Summary

באמצעות ניתוח של Confocal<em> Laevis Xenopus</em> לחקירת מאפננים של עירובים מורפוגן Wnt וששש

Published: December 14, 2015
doi:

Summary

כתב היד כאן מספקת מערכת פשוטה של שיטות לניתוח ההפרשה ודיפוזיה של ligands מתויג fluorescently ב Xenopus. זה מספק הקשר לבדיקת היכולת של חלבונים אחרים לשנות הפצת יגנד ומאפשר ניסויים שעשויות לתת תובנה מנגנוני ויסות הדרגתיים מורפוגן.

Abstract

פרוטוקול זה מתאר שיטה לדמיין ligands מופץ על פני שדה של תאים. קלות לבטא חלבונים אקסוגניים, יחד עם הגודל הגדול של תאיהם בעוברים מוקדמים, לעשות Xenopus laevis מודל שימושי המאפשר הדמיה ligands מתויג GFP. mRNAs סינטטי מתורגמים ביעילות לאחר הזרקה לעוברי צפרדעי שלב מוקדם, ויכולים להיות ממוקדת זריקות לתא בודד. בשילוב עם נותב שושלת כגון RFP קרום קשור, התא המוזרק (וצאצאיו) שמייצרים את חלבון ביטוי יתר יכולים בקלות להיות אחריו. פרוטוקול זה מתאר שיטה לייצור מתויגת fluorescently ligands Wnt ושש מmRNA המוזרק. השיטות כרוכות במילנתיחת CRO של explants ectodermal (כובעי בעלי חיים) והניתוח של דיפוזיה יגנד בדוגמאות רבות. באמצעות ההדמיה confocal, ניתן לקבל מידע על הפרשה ליגנד ודיפוזיה מעל שדה של תאים. ניתוחים סטטיסטיים של תמונות confocal לספק נתונים כמותיים על הצורה הדרגתיים ליגנד. שיטות אלה עשויות להיות שימושיות לחוקרים שרוצים לבדוק את ההשפעות של גורמים שעשויים להסדיר את הצורה הדרגתיים מורפוגן.

Introduction

במהלך התפתחות עוברית מוקדמת, תאים בהדרגה מחויבים לעקוב אחר שושלות ספציפיות של בידול: זה אומר קבוצה של totipotent (או pluripotent) התאים הפכו מוגבל בהדרגה להקמת אוכלוסיות של תאי אב נחושים לגרום לסוג תא אחד. איתות תאי תאים היא מרכזית להסדרת מפרט שושלת במהלך התפתחות עוברית. מניפולציה של אותות אלה תידרש לכוון תאי גזע לגורל מסוים כדי לתמוך טיפולים רפואיים חדשניים.

מספר קטן יחסית של מסלולי איתות הם חזרו במהלך פיתוח, כולל מסלולים להגיב לsuperfamily TGF (nodals וBMPs) 1-2, 3 FGFs, 4 Wnts, וקיפודים 5. חלבונים מופרשים אלה נקשרים הקולטנים הנוכחיים על קרום התא כדי להפעיל הולכים אותות ובכך לשנות את ביטוי הגנים ו / או התנהגות תא. הרגולציה ההדוקה של תא סימןalling חיוני למפרט שושלת תא והתפתחות תקינה. בעוד הצטלבות בין מסלולים אלה היא חשובה בקביעת גורל תא, יגנד אחד יכול עצמו לעורר תגובה שונה בריכוזים שונים. הדרגתיים מורפוגן תוארו לפני למעלה מ -100 שנים כתאוריה המסבירה כיצד סוגים שונים של תאים יכולים לנבוע מתחום התאים 6. איתות מולקולות המיוצרות על ידי קבוצה אחת של תאים עשויה לפזר על פני טווח מסוים, ירידה בריכוז במרחק גדול יותר מהמקור. תאים שנחשפו לאות יגיבו לריכוז המקומי במעמדם בתחום תאים, עם תאים בעמדות שונות מגיבים באופן שונה לרמות של האות שונות. ראיות לקיומו של morphogens מגיעה ממחקרים של העובר המוקדם תסיסנית 7 והדיסק האגף 8, כמו גם את איבר חוליות 9 וצינור עצבי 10.

שיטות יש צורך בvestigate איך מורפוגן הדרגתיים הוקמו ולזהות מולקולות אחרות חשובות בויסות הדרגתיים אלה. ניסויים אלגנטיים באמצעות אימונוהיסטוכימיה לדמיין חלבונים אנדוגניים in vivo בהקשר של רקע גנטי שונה שימשו לחקור הדרגתיים מורפוגן 11-12. עם זאת, נוגדנים טובים ומוטציות ספציפיות לא תמיד זמינים, כך אנו מתארים כאן פרוטוקול באמצעות ביטוי יתר של ligands הניאון ב Xenopus, כדי לספק אלטרנטיבה, שיטה פשוטה לנתח כיצד מוצרי גן אקסוגני יכולים להשפיע הפצה של ligands על פני שדה של תאים. Xenopus laevis מספק מערכת מצוינת לבצע סוגים אלה של ניסויים כעוברים שלהם לפתח חיצוני ולכן הם נגישים בשלבים המוקדמים. גודלם הגדול (1-1.5mm קוטר) מפשט microinjection ומניפולציה כירורגית ועל ידי blastula שלבי התאים קלים לתמונה כפי שהם עדיין גדולים יחסית (כ -2081; מ 'רוחב). מחקרי ביטוי יתר בצפרדעים הם פשוט לעשות: mRNA מוזרק לתוך העובר המוקדם יכול להיות ממוקד לתאים מסוימים ומתורגם ביעילות.

מבני Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP מתויגים fluorescently היו שנוצרו באמצעות pCS2 Wnt8a-HA 13, pCS2 Wnt11b-HA 14 וeGFP. פפטיד HA חשוב לכלול, לא רק כדי לספק תג מולקולרי נוסף, אלא גם משום שהוא חשב לפעול כspacer הפרדת חלבוני Wnt וeGFP מאפשרים שני מוצרי הגן לתפקד. המבנה המשמש להדמיה של שש שימש בעבר כדי ליצור עכבר מהונדס מבטא חלבון היתוך ששש-eGFP 15; זה סופק באדיבות על ידי אנדי מקמהון. חשוב לציין, תג ה- GFP לכל המבנים הוא משובט 3 'לאות הרצף כזה שנשמר לאחר העיבוד. כמו כן הוא חיוני על מנת להבטיח כי החלבון הסופי כולל רצפים הנדרשים לשינויים, כגון addition של שומנים כמו במקרה שלשישה וWnt ligands.The cDNAs היו subcloned לתוך וקטור pCS2 + ביטוי אשר מותאם במיוחד עבור prodution של mRNA הסינתטי; זה כולל אמרגן SP6 ואות polyadenylation (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors).

העבודה המתוארת כאן מספקת פרוטוקול פשוט להשוואת ההפרשה ודיפוזיה של fluorescently מתויג Wnt ושישה מתויגים ligands. על ידי הזרקת כמויות מוגדרות של mRNA הסינתטי, הפרוטוקול עוקף כל בעיות הקשורות לביטוי משתנה מוקטורים שונים באמצעות יזמים שונים. לאחרונה שיטות אלה יושמו כדי לחקור את ההשפעות של endosulfatase סולפט heparan Sulf1 שבשש-eGFP וWnt8a / הפרשת Wnt11b-HA-eGFP ודיפוזיה בXenopus 16-17.

Protocol

הצהרת אתיקה: ניסויים בבעלי חיים נעשו תחת רישיון משרד בריטניה בית לחבר הפרלמנט האירופי והניסויים שבוצעו אושרו על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת יורק בעמידה ביגיע (בעלי החיים המחקר: הדיווח של ניסויי in vivo) הנחיות. (Https://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines). <p class="jove_title" style=";text-align:right…

Representative Results

ניתוח confocal של explants כובע בעלי החיים לבטא חלבונים מתויגים fluorescently מספק מערכת יעילה המאפשר הדמיה הפצת יגנד תחת תנאי ניסוי שונים. בדוגמא אחת, ההפצה של ה- GFP מתויגת שישה מוצגים (איור 1). בשלב 2-התא, עוברי צפרדעים מוזרקים לשני התאים עם או עם mRNA שליטה או עם mRNA הקידו?…

Discussion

חלק חיוני של פרוטוקול זה הוא יצירת ligands הפעיל ביולוגי שבדרך כלל מעובד, מופרש, ומסוגל לעורר תגובה בתא המקבל, למרות שיש מחצית ניאון המצורפת. זה קריטי כדי לקבוע כי מוצר הגן fluorescently- מתויג הוא פעיל ביולוגי באמצעות assay מתאים. לשש-GFP, היכולת להפעיל את הביטוי של ptc1 אושרה

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה על ידי BBSRC להעניק לחבר הפרלמנט האירופי (BB / H010297 / 1), מלגת לימודי BBSRC מכסה לSAR, ומלגת לימודי MRC ל SWF.

Materials

Agarose Melford MB 1200
Ammonium acetate Ambion From Megascript SP6 Kit AM 1330
Bicarbonate VWR International RC-091
Calcium nitrate Sigma C13961
Cap analog (m7G(5')) Applied Biosystems AM 8050
Chloroform Sigma C 2432
 L-Cysteine hydrochloride monohydrate Sigma C7880
dNTPs Invitrogen 18427-013
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma O3690
Ethanol VWR International 20821.33
Ficoll 400 Sigma F 4375
Fiji image J software N/A N/A Free download http://fiji.sc/Fiji
Gentamycin Melford G 0124
Glacial acetic acid Fisher Scientific A/0400/PB17
Glass cover slips, No.1.5  Scientific Laboratory Supplies 22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030 
Glass needle puller Narishige Narishige PC -10
Glass pull needles Drummond Scientific 3-000-203-G/X
Human chronic gonadotropin (HCG) Intervet
Isopropanol Fisher Scientific P/7500/PB17
Lithium chloride (LiCl) Sigma L-7026
LSM710 and Zen software (2008-2010) Carl Zeiss
Matlab software Mathworks http://uk.mathworks.com/
Molecular grade water  Fisher Scientific BP 2819-10
Nail varnish  Boots Bar code 3600530 373048
Spectrophotometer Lab.tech International ND-1000 / ND8000
Petri dish (55mm) VWR International 391-0865
Phenol-chloroform Sigma P3803
Photoshop software Adobe N/A http://www.photoshop.com/products
High fidelity DNA polymerase and buffers  Biolabs M0530S  Buffer – M0531S
Potassium chloride (KCl) Fisher Scientific P/4280/53
PVC insulation tape Onecall SH5006MPK
Gel extraction kit  Qiagen S28704
Restriction enzymes buffers Roche SuRE/CUT Buffer Set 11082 035 001
RNAse-free DNAse Promega ME10A
Steel back single edge blades Personna 66-0403-0000
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific 27810.364
SP6 transcription kit Ambion AM1330
Glass slides Thermo Fisher SHE 2505
Tris base Invitrogen 15504-020
Tungsten needles N/A N/A homemade
Zen lite software Carl Zeiss N/A Free download  http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html

References

  1. Shen, M. M. Nodal signaling: developmental roles and regulation. Development. 134 (6), 1023-1034 (2007).
  2. Shimmi, O., Newfeld, S. J. New insights into extracellular and post-translational regulation of TGF-beta family signalling pathways. J Biochem. 154 (1), 11-19 (2013).
  3. Pownall, M. E., Isaacs, H. V. . FGF Signalling in Vertebrate Development. 1, 1-75 (2010).
  4. Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell. 127 (3), 469-480 (2006).
  5. Ingham, P. W., McMahon, A. P. Hedgehog signaling in animal development: paradigms and principles. Genes and Development. 15 (23), 3059-3087 (2001).
  6. Wolpert, L. One hundred years of positional information. Trends in Genetics. 12 (9), 359-3564 (1996).
  7. Rushlow, C. A., Shvartsman, S. Y. Temporal dynamics, spatial range, and transcriptional interpretation of the Dorsal morphogen gradient. Current Opinion in Genetics and Development. 22 (6), 542-546 (2012).
  8. Erickson, J. L. Formation and maintenance of morphogen gradients: an essential role for the endomembrane system in Drosophila melanogaster wing development. Fly (Austin). 5 (3), 266-271 (2011).
  9. Towers, M., Wolpert, L., Tickle, C. Gradients of signalling in the developing limb. Current Opinions in Cell Biology. 24 (2), 181-187 (2012).
  10. Dessaud, E., McMahon, A. P., Briscoe, J. Pattern formation in the vertebrate neural tube: a sonic hedgehog morphogen-regulated transcriptional network. Development. 135 (15), 2489-2503 (2008).
  11. Briscoe, J., et al. Homeobox gene Nkx2.2 and specification of neuronal identity by graded Sonic hedgehog signalling. Nature. 398 (6728), 622-627 (1999).
  12. Ribes, V., et al. Distinct Sonic Hedgehog signaling dynamics specify floor plate and ventral neuronal progenitors in the vertebrate neural tube. Genes and Development. 24 (11), 1186-1200 (2010).
  13. Freeman, S. D., Moore, W. M., Guiral, E. C., Holme, A., Turnbull, J. E., Pownall, M. E. Extracellular regulation of developmental cell signaling by XtSulf1. Developmental Biology. 320 (2), 436-445 (2008).
  14. Tao, Q., et al. Maternal wnt11 activates the canonical wnt signaling pathway required for axis formation in Xenopus embryos. Cell. 120 (6), 857-871 (2005).
  15. Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning. Development. 135 (6), 1097-1106 (2008).
  16. Ramsbottom, S. A., Maguire, R. J., Fellgett, S. W., Pownall, M. E. Sulf1 influences the Shh morphogen gradient during the dorsal ventral patterning of the neural tube in Xenopus tropicalis. Developmental Biology. 391 (2), 207-218 (2014).
  17. Fellgett, S. W., Maguire, R. J., Pownall, M. E. Sulf1 has ligand dependent effects on canonical and non-canonical WNT signalling. Journal of Cell Science. 128 (7), 1408-1421 (2015).
  18. Dytham, C. . Choosing and using statistics : A biologist’s guide. , (2005).
  19. Fay, M. P., Proschan, M. A. Wilcoxon-Mann-Whitney or t-test? On assumptions for hypothesis tests and multiple interpretations of decision rules. Statistical Surveys. 4, 1-39 (2010).
  20. Christian, J. L., McMahon, J. A., McMahon, A. P., Moon, R. T. Xwnt-8, a Xenopus Wnt-1 /int-1-related gene responsive to mesoderm-inducing growth factors, may play a role in ventral mesodermal patterning during embryogenesis. Development. 111 (4), 1045-1055 (1991).
  21. Du, S. J., Purcell, S. M., Christian, J. L., McGrew, L. L., Moon, R. T. Identification of distinct classes and functional domains of Wnts through expression of wild-type and chimeric proteins in Xenopus embryos. Molecular and Cellular Biology. 15 (5), 2625-2634 (1995).
  22. Tada, M., Smith, J. C. Xwnt11 is a target of Xenopus Brachyury: regulation of gastrulation movements via Dishevelled, but not through the canonical Wnt pathway. Development. 127 (10), 2227-2238 (2000).
  23. Williams, P. H., Hagemann, A., Gonzalez-Gaitan, M., Smith, J. C. Visualizing long-range movement of the morphogen Xnr2 in the Xenopus embryo. Current Biology. 14 (21), 1916-1923 (2004).
  24. McDowell, N., Zorn, A. M., Crease, D. J., Gurdon, J. B. Activin has direct long-range signalling activity and can form a concentration gradient by diffusion. Current Biology. 7 (9), 671-681 (1997).
  25. Chen, Y., Schier, A. F. The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen. Nature. 411 (6837), 607-610 (2001).
  26. Miller, J. R., Rowning, B. A., Larabell, C. A., Yang-Snyder, J. A., Bates, R. L., Moon, R. T. Establishment of the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos coincides with the dorsal enrichment of dishevelled that is dependent on cortical rotation. Journal of Cell Biology. 146 (2), 427-437 (1999).
  27. Schohl, A., Fagotto, F. B. e. t. a. -. c. a. t. e. n. i. n. MAPK and Smad signaling during early Xenopus development. Development. 129 (1), 37-52 (2002).
  28. Muller, P., et al. Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system. Science. 336, 721-724 (2012).
  29. Yu, S. R., Burkhardt, M., Nowak, M., Ries, J., Petrasek, Z., Scholpp, S., Schwille, P., Brand, M. Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules. Nature. 461, 533-536 (2009).
  30. Janda, C. Y., Waghray , D., Levin, A. M., Thomas, C., Garcia, K. C. Structural basis of Wnt recognition by Frizzled. Science. 337, 59-64 (2012).
  31. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , (2010).

Play Video

Cite This Article
Fellgett, S. W., Ramsbottom, S. A., Maguire, R. J., Cross, S., O’Toole, P., Pownall, M. E. Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients. J. Vis. Exp. (106), e53162, doi:10.3791/53162 (2015).

View Video