Summary
Ici, nous présentons un protocole qui est basée sur des tranches de moelle épinière en culture sur des réseaux multi-électrode à étudier la régénération fonctionnelle de connexions propriospinaux in vitro.
Introduction
Cultures organotypique du système nerveux central (SNC) ont été largement utilisés pour étudier divers phénomènes physiologiques et pathologiques allant de développement neuronal à la neurodégénérescence. Par rapport à des cultures de cellules dissociées, des tranches organotypiques offrent l'avantage d'une plus grande complexité avec un cytoarchitecture intact et un circuit synaptique local. Dans le même temps, le tissu peut être analysée de façon isolée, sans la nécessité de mettre en cause la complexité de l'ensemble du contexte dans vivo. De plus, un accès facile et répété pour les cellules de choix est justifié, à l'environnement extra-cellulaire peut être contrôlée avec précision et, en général, des modèles in vitro sont moins coûteux que leurs homologues in vivo. Au cours des dernières années, diverses études présentées similitudes frappantes entre les profils de développement des cultures à long terme par rapport aux animaux vivants correspondante 1,2. Il a été montré que les circuits de neurones du SNC de divers regions expriment l'activité de réseau spontané au cours du développement et que les tranches organotypiques maintenir partiellement ce phénomène 3 -7. Préparations isolées de la moelle épinière ont été particulièrement utilisées pour étudier la production de rythme 6 et la formation des circuits neuronaux 1.
Un moyen d'enregistrer l'activité spontanée de tranches organotypiques est à la culture sur le dessus de tableaux multi-électrodes (AME). Ces appareils contiennent de multiples électrodes qui peuvent surveiller les potentiels extracellulaires générés par les potentiels d'action à partir de nombreuses cellules simultanément (enregistrement multi-unité). La haute résolution temporelle des enregistrements MEA peut être utilisée pour reconstruire la dynamique d'activité précis dans un circuit neuronal donné. En outre, contrairement à la pièce de serrage technique est non invasive, qui permet des mesures et les résultats à long terme dans le fait que les neurones ne sont pas affectés dans leur comportement.
Fou les besoins de cette étude, la combinaison de la moelle épinière co-cultures organotypiques et enregistrements multisite a été utilisé pour étudier la régénération fonctionnelle au sein de la moelle épinière. Depuis adultes vertébrés supérieurs ont le potentiel pour récupérer des dommages de la moelle épinière limité, différentes stratégies ont été étudiées pour favoriser la régénération après une lésion de la moelle épinière. Jusqu'à présent, le faisceau cortico-spinal a généralement été le système de modèle de choix pour ces enquêtes. Ces expériences sont généralement beaucoup de temps, coûteux et nécessitent de grandes cohortes d'animaux en raison de la forte variabilité au sein des groupes simples. En outre, il semble que les connexions propriospinaux (neurones qui sont entièrement confinés à l'intérieur de la moelle épinière) peuvent jouer un rôle central dans le processus de récupération suite à des lésions de la moelle épinière 8. Ces fibres sont difficiles à étudier in vivo sans l'interférence de monter et descendre des faisceaux de fibres. Bonnici et Kapfhammer 9 utilisés moelle épinière longitudinalecultures tranche de souris postnatales comme une approche alternative. Après avoir effectué les lésions mécaniques, ils ont analysé semi-quantitative de la régénération des axones morphologique entre les segments de la moelle épinière. Ils ont observé moins, mais pas Aucun axones traversant le site de la lésion dans les cultures coupées à un âge mûr. En revanche, les cultures qui ont été lésés à un stade jeune affichent une grande quantité de régénération axonale 5 - 7 jours après le dommage. Toutefois, la preuve pour les connexions fonctionnelles n'a pas été présenté.
Par conséquent, le développement d'un représentant dans le modèle in vitro de fibres propriospinaux qui permet à l'enquête de la régénération fonctionnelle peut être un outil précieux pour étendre nos connaissances sur les processus de régénération de la moelle épinière.
Protocol
Les soins des animaux était conforme aux lignes directrices approuvées par les autorités locales suisses (Amt für Landwirtschaft und Natur des Kantons Bern, Veterinärdienst, Sekretariat tierversuche, Nrs d'approbation. 52/11 et 35/14). Ces lignes directrices sont en accord avec la directive européenne 2010 Communauté / 63 / UE.
Remarque: Travailler dans une hotte à flux laminaire avec des instruments et des solutions stériles pour toutes les étapes 1 - 5 y compris les sous-étapes.
1. Préparation des AME
Nota: AME sont composés d'un substrat de verre, micro-fabriqué des électrodes métalliques et une couche d'isolation polymère SU-8 (voir aussi Tscherter et al. 3). Aux fins de cette étude, les AEM disponibles dans le commerce ont été commandés avec un réseau d'électrodes mise en page personnalisée (Figure 1 A & B). Les 68 électrodes sont disposées dans une grille rectangulaire qui est divisée en deux zones par une rainure 300 um de largeur libre d'électrodes, électrprospects et isolation iCal. Chaque électrode est de 40 x 40 um en taille et ils sont espacés de 200 um de centre à centre. Quatre grandes électrodes de masse sont disposées autour de l'emplacement d'enregistrement. Ils diffèrent des autres AME standards disponibles dans le commerce à leur taille (21 mm x 21 mm) et ils ont pas de chambre d'enregistrement fixe.
- Pour désinfection AME de rinçage à l'éthanol 100% (2x), 70% d'éthanol (1x) et d'eau distillée (2x) pendant au moins 30 secondes chacun. Laisser sécher. Mettez 10 - 12 AME dans une boîte de Pétri en verre propre (150 mm x 25 mm) et fermer le couvercle.
- AME autoclave pendant 20 min à 120 ° C. Stocker à température ambiante.
- Préparer la solution de revêtement (voir la liste des matériaux) pour les AME et aliquotes de conserver à -20 ° C.
- Mettez chaque MEA dans une boîte de Pétri stérile individuel (35 mm x 10 mm).
- Utiliser une pipette refroidie à mettre 150 solution de revêtement ul refroidi au-dessus des électrodes et fermer le couvercle de la boîte de Pétri. Après environ 10 minutes, vérifier les bulles d'air au-dessus deles électrodes et retirez délicatement dessus avec une spatule en caoutchouc recouverte si nécessaire. Laisser reposer pendant 1 heure à température ambiante.
- Résidus de solutions de revêtement de Aspirer, lavent 1x avec un milieu optimisé pour prénatale et neurones embryonnaires et 2x avec distillée, de l'eau stérile. Si AME ne sont pas utilisés jusqu'à ce que le lendemain, les conserver dans l'eau distillée stérile à 37 ° C dans l'incubateur O / N. Sinon, laissez directement à sec à température ambiante.
2. Ingrédients nécessaires à la préparation et la croissance des cultures organotypiques
- Préparer la solution de lavage sans calcium (voir la liste des matériaux).
- Reconstituer le plasma de poulet dans une solution de lavage (1: 1, secouez doucement, éviter la formation de bulles), centrifuger à 3000 g pendant environ 20 min et décanter le contenu clair dans un tube stérile. Aliquote de 200 ul dans des cryotubes et conserver à -20 ° C.
- Reconstituer la thrombine à partir de plasma bovin en conséquence (200 U / ml) et stérilisée par filtration (filtre de 0,2 um des pores). Aliquoter 200 pi dans crytotubes et conserver à -20 ° C.
- Pour 30 cultures préparer 100 ml de milieu nutritif (voir la liste des matériaux).
Dissection des tissus 3. Spinal Cord
Nota: Les rendements de procédure, en fonction du nombre d'embryons, des tranches de moelle épinière pendant environ 25 - 35 co-cultures et est préparé à l'intérieur d'une hotte à flux laminaire dans des conditions stériles.
- Appliquer une dose létale de pentobarbital (0,4 ml) à la mère de l'animal par injection intramusculaire. Confirmez anesthésie profonde en vérifiant le réflexe de retrait de la pédale. Livrer embryons de rat E14 par césarienne et le sacrifice par décapitation.
- Transférer les corps des embryons dans une boîte de Pétri remplie de solution stérile réfrigérés, lavage.
- Effectuer une coupe transversale complète avec un scalpel au-dessus des membres postérieurs et une autre au-dessus des pattes avant et retirer les membres de l'organisme. Ensuite, faire une coupe dans le plan frontal pour séparer les viscères du dos contenant le co moellee.
- Par le tranchage, transférer les morceaux contenant de la moelle épinière une à la fois sur un disque de montage et couper à une épaisseur de 225 - 250 um avec un broyeur de tissus. Mettre une goutte de solution de lavage sur le tissu haché et transférer tranches avec une spatule en 35 mm x 10 mm de boîtes de Pétri remplies de solution stérile réfrigérés, lavage.
- Pour chaque tranche séparément, disséquer la moelle épinière loin de tissu restant. Donner des ganglions de la racine dorsale attachée.
- Laissez les tranches reposer pendant 1 heure à 4 ° C.
4. Montage tranches cordon de tissus de la colonne vertébrale sur les AME
- Warm up milieu nutritif stérile dans l'incubateur (37 ° C, légèrement couvercle pour l'oxygénation dévissé).
- Position MEA avec des pincettes stériles avec pointes recouvertes de caoutchouc à la température ambiante dans la boîte de Pétri sous un microscope stéréo avec le réseau d'électrodes dans le foyer. Centrer une gouttelette 6 pi de plasma de poulet sur le propre, sans poussière, et stérile réseau d'électrodes. En utilisant une petite spatule, soigneusement glisserdeux sections de la moelle épinière avec des côtés ventral face de l'autre dans la gouttelette de plasma. Ne touchez pas les électrodes avec la spatule.
- Ajouter 8 pi de thrombine autour de la gouttelette de plasma de poulet. Avec la pointe de la pipette thrombine, mélanger délicatement et étaler le mélange de poulet plasma / de thrombine autour des deux tranches. Encore une fois, ne pas toucher directement le réseau d'électrodes fragile. Juste avant la coagulation, aspirer l'excès de poulet plasma / thrombine.
- Cap la boîte de Pétri de conserver une humidité élevée tandis que l'ensemble MEA / culture assis pendant environ 1 h dans une chambre humidifiée à l'intérieur de l'incubateur à 37 ° C.
- Soigneusement ajouter 10 pi de milieu nutritif à la chambre de culture, plafonner la boîte de Pétri et remis dans l'incubateur pendant environ 30 min.
- Placez chaque assemblage MEA / culture avec, conseils recouverts de caoutchouc stérile dans un tube de rouleau, ajouter 3 ml de milieu nutritif et bien fermer le couvercle. Placer le tube d'enroulement dans le tambour de rouleau tournant à 1-2 tours par minute dans l'incubateur à 5% de CO un
- Changer la moitié du milieu de culture au bout de 7 jours in vitro (DIV) et après 1 - 2 fois par semaine.
5. lésions mécaniques
- Prenez l'assemblage MEA / culture avec embouts stériles, caoutchouc recouvert sur le tube d'enroulement et le placer dans une boîte de Pétri sans milieu nutritif sous un microscope stéréo avec le tissu au point. Vérifier visuellement que les deux tranches sont fusionnés.
- Maintenez la MEA / culture assemblée régulière en plaçant une pince à épiler avec des pointes recouvertes de caoutchouc sur la MEA.
- Placer une lame de scalpel dans la rainure de la MEA à proximité des tranches de tissu. Maintenez le scalpel plutôt horizontalement.
- Soulevez la poignée de scalpel jusqu'à mais laissez la lame de scalpel rester dans la gorge de la MEA de telle manière que la lame "rouleaux" de la base au sommet et coupe ainsi le tissu couvrant travers la gorge.
- Graves des connexions de tissus résiduels avec une pointe d'aiguille 25 G si nécessAry. Travailler uniquement dans la région dans la gorge et ne touchez pas les bords d'appel d'offres.
- Mettez la MEA / Assemblée de la culture dans le tube du rouleau. Fournir 3 ml de milieu nutritif frais pour les cultures et les replacer dans le tambour de rouleau dans l'incubateur.
6. électrophysiologique enregistrements de l'activité spontanée
- Pour étudier la régénération fonctionnelle entre les deux tranches de la moelle épinière après le nombre choisi de DIV, monter l'ensemble MEA / culture dans une chambre d'enregistrement sur un microscope et d'appliquer environ 500 solution extracellulaire pi (voir la liste des matériaux).
- Attendre 10 min avant le premier enregistrement pour permettre au système de se stabiliser.
- Enregistrez base 2x activité spontanée pour environ 10 min de chaque électrode de la MEA à l'activité RT-détection.
- Pour assurer des conditions stables extracellulaires, échanger solution extracellulaire après chaque session d'enregistrement.
- Pour désinhiber le réseau, appliquer la solution extracellulaire containing strychnine (1 uM) et gabazine (10 uM). Attendez au moins 2 minutes avant de commencer l'enregistrement.
Analyse des données 7.
Remarque: Pour la détection des potentiels d'action au niveau extracellulaire enregistrées pour chaque électrode utilisant un détecteur basé sur les écarts types et un discriminateur ultérieure. Cette procédure est décrite en détail dans Tscherter et al. 3.
- Afficher l'activité neuronale détecté de chaque électrode dans un complot tramé selon les procédures standard 3 (figure 1F).
- Déterminer et d'afficher l'activité totale du réseau pour chaque tranche en additionnant le nombre d'événements dans les canaux selon sein d'une fenêtre glissante de 10 ms, décalés par pas de 1 ms (Figure 1G et voir Tscherter et al. 3).
- Détecter dans chaque tranche éclats individuels (grappes d'activité qui apparaissent sur plusieurs électrodes). Donc, Fixer un seuil minimal d'activité de pointe dans l'activité totale du réseau correspondant et de définir chaque début et à la fin éclater éclater. Par exemple, un seuil approprié est de 25% de l'amplitude moyenne de la salve et un début d'éclatement peut être définie par le premier événement dans une fenêtre de temps d'au moins 5 ms, un fin éclater en étant le dernier événement dans une fenêtre de temps d'au moins 25 ms (voir Heidemann et al. 10).
- Pour quantifier la régénération fonctionnelle calculer le pourcentage de salves synchronisées entre les deux tranches. Pour ce faire, calculer le temps de latence entre une salve dans une tranche et la rafale suivante dans l'autre tranche.
Remarque: une paire de salve est appelée "synchronisé" quand le temps d'attente est inférieure à la longueur moyenne de salves. Surtout dans les co-cultures avec beaucoup d'activité, il existe la possibilité que les deux parties lancent hasard une rafale dans la fenêtre de latence choisi. Ce fait doit être pris en compte lors de la quantification du pourcentage de synchronized rafales. Pour une description détaillée des calculs voir Heidemann et al. 10.
8. Fixation des cultures et immunohistochimie
- Pour toutes les étapes qui comprennent le lavage ou l'incubation assurez-vous de mettre les cultures sur une table basculante pour assurer la diffusion adéquate de la solution à travers le tissu.
- Directement après la session d'enregistrement est terminé prendre l'ensemble MEA / culture de la configuration, le mettre dans une boîte de Pétri (35 mm x 10 mm) et ajouter environ 2 ml de solution extracellulaire.
- Pour séparer les tranches à partir des couches de cellules environnantes qui se sont formés pendant le temps in vitro, prendre une pointe de pipette de 10 pi et encercler les tranches. Faites attention à ne pas endommager les cultures. Il est possible d'omettre cette étape, mais intégrer plus tard est plus facile quand il est effectué.
- Utiliser une aiguille de seringue non métallique mince (voir liste matériaux) en combinaison avec une seringue de 1 ml remplie de soluti extracellulaireà souffler doucement la culture au large de la MEA.
- Retirer la pointe d'une pipette Pasteur et adapter la poire en caoutchouc sur l'extrémité effilées. Utilisez l'extrémité arrière de transférer la culture dans fixateur (4% de paraformaldehyde avec du tampon phosphate salin (PBS, 0,1 M)). Ne pas utiliser la pointe standard de la pipette Pasteur pour le transfert, car il est trop petit et les cultures serait plié et probablement endommagé. Correction pour les 1 - 2 h à 4 ° C. Rincer la MEA avec de l'eau distillée et enlever les résidus de tissu avec les doigts, mais ne pas rayer avec l'ongle. AME de magasins dans de l'eau distillée à 4 ° C
- Laver les cultures 3x dans du PBS pendant au moins 10 minutes à chaque fois. Conserver dans PBS à 4 ° C ou commencer directement avec la procédure de coloration.
- Incuber les cultures pendant au moins 90 min dans une solution de blocage (sérum de chèvre à 5%, 1% d'albumine de sérum bovin, 0,3% de détergent dans du PBS).
- Ajouter le premier anticorps dilué dans une solution de blocage et incuber pendant 3 nuits à 4 ° C.
- Laver 3x dans PBS pendant au lest à 30 minutes chacun.
- Ajouter le deuxième anticorps dilué dans du PBS pendant 2 heures à température ambiante.
- Laver 3x dans du PBS pendant au moins 30 min chacun.
- Transférer les tranches avec une pipette Pasteur avec embout retiré sur un porte-objet. Enlever l'excès de PBS et l'enrober avec un milieu de montage.
Representative Results
Pour étudier le potentiel de récupération fonctionnelle des co-cultures dérivées de la moelle épinière d'embryons E14 de rat, des lésions ont été effectuées dans une fenêtre de temps de 8 à 28 DIV. 2 à 3 semaines plus tard, l'activité neuronale spontanée a été enregistrée avec les AME (Figure 1 C & D). Les potentiels d'action extracellulaire enregistrés ont été identifiés hors ligne pour chaque électrode individuelle (figure 1E). De ces données raster parcelles ont été générés (Figure 1F), suivie par l'activité réseau parcelles de visualiser l'activité totale séparément par côté (figure 1G). Dans chaque tranche l'activité spontanée est généralement organisé en rafales. Si les tranches sont reliés fonctionnellement, ces salves peuvent se propager d'une tranche à l'autre. Par conséquent, le montant de salves synchronisées entre les deux tranches a été calculé pour mesurer quantitativement la régénération fonctionnelle. Pour une description détaillée de la façon dont l'int de transformationo les différentes parcelles est effectuée et comment la formule de calcul du pourcentage de l'activité synchronisée a été dérivé, s'il vous plaît voir Heidemann et al. 10.
Dans toutes les expériences, l'activité a été enregistrée dans des conditions standard. Dans une deuxième étape, l'inhibition synaptique a été bloquée par addition de strychnine (1 uM) et gabazine (10 uM) à la solution de bain extracellulaire. Cela conduit généralement à une désinhibition un modèle d'activité plus régulier avec rafales prolongées et des intervalles de salve, ce qui facilite la définition de salves et par conséquent la détermination de la synchronisation de salve entre les tranches.
Cultures lésés à un jeune âge (7 - 9 DIV) affichent une grande quantité de l'activité synchronisée 2-3 semaines après la lésion alors que les cultures lésé à des stades ultérieurs (> 19 DIV) a montré une nette réduction de la capacité de régénérer (Figure 2 A - F). Ces résultats indiquent que la capacité de régénérationdes connexions fonctionnelles dans les cultures cordon de tranche épinière diminue d'un niveau élevé, représentant l'état embryonnaire in vivo, à un niveau faible, représentant l'état encore développés in vivo, dans les trois semaines dans la culture.
Quels types de connexions sont effectivement impliqués dans salve de synchronisation entre les deux tranches? Outre les connexions propriospinaux, les fibres pourraient également découler de motoneurones ou neurones du ganglion de la racine dorsale. Il a été montré précédemment que les neurones ganglionnaires de la racine dorsale de ne sont pas pertinents pour la connectivité fonctionnelle entre la moelle épinière 10 tranches. Cependant, l'implication des motoneurones restait une possibilité. Depuis motoneurones sont connus pour former des connexions des neurones cholinergiques de la moelle épinière par l'intermédiaire des récepteurs nicotiniques 13, l'activité de la moelle épinière co-cultures a été enregistré à huit DIV, alors que les cultures montrent une activité très 10 synchronisés, et l'antagoniste nicotinique Mecamylamine (MEC, 100 pM) a été ajouté à la solution de bain extracellulaire. Une participation des motoneurones dans la liaison entre les deux tranches se traduirait par une diminution du pourcentage de l'activité synchronisée. Cependant, ce ne fut pas le cas (MEC: 91,0 ± 4,5%, n = 7; contrôle: 93,6 ± 4,6%, n = 7, p> 0,05, Wilcoxon correspondait test de paires). Ces résultats suggèrent que les synapses cholinergiques ne contribuent pas à la liaison fonctionnelle entre les tranches. Toutefois, étant donné ont également été montré motoneurones pour libérer du glutamate au niveau des synapses dans le SNC 11, 15, ces expériences ne comprennent pas entièrement leur engagement.
Pour identifier les motoneurones colorations immunohistochimiques contre le neurofilament non phosphorylée H avec SMI-32 ont été réalisées. Ils ont révélé plusieurs corps cellulaires marqués grandes typiques pour les motoneurones, répartis sur la tranches (figure 3A). L'anticorps SMI-32 a été rapportée pour marquer les corps cellulaires des motoneurons 12 et cette constatation vaut également pour les cultures utilisées 13. En outre, des colorations de corps cellulaires neuronaux en général, par exemple, contre les b-III-tubuline ou NeuN ainsi que les corps cellulaires gliales, par exemple., Les astrocytes avec l'anticorps GFAP sont en ligne avec d'autres rapports et correspondent aux descriptions morphologiques de ces types de cellules ( Figure 3 B - D). Néanmoins, l'étiquetage des axones avec l'anticorps SMI-32 est préoccupante (figure 3E). Contre toute attente, un vaste réseau de fibres apparaît lors de l'utilisation de cet anticorps et il ressemble à la coloration SMI-31 que les étiquettes phosphorylée neurofilament H (figure 3F). Une interprétation de ce résultat pourrait être que la régulation du développement des neurofilaments phosphorylation / déphosphorylation est pas aussi serré dans les cultures utilisées par rapport à la situation in vivo. Un événement mixte de neurofilaments phosphorylés et non phosphorylés dans le même axone pourrait explain cette constatation. Une autre possibilité est que les SMI-32 axones marqués proviennent de neurones de projection. Tsang et ses collègues 16 ont montré que, par exemple, des colonnes et des colonnes de cellules intermédiolatérale les neurones de Clark sont colorées par SMI-32 en plus motoneurones. Prononcés prolifération des neurites de ces neurones pourrait également expliquer l'abondance de SMI-32 fibres positives.
Figure 1. affichage et d'analyse de l'activité spontanée. (A) Schéma d'un MEA. Les électrodes de platine recouvert sont représentés en noir, les fils rouge et transparentes dans la rainure dans le milieu de la MEA en jaune. (B) gros plan, le réseau d'électrodes situé au centre de la MEA. Les diagrammes sont aimablement fournies par le Dr M. Heuschkel. Image lumineuse sur le terrain d'une ancienne 8 DIV cultur (C)e. Les tranches ont augmenté et fondue le long des côtés se faisant face. La barre jaune représente la gorge electrode- et sans isolation de la MEA. Barre d'échelle = 400 um (D) Chronologie des expériences. Deux tranches de moelle épinière de rat E14 embryons sont placés à côté de l'autre sur AME. Au bout de quelques jours, les tranches et fusible se développent le long des côtés se faisant face. Dans un délai de 8 à 28 DIV, lésions complets seront effectués par l'intermédiaire du site de fusion. Deux à trois semaines plus tard, l'activité spontanée est enregistrée et les cultures sont fixées pour les colorations immunohistochimiques. (E) des traces d'activité spontanée de chaque électrode individuelle d'une culture vieille de 23 DIV. Pour une meilleure visualisation, que chaque seconde trace est illustré. Traces oranges représentent l'activité qui a été enregistrée à partir de la tranche sur le côté droit, des traces bleues sur le côté gauche. La plupart des salves sont synchronisés entre les deux. Les pointes de flèches à une explosion se produisant dans la tranche de gauche qui ne partiellement propagé vers la droite tranche. L'activité dans la bonne tranche cependant n'a pas atteint le seuil choisi d'au moins 25% de l'activité maximale de crête moyenne du côté en fonction et par conséquent, n'a pas été détecté comme une rafale. Grossissements sur la droite représentent la dernière paire de rafale synchronisée. (F) Raster parcelle de l'activité illustrée par (E). (G) parcelle de l'activité de réseau avec des éclats définies ci-dessous (barres de base) de l'activité illustrée en (E). Adapté de Heidemann et al., 10. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. synchronisé par rapport à l'activité non synchronisé. (A, B) des parcelles de trame de cultures lesioneD à un jeune âge (à 7-9 DIV), montrant l'activité synchronisée dans des conditions standard (A) et en vertu de la désinhibition (B). (C, D) des parcelles de trame de cultures lésés à un âge avancé (à> 19 DIV), montrant une activité non synchronisé dans des conditions standard (C) et sous la désinhibition (D). (E, F) Pourcentage moyen de l'activité synchronisée tracée pour chaque jour de la lésion individuelle enregistrée dans des conditions standard (E) et en vertu de la désinhibition (F). Les enregistrements ont été prises 2 - 3 semaines après le jour de la lésion. Adapté de Heidemann et al., 10. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. immunohistochimique caractérisation. (A) Coloration des corps cellulaires motoneurones avec SMI-32. (B) β-III étiquetage de la tubuline de corps cellulaires des neurones matures et leurs processus. (C) d'identification des astrocytes avec GFAP. (D) l'étiquetage des corps de cellules neuronales mature avec NeuN. (E) SMI-32 coloration de non-phosphorylée neurofilament H. (F) neurofilament phosphorylée H identifié par SMI-31. Adapté de Heidemann et al., 10. Notez que les deux, SMI-31 et SMI-32, un vaste réseau de fibres est visible dans les cultures. Bars AD = 20 um, H & F = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Discussion
Plusieurs éléments de la procédure présentée sont fondamentales pour la réalisation d'expériences précises et reproductibles. Toutes les étapes au cours de la préparation des solutions AEM, et la production des cultures de tranches sont effectuées dans des conditions stériles sous une hotte à flux laminaire. Les antibiotiques ne sont pas appliqués au milieu nutritif, car ils peuvent affecter l'activité spontanée 14. Pendant le revêtement de MEA, la partie la plus importante est de faire en sorte que la solution de gel de la matrice extracellulaire reste froid en tout temps. Décongeler au réfrigérateur et de garder sur la glace pendant toute la procédure pour assurer une température maximale proche de 0 ° C. Lors de la préparation de l'isolement rapide et tranches sectionnement, ainsi que de prêter attention à une basse température en utilisant la glace froid tampons de dissection augmente le pourcentage des cultures saines. De plus, le plasma / coagulation de la thrombine est l'une des étapes les plus critiques. Tout d'abord, assurez-vous que le plasma est correctement Mixed avec la thrombine. Deuxièmement, accorder une attention particulière à l'élimination autant de résidus que possible pour assurer une bonne fixation des tranches aux AME. Cette étape est extrêmement sensible au temps; si le délai est trop court, trop de mélange plasma / de la thrombine est retiré. Si le délai est trop long, la coagulation est déjà arrivé, augmentant le risque de retirer les tranches avec le résiduel plasma / thrombine.
Si les lésions mécaniques sont prévues, il est important d'utiliser AME avec une conception précise. La zone où la lésion est destiné doit être libre d'électrodes, fils et l'isolation. Sinon, le système électrique de la MEA vont être endommagé et, par conséquent, aucun enregistrement ne peut être effectué plus.
Une autre étape cruciale concerne la taille de la lésion. Il a été montré précédemment que la reconnexion deux jeunes tranches après lésion dure environ deux jours 10. Pour toutes les expériences, la règle de base a été utilisé que le chic de l'espaceen tranches après lésion ne doit pas être plus grand que la largeur de la rainure de la MEA (300 um). Une plus grande taille de la lésion peut entraîner un délai plus long pour la reconnexion ou, si la lésion est trop grand, aucune reconnexion du tout. Pour annoter, expériences antérieures ont révélé qu'une mise initiale de deux tranches plus loin que 1 mm donne un taux de connexion très faible.
Avant le début des enregistrements, un trajet de réglage d'au moins 10 min à la température ambiante, au lieu de 37 ° C de l'incubateur, et à la solution extracellulaire, à la place du milieu de nutrition est recommandée. Une observation attentive de la configuration de l'activité au cours de ces premières minutes assure que les données de mesure représentent le motif d'éclatement de la culture de manière appropriée après que l'enregistrement a commencé.
Pour la détection de l'activité, l'acquisition des données et le traitement ultérieur, le matériel fait maison (chambre d'enregistrement, les connexions aux amplificateurs et amplificateurs), les programmes en laboratoireVUE, C ++ et IgorPro sont utilisés. Configurations de MEA commerciales et d'autres logiciels sont adaptés aussi bien pour ces opérations. Ici, les signaux vus par les électrodes sont amplifiés 1001 fois, et ensuite numérisées à un débit de 6 kHz.
Le modèle présenté peut être un outil utile pour examiner les connexions propriospinaux parce in vivo, ils sont difficiles à étudier sans interférence de monter et descendre des faisceaux de fibres. La co-culture de deux tranches de la moelle épinière peut élégamment contourner ce problème. Les cultures fournissent un microenvironnement qui peuvent être étroitement contrôlée et facilement manipulé. D'autre part, l'entrée supraspinal et sensorielle est bien sûr absent. En outre, le procédé de la préparation de culture représente une situation de détérioration du système nerveux central. Les cellules gliales telles que les astrocytes et la microglie sont connus pour répondre à des lésions avec une prolifération accrue et, par conséquent, le tissu est dans une certaine mesure réorganisée. Relatif au mode présentél la formation d'une cicatrice gliale après avoir effectué des lésions mécaniques n'a pas été observée. Une explication pourrait être que les mécanismes d'adaptation des astrocytes ont déjà été déclenchés pendant le processus de préparation et que les lésions des cultures n'a pas abouti à une autre réponse. En outre, il n'y a aucune preuve de la participation des inhibiteurs associés de la myéline, par exemple., Nogo-A, dans le potentiel de régénération des cultures à faible lésés à un âge avancé. Cependant, il a été montré que le traitement avec l'inhibiteur de la phosphodiestérase 4 rolipram, en commençant directement après l'exécution de lésions à 23 DIV augmente la régénération fonctionnelle entre les 10 tranches. Ces résultats démontrent que la récupération fonctionnelle peut être augmentée dans les vieilles cultures. Sensiblement, lors du comptage du nombre d'axones qui traversent le site de la lésion, pas de différence entre les cultures lésés à un jeune âge et les cultures lésés à un âge avancé a été découvert. Ces résultats suggèrent que le manque de régénération axonale est pas la raison majeure fou la perte de la récupération après lésions tardives dans la culture et donc souligner la nécessité d'un modèle qui permet l'analyse fonctionnelle de la régénération. Formation synaptique et la plasticité synaptique pourraient jouer un rôle majeur dans le processus de récupération 10. Ces mécanismes ont gagné beaucoup d'attention au cours des dernières années et il est aujourd'hui largement admis que ils ont un impact majeur sur le résultat après une blessure de la moelle épinière. Par conséquent, un modèle qui offre des conditions stables pour enquêter sur ces processus dans l'isolement et dans les moindres détails peut certainement aider à obtenir un aperçu sur la régénération fonctionnelle dans la moelle épinière.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Planar multielectrode array | Qwane Biosciences | custom-made according to the design of our lab | |
| Nutrient medium | For 100 ml | ||
| Dulbeccos modified Eagle's medium | Gibco | 31966-021 | 80 ml |
| Horse serum | Gibco | 26050-070 | 10 ml |
| distilled, sterile water | 10 ml | ||
| Nerve growth factor-7S [5 ng/ml] | Sigma-Aldrich | N0513 | 200 µl |
| reconstituted in wash solution with 1% BSA | |||
| Coating solution | |||
| Extracellular matrix gel | BD Biosciences | 356230 | Must stay cold at all times; dilute 1:50 with medium optimized for prenatal and embryonic neurons |
| medium optimized for prenatal and embryonic neurons | Gibco | 21103-049 | |
| Wash solution | [mg/L] | ||
| MgCl2-6H2O | 100 | ||
| MgSO4-7H2O | 100 | ||
| KCl | 400 | ||
| KH2PO4 | 60 | ||
| NaCl | 8,000 | ||
| Na2HPO4 anhydrous | 48 | ||
| D-Glucose (Dextrose) | 1,000 | ||
| According to the protocol on http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html | |||
| Extracellular solution (pH 7.4) | [mM] | ||
| NaCl | 145 | ||
| KCl | 4 | ||
| MgCl2 | 1 | ||
| CaCl2 | 2 | ||
| HEPES | 5 | ||
| Na-pyruvate | 2 | ||
| Glucose | 5 | ||
| Blocking Solution | |||
| Detergent: Triton X-100 | 0.3%, harmful if swallowed | ||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | 1% |
| Goat serum | Gibco | 16210-064 | 5% |
| Chicken Plasma | Sigma-Aldrich | P2366 | Lyophilized, reconstitute with wash solution |
| Gabazine | Sigma-Aldrich | SR-95531 | |
| Mecamylamine hydrochloride | Tocris | 2843 | toxic if swallowed |
| Micropipette | World Precision Instruments, Inc. | MF28G-5 | |
| Paraformaldehyde | harmful, 4% | ||
| SMI-31 | Covance | SMI-31P | |
| SMI-32 | Covance | SMI-32R-500 | |
| Strychnine | Sigma-Aldrich | S0532 | toxic |
| Thrombin | Merck Millipore | 1123740001 | irritant, sensitizing, reconstitute with wash solution |
| Tissue culture flat tube 10 (= roller tube) | Techno Plastic Products AG | 91243 | |
References
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