Summary

Utilizzando Analisi confocale di<em> Xenopus laevis</em> Per Indagare modulatori di Wnt e Shh morphogen gradienti

Published: December 14, 2015
doi:

Summary

Il manoscritto qui fornisce un semplice insieme di metodi per analizzare la secrezione e la diffusione di fluorescenza ligandi marcati nel Xenopus. Ciò fornisce un contesto per valutare la capacità di altre proteine ​​di modificare la distribuzione ligando e permettendo esperimenti che possono dare comprensione dei meccanismi che regolano gradienti morphogen.

Abstract

Questo protocollo descrive un metodo per visualizzare ligandi distribuiti attraverso un campo di cellule. La facilità di esprimere proteine ​​esogene, insieme con le grandi dimensioni delle loro cellule in embrioni precoci, fare Xenopus laevis un modello utile per la visualizzazione di ligandi GFP-tag. MRNA sintetici sono efficacemente tradotte dopo l'iniezione in fase iniziale di Xenopus embrioni, e le iniezioni possono essere mirati a una singola cella. Se combinato con un tracciante lignaggio come membrana legato RFP, la cella iniettato (ei suoi discendenti) che stanno producendo la proteina overexpressed possono facilmente essere seguite. Questo protocollo descrive un metodo per la produzione di fluorescenza etichettato Wnt e Shh ligandi da iniettare mRNA. I metodi coinvolgono la micro dissezione di espianti ectodermici (tappi di animali) e l'analisi del ligando diffusione in più campioni. Utilizzando confocale, informazioni sulla secrezione ligando e diffusione su un campo di cellule può essere ottenuta. Le analisi statistiche delle immagini confocale forniscono dati quantitativi sulla forma di gradienti ligando. Questi metodi possono essere utili per i ricercatori che vogliono testare gli effetti dei fattori che possono regolare la forma di gradienti morphogen.

Introduction

Durante lo sviluppo embrionale precoce, le cellule sono progressivamente impegnati a seguire linee specifiche di differenziazione: questo significa un gruppo di totipotente (o pluripotenti) cellule diventano gradualmente limitarsi a verificare popolazioni di cellule progenitrici decisi a dare origine a un tipo di cellula. Segnalazione cellula-cellula è centrale per la regolamentazione specifica stirpe durante lo sviluppo embrionale. La manipolazione di questi segnali dovrà dirigere le cellule staminali verso particolari sorti per sostenere cure mediche innovative.

Un numero relativamente piccolo di vie di segnalazione sono ribadito durante lo sviluppo, tra cui percorsi di rispondere alla superfamiglia TGF (nodals e BMP) 1-2, FGFs 3, 4 Wnt, e Hedgehogs 5. Queste proteine ​​secrete legano recettori presenti sulla membrana cellulare per attivare trasduzione del segnale modificando così l'espressione genica e / o il comportamento cellulare. La stretta regolazione di segno cellulareAlling è essenziale per la specifica linea cellulare e lo sviluppo normale. Mentre il cross-talk tra questi percorsi è importante per determinare il destino delle cellule, un singolo ligando può sé suscitare risposte diverse a diverse concentrazioni. Gradienti morfogeno sono stati descritti più di 100 anni fa come una teoria per spiegare come i diversi tipi di cellule possono derivare da un campo di celle 6. Segnalazione molecole prodotte da un gruppo di cellule si diffonda in un determinato intervallo, diminuendo in concentrazione con una maggiore distanza dalla sorgente. Cellule esposte al segnale risponderà alla concentrazione locale nella loro posizione nel campo delle celle, con le cellule nelle posizioni distinte risposta diverso a diversi livelli di segnale. La prova dell'esistenza di morphogens deriva da studi dei primi Drosophila embrione 7 e il disco dell'ala 8, così come l'arto vertebrato 9 e 10 del tubo neurale.

I metodi sono necessari alvestigate come gradienti morfogeno sono stabilite e di individuare altre molecole importanti nella regolazione questi gradienti. Eleganti esperimenti che utilizzano immunoistochimica di visualizzare le proteine ​​endogene in vivo nel contesto di differenti background genetici sono stati utilizzati per indagare gradienti morphogen 11-12. Tuttavia, i buoni anticorpi e mutanti specifici non sono sempre disponibili, così abbiamo descritto qui un protocollo con sovraespressione di ligandi fluorescenti Xenopus, per fornire un'alternativa, metodo semplice per analizzare come i prodotti genici esogeni possono influenzare la distribuzione di ligandi attraverso un campo di celle. Xenopus laevis fornisce un ottimo sistema di intraprendere questo tipo di esperimenti come i loro embrioni si sviluppano esternamente in modo che siano accessibili nelle prime fasi. Loro grandi dimensioni (1-1.5mm di diametro) semplifica microiniezione e manipolazione chirurgica e blastula stadi cellule sono facili da immagine in quanto sono ancora relativamente grande (circa 2081; m di diametro). Studi iperespressione di Xenopus sono semplici da fare: mRNA iniettate nel embrione precoce possono essere mirati a particolari cellule ed è efficace tradotti.

I costrutti Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP fluorescente con tag sono stati generati utilizzando pCS2 Wnt8a-HA 13, pCS2 Wnt11b-HA 14 e eGFP. Il peptide HA è importante includere non solo per fornire un ulteriore indicatore molecolare, ma anche perché è pensato per fungere da distanziatore che separa le proteine ​​Wnt e eGFP permettendo entrambi i prodotti genici di funzionare. Il costrutto utilizzato per la visualizzazione di Shh è stato precedentemente utilizzato per generare un topo transgenico che esprime una proteina di fusione shh-eGFP 15; questo è stato gentilmente fornito da Andy McMahon. È importante sottolineare che il tag GFP per tutti i costrutti è clonato 3 'alla sequenza del segnale in modo tale che viene mantenuta dopo l'elaborazione. È anche essenziale per garantire che la proteina finale comprende sequenze necessarie modifiche, come la addition di lipidi, come è il caso di Shh e Wnt ligands.The cDNAs stati subclonato nel vettore pCS2 + di espressione che è ottimizzato per il prodution di mRNA sintetico; esso include un promotore SP6 e il segnale di poliadenilazione (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors).

Il lavoro qui descritto fornisce un protocollo semplice per confrontare la secrezione e la diffusione di fluorescente tag Wnt e Shh contrassegnati leganti. Iniettando quantità definite di mRNA sintetico, il protocollo circumnaviga eventuali problemi connessi con l'espressione variabile da vettori diversi utilizzando diversi promotori. Questi metodi sono stati recentemente applicato per studiare gli effetti del solfato endosulfatase eparan Sulf1 su Shh-eGFP e Wnt8a / secrezione Wnt11b-HA-eGFP e diffusione in Xenopus 16-17.

Protocol

Etica dichiarazione: Gli esperimenti sugli animali sono stati fatti sotto una licenza ufficio Interni britannico all'on e gli esperimenti effettuati è stato approvato dal l'Università di York comitato etico nel rispetto del ARRIVARE (Animale di ricerca: Segnalazione di esperimenti in vivo) le linee guida. (https://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines). 1. Strategia per la generazione di fluorescenza Tagged Ligandi Qui di seguito è un protocollo pe…

Representative Results

Analisi confocale di espianti protezione animale che esprimono proteine ​​fluorescenti tag fornisce un sistema efficace per la visualizzazione di distribuzione ligando in diverse condizioni sperimentali. In un esempio, la distribuzione di GFP etichettato Shh è mostrato (Figura 1). Nella fase 2 cellule, embrioni di Xenopus vengono iniettate in entrambe le cellule con una o con mRNA di controllo o con mRNA codificante per Sulf1, un enzima che modifica superficie cellulare eparan solfato e in…

Discussion

Una parte essenziale di questo protocollo genera ligandi biologicamente attivi che vengono normalmente trattati, secreti, e in grado di suscitare una risposta nella cellula ricevente, pur avendo una porzione fluorescente allegata. E 'fondamentale per stabilire che il prodotto del gene fluorescente-tag è biologicamente attivo utilizzando un dosaggio adeguato. Per Shh-GFP, la capacità di attivare l'espressione di PTC1 stato confermato 16. Wnt8a ha notevolmente potente capacità di indurre un …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato finanziato da un BBSRC concedere a parlamentare europeo (BB / H010297 / 1), una quota borsa di studio BBSRC a SAR, e una borsa di studio MRC in SWF.

Materials

Agarose Melford MB 1200
Ammonium acetate Ambion From Megascript SP6 Kit AM 1330
Bicarbonate VWR International RC-091
Calcium nitrate Sigma C13961
Cap analog (m7G(5')) Applied Biosystems AM 8050
Chloroform Sigma C 2432
 L-Cysteine hydrochloride monohydrate Sigma C7880
dNTPs Invitrogen 18427-013
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma O3690
Ethanol VWR International 20821.33
Ficoll 400 Sigma F 4375
Fiji image J software N/A N/A Free download http://fiji.sc/Fiji
Gentamycin Melford G 0124
Glacial acetic acid Fisher Scientific A/0400/PB17
Glass cover slips, No.1.5  Scientific Laboratory Supplies 22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030 
Glass needle puller Narishige Narishige PC -10
Glass pull needles Drummond Scientific 3-000-203-G/X
Human chronic gonadotropin (HCG) Intervet
Isopropanol Fisher Scientific P/7500/PB17
Lithium chloride (LiCl) Sigma L-7026
LSM710 and Zen software (2008-2010) Carl Zeiss
Matlab software Mathworks http://uk.mathworks.com/
Molecular grade water  Fisher Scientific BP 2819-10
Nail varnish  Boots Bar code 3600530 373048
Spectrophotometer Lab.tech International ND-1000 / ND8000
Petri dish (55mm) VWR International 391-0865
Phenol-chloroform Sigma P3803
Photoshop software Adobe N/A http://www.photoshop.com/products
High fidelity DNA polymerase and buffers  Biolabs M0530S  Buffer – M0531S
Potassium chloride (KCl) Fisher Scientific P/4280/53
PVC insulation tape Onecall SH5006MPK
Gel extraction kit  Qiagen S28704
Restriction enzymes buffers Roche SuRE/CUT Buffer Set 11082 035 001
RNAse-free DNAse Promega ME10A
Steel back single edge blades Personna 66-0403-0000
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific 27810.364
SP6 transcription kit Ambion AM1330
Glass slides Thermo Fisher SHE 2505
Tris base Invitrogen 15504-020
Tungsten needles N/A N/A homemade
Zen lite software Carl Zeiss N/A Free download  http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html

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Fellgett, S. W., Ramsbottom, S. A., Maguire, R. J., Cross, S., O’Toole, P., Pownall, M. E. Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients. J. Vis. Exp. (106), e53162, doi:10.3791/53162 (2015).

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