد أظهرت تسانغ وزملاؤه 16 أن مثل ملطخة عمود وعمود الخلية المتوسط الوحشي الخلايا العصبية كلارك التي كتبها SMI-32 إلى جانب العصبونات الحركية. يمكن ضوحا انتشار محوار من هذه الخلايا العصبية أيضا يفسر وفرة SMI-32 الألياف إيجابية.
الشكل 1. عرض وتحليل النشاط العفوي. (A) رسم تخطيطي لMEA. وصفت الأقطاب البلاتين مغطاة باللون الأسود، الأسلاك شفافة باللون الأحمر والأخدود في منتصف MEA باللون الأصفر. (B) عن قرب من مجموعة الكهربائي الموجود في وسط MEA. يتم تقديم المخططات تفضلت الدكتور M. Heuschkel. (C) صورة مشرق الميدان لالثقافيه القديمة 8 DIVه. نمت شرائح وتنصهر على طول الجانبين في مواجهة بعضهما البعض. ويمثل الشريط الأصفر الأخدود electrode- وخالية من العزل من MEA. على نطاق وبار = 400 ميكرون (D) الجدول الزمني للتجارب. يتم وضع شريحتين في النخاع الشوكي للأجنة الفئران E14 بجانب بعضها البعض على الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف. في غضون أيام قليلة، وشرائح تنمو والصمامات على طول الجانبين في مواجهة بعضهما البعض. في إطار زمني من 8-28 DIV، يتم تنفيذ الآفات كاملة من خلال الموقع الانصهار. في وقت لاحق أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع من النشاط العفوي يتم تسجيلها ويتم إصلاح الثقافات لstainings المناعى. (E) آثار النشاط العفوي من كل قطب كهربائي الفردي للثقافة القديمة 23 DIV. لأوضح التصور، ويتضح فقط كل أثر الثاني. آثار البرتقال تصور النشاط الذي تم تسجيله من شريحة على الجانب الأيمن، وآثار الزرقاء من الجانب الأيسر. تتم مزامنة معظم رشقات نارية بين البلدين. يشير السهم إلى انفجار تحدث في شريحة اليسار أن ص فقطنشر artially إلى شريحة الصحيحة. النشاط في شريحة الصحيحة ولكن لم تصل إلى عتبة المختار لا يقل عن 25٪ من متوسط النشاط ذروته القصوى من الجانب وفقا لذلك، لم يتم الكشف بمثابة انفجار. تكبير على اليمين تصور الماضي الزوج انفجار متزامن. (F) النقطية مؤامرة من النشاط هو مبين في (E). (G) قطعة نشاط الشبكة مع رشقات نارية محددة (القضبان دون خط الأساس) من النشاط هو مبين في (E). مقتبس من هايدمان وآخرون. 10. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. متزامنة مقابل آخر غير متزامنة. (A، B) المؤامرات النقطية الثقافات lesioneد في سن مبكرة (في 7-9 DIV)، والتي تبين النشاط متزامنة في ظل ظروف قياسية (A) وتحت السلوك الفاضح (B). (C، D) قطع النقطية الثقافات lesioned في سن القديم (في> 19 DIV)، والتي تبين نشاط غير متزامنة تحت الظروف القياسية (C) وتحت السلوك الفاضح (D). (E، F) متوسط نسبة النشاط تزامن خططت لكل يوم الآفة الفردية المسجلة تحت الظروف القياسية (E) وتحت السلوك الفاضح (F). اتخذت التسجيلات 2 - 3 أسابيع بعد يوم الآفة. مقتبس من هايدمان وآخرون. 10. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Figure 3. المناعى توصيف. (A) تلون أجسام الخلايا motoneuronal مع SMI-32. (B) β-III العلامات تويولين من أجسام الخلايا العصبية الناضجة وعملياتها. (C) تحديد الخلايا النجمية مع GFAP. (D) وسمها ناضجة خلايا الجسم العصبية مع NeuN. (E) SMI-32 تلطيخ من غير فسفرته خيط عصبي H. (F) خيط عصبي مفسفر H حددها SMI-31. مقتبس من هايدمان وآخرون. 10. لاحظ أنه مع كل من، SMI-31 و SMI-32، وهي شبكة كبيرة من الألياف غير مرئية في الثقافات. الحانات AD = 20 ميكرون، H & F = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
عدة عناصر في الإجراء قدم أساسية لإنجاز تجارب دقيقة وقابلة للتكرار. يتم تنفيذ جميع الخطوات أثناء إعداد الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف والحلول وإنتاج الثقافات شريحة تحت ظروف معقمة في غطاء تدفق الصفحي. لا يتم تطبيق المضادات الحيوية للوسط الغذائي لأنها يمكن أن تؤثر على النشاط العفوي 14. خلال طلاء MEA، والجزء الأهم هو التأكد من أن الخلية حل هلام مصفوفة يبقى باردا في جميع الأوقات. ذوبان الجليد في الثلاجة ويبقيه على الجليد لمدة الإجراء بأكمله لضمان درجة الحرارة القصوى قريبة من 0 درجة مئوية. أثناء إعداد شرائح العزل سريعة وباجتزاء، وكذلك الالتفات إلى درجة حرارة منخفضة باستخدام الثلج مخازن تشريح الباردة يزيد من نسبة ثقافات صحية. وعلاوة على ذلك، البلازما / ثرومبين التخثر هي واحدة من أهم الخطوات. أولا، تأكد من أن البلازما هي الورقة و صحيحد مع ثرومبين. الثانية، وإيلاء اهتمام خاص لإزالة أكبر قدر ممكن من بقايا ممكن لضمان التعلق الصحيح للشرائح على الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف. هذه الخطوة هي غاية الحساسة للوقت. إذا كانت الفترة الزمنية قصيرة جدا، وإزالة الكثير من الخليط البلازما / ثرومبين. إذا كان إطار زمني طويل جدا، تخثر حدث بالفعل، مما يزيد من مخاطر إزالة شرائح جنبا إلى جنب مع المتبقية البلازما / ثرومبين.
إذا تم التخطيط الآفات الميكانيكية، فمن المهم استخدام الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف مع تصميم دقيق. المنطقة حيث يهدف الآفة يجب أن تكون خالية من الأقطاب الكهربائية وأسلاك والعزل. خلاف ذلك، والكهربائية من شركة طيران الشرق الأوسط تسير للتلف وبالتالي، لا يمكن أن يؤديها التسجيلات بعد الآن.
خطوة حاسمة أخرى تتعلق حجم الآفة. وقد تبين أنه سبق أن إعادة توصيل شريحتين الشباب بعد الآفة يستغرق حوالي يومين 10. لجميع التجارب، تم استخدام بحكم التجربة أن betwe الفضاءأون شرائح بعد الآفة لا ينبغي أن يكون أكبر من عرض الأخدود MEA (300 ميكرون). A حجم أكبر آفة قد يؤدي إلى فترة زمنية أطول لإعادة الاتصال أو، إذا كان آفة كبيرة جدا، لا إعادة الاتصال على الإطلاق. لتعليم، وكشفت التجارب السابقة أن وضع الأولي للشرائح اثنين أبعد من 1 مم النتائج في سرعة الاتصال منخفض جدا.
قبل بداية التسجيلات، وقت التعديل لا يقل عن 10 دقيقة لRT، بدلا من 37 درجة مئوية في الحاضنة، وإلى حل خارج الخلية، بدلا من وسيلة التغذية الموصى بها. مراقبة وثيقة من نمط النشاط خلال هذه الدقائق الأولية يضمن أن البيانات المقاسة تمثل نمط انفجار الثقافة بشكل مناسب بعد أن بدأ تسجيل.
للكشف عن النشاط، الحصول على البيانات ومزيد من المعالجة، والأجهزة المنزلية (غرفة تسجيل، وصلات إلى مكبرات الصوت ومكبرات الصوت)، وبرامج في مختبرVIEW، تستخدم C ++ وIgorPro. هي مناسبة الاجهزة MEA التجارية وحزم البرامج الأخرى فضلا عن هذه العمليات. هنا، وتتضخم الإشارات التي اطلعت عليها الأقطاب 1001 مرات، ثم رقمنة بمعدل 6 كيلو هرتز.
يمكن للنموذج المقدم أن تكون أداة مفيدة لدراسة الاتصالات نخاعي مخصوص لفي الجسم الحي، فهي من الصعب دراسة دون تدخل تصاعدي وتنازلي مساحات الألياف. للزراعة المشترك للشريحتين الحبل الشوكي يمكن أن تلتف بأناقة هذه المسألة. ثقافات توفر المكروية التي يمكن السيطرة عليها بإحكام والتلاعب بها بسهولة. من ناحية أخرى، ومدخلات فوق الشوك والحسي هو بطبيعة الحال في عداد المفقودين. بالإضافة إلى ذلك، فإن عملية إعداد الثقافة تمثل حالة تلف الجهاز العصبي المركزي. ومن المعروف أن الخلايا الدبقية النجمية مثل والخلايا الدبقية الصغيرة للرد على الآفات مع زيادة انتشار وبالتالي، والنسيج هو إلى حد ما أعيد تنظيمها. تتصل وضع قدملم يكن لوحظ لتر تشكيل ندبة الدبقية بعد أداء الآفات الميكانيكية. يمكن أن يكون تفسير واحد أن آليات التكيف من الخلايا النجمية وقد أثار بالفعل أثناء عملية إعداد والآفات من الثقافات لم يسفر عن رد آخر. أيضا، لا يوجد أي دليل على تورط المايلين مثبطات المرتبطة بها، على سبيل المثال، Nogo-A، في إمكانية تجديد منخفضة من الثقافات lesioned في سن الشيخوخة. ومع ذلك، فقد تبين أن المعاملة مع مثبطات الفوسفو 4 Rolipram، بدءا مباشرة بعد أداء الآفات في 23 DIV التجديد زيادات الوظيفي بين شرائح 10. وتبين هذه النتائج أن الانتعاش وظيفية قابلة للزيادة في الثقافات القديمة. بشكل ملحوظ، عندما عد عدد من المحاور عبور موقع الآفة، تم اكتشاف أي اختلاف بين الثقافات lesioned في سن مبكرة والثقافات lesioned في سن الشيخوخة. وتشير هذه النتائج إلى أن عدم وجود تجدد المحاور ليست هي السبب و الكبرىأو فقدان الانتعاش بعد الآفات المتأخرة في الثقافة وبالتالي التأكيد على الحاجة إلى نموذج الذي يسمح التحليل الوظيفي للتجديد. تشكيل متشابك واللدونة متشابك يمكن أن تلعب دورا رئيسيا في عملية الانتعاش 10. اكتسبت هذه الآليات على الكثير من الاهتمام خلال السنوات الأخيرة، وهذه الأيام مقبولة على نطاق واسع أن لديهم تأثير كبير على نتائج بعد إصابة الحبل الشوكي. لذلك، يمكن للنموذج الذي يوفر ظروف مستقرة للتحقيق في هذه العمليات في عزلة وبقدر كبير من التفصيل يساعد بالتأكيد للحصول على فكرة عن تجديد وظيفية في الحبل الشوكي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Planar multielectrode array | Qwane Biosciences | custom-made according to the design of our lab | |
| Nutrient medium | For 100 ml | ||
| Dulbeccos modified Eagle's medium | Gibco | 31966-021 | 80 ml |
| Horse serum | Gibco | 26050-070 | 10 ml |
| distilled, sterile water | 10 ml | ||
| Nerve growth factor-7S [5 ng/ml] | Sigma-Aldrich | N0513 | 200 µl |
| reconstituted in wash solution with 1% BSA | |||
| Coating solution | |||
| Extracellular matrix gel | BD Biosciences | 356230 | Must stay cold at all times; dilute 1:50 with medium optimized for prenatal and embryonic neurons |
| medium optimized for prenatal and embryonic neurons | Gibco | 21103-049 | |
| Wash solution | [mg/L] | ||
| MgCl2-6H2O | 100 | ||
| MgSO4-7H2O | 100 | ||
| KCl | 400 | ||
| KH2PO4 | 60 | ||
| NaCl | 8,000 | ||
| Na2HPO4 anhydrous | 48 | ||
| D-Glucose (Dextrose) | 1,000 | ||
| According to the protocol on http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html | |||
| Extracellular solution (pH 7.4) | [mM] | ||
| NaCl | 145 | ||
| KCl | 4 | ||
| MgCl2 | 1 | ||
| CaCl2 | 2 | ||
| HEPES | 5 | ||
| Na-pyruvate | 2 | ||
| Glucose | 5 | ||
| Blocking Solution | |||
| Detergent: Triton X-100 | 0.3%, harmful if swallowed | ||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | 1% |
| Goat serum | Gibco | 16210-064 | 5% |
| Chicken Plasma | Sigma-Aldrich | P2366 | Lyophilized, reconstitute with wash solution |
| Gabazine | Sigma-Aldrich | SR-95531 | |
| Mecamylamine hydrochloride | Tocris | 2843 | toxic if swallowed |
| Micropipette | World Precision Instruments, Inc. | MF28G-5 | |
| Paraformaldehyde | harmful, 4% | ||
| SMI-31 | Covance | SMI-31P | |
| SMI-32 | Covance | SMI-32R-500 | |
| Strychnine | Sigma-Aldrich | S0532 | toxic |
| Thrombin | Merck Millipore | 1123740001 | irritant, sensitizing, reconstitute with wash solution |
| Tissue culture flat tube 10 (= roller tube) | Techno Plastic Products AG | 91243 | |
References
- Avossa, D., Rosato–Siri, M., Mazzarol, F., Ballerini, L. Spinal circuits formation: a study of developmentally regulated markers in organotypic cultures of embryonic mouse spinal cord. Neuroscience. 122 (2), 391-405 (2003).
- Cifra, A., Mazzone, G. L., Nani, F., Nistri, A., Mladinic, M. Postnatal developmental profile of neurons and glia in motor nuclei of the brainstem and spinal cord, and its comparison with organotypic slice cultures. Dev Neurobiol. 72 (8), 1140-1160 (2012).
- Tscherter, A., Heuschkel, M. O., Renaud, P., Streit, J. Spatiotemporal characterization of rhythmic activity in rat spinal cord slice cultures. Eur. J. Neurosci. 14 (2), 179-190 (2001).
- Czarnecki, A., Magloire, V., Streit, J. Local oscillations of spiking activity in organotypic spinal cord slice cultures. Eur. J. Neurosci. 27 (8), 2076-2088 (2008).
- Kirkby, L. A., Sack, G. S., Firl, A., Feller, M. B. A role for correlated spontaneous activity in the assembly of neural circuits. Neuron. 80 (5), 1129-1144 (2013).
- Ballerini, L., Galante, M., Grandolfo, M., Nistri, A. Generation of rhythmic patterns of activity by ventral interneurones in rat organotypic spinal slice culture. J. Physiol. (Lond.). 517 ((Pt 2)), 459-475 (1999).
- Hanson, M. G., Landmesser, L. T. Normal patterns of spontaneous activity are required for correct motor axon guidance and the expression of specific guidance molecules). Neuron. 43 (5), 687-701 (2004).
- Courtine, G., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nat. Med. 14 (1), 69-74 (2008).
- Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model. Eur. J. Neurosci. 27 (10), 2483-2492 (2008).
- Heidemann, M., Streit, J., Tscherter, A. Functional regeneration of intraspinal connections in a new in vitro model. Neuroscience. 262, 40-52 (2014).
- Nishimaru, H., Restrepo, C. E., Ryge, J., Yanagawa, Y., Kiehn, O. Mammalian motor neurons corelease glutamate and acetylcholine at central synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (14), 5245-5249 (2005).
- Tsuji, S., et al. Proteasome inhibition induces selective motor neuron death in organotypic slice cultures. J. Neurosci. Res. 82 (4), 443-451 (2005).
- Magloire, V., Streit, J. Intrinsic activity and positive feedback in motor circuits in organotypic spinal cord slice cultures. Eur. J. Neurosci. 30 (8), 1487-1497 (2009).
- Bahrami, F., Janahmadi, M. Antibiotic supplements affect electrophysiological properties and excitability of rat hippocampal pyramidal neurons in primary culture. Iran. Biomed J. 17 (2), 101-106 (2013).
- Mentis, G., et al. Noncholinergic excitatory actions of motoneurons in the neonatal mammalian spinal cord. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A.. 20 (102), 7344-7349 (2005).
- Tsang, Y. M., Chiong, F., Kuznetsov, D., Kasarskis, E., Geula, C. Motor neurons are rich in non–phosphorylated neurofilaments: Cross– species comparison and alterations in ALS. Brain Res. 861 (45–58), (2000).
