Summary

باستخدام تحليل متحد البؤر من<em> القيطم المورق</em> بالتحقيق المغيرون من WNT وShh على محدثة التخلق التدرجات

Published: December 14, 2015
doi:

Summary

مخطوطة يوفر هنا مجموعة بسيطة من طرق لتحليل إفراز ونشر بروابط الموسومة fluorescently في القيطم. ويوفر هذا السياق لاختبار قدرة بروتينات أخرى لتعديل توزيع يجند والسماح التجارب التي قد تعطي نظرة ثاقبة آليات تنظيم التدرجات محدثة التخلق.

Abstract

يصف هذا البروتوكول وسيلة لتصور بروابط توزيعها عبر حقل من الخلايا. سهولة التعبير عن البروتينات الخارجية، جنبا إلى جنب مع حجم كبير من الخلايا في الأجنة في وقت مبكر، وجعل القيطم المورق نموذجا مفيدا لتصور بروابط الموسومة GFP. يتم ترجمتها من mRNAs الاصطناعية بكفاءة بعد الحقن في مرحلة مبكرة أجنة القيطم، والحقن يمكن أن تستهدف خلية واحدة. عندما جنبا إلى جنب مع التتبع النسب مثل غشاء المربوطة طلب تقديم العروض، وحقن الخلايا (ونسله) التي تنتج البروتين overexpressed يمكن بسهولة أن يتبع. يصف هذا البروتوكول وسيلة لإنتاج الموسومة من fluorescently WNT وShh على بروابط من حقن مرنا. أساليب تنطوي على ميلCRO تشريح إإكسبلنتس الأدمة (القبعات الحيوان) وتحليل يجند نشر في عينات متعددة. باستخدام التصوير متحد البؤر، معلومات عن إفراز يجند ونشر أكثر من مجال الخلايا يمكن الحصول عليها. التحليلات الإحصائية للصور مبائر توفر البيانات الكمية على شكل تدرجات يجند. قد تكون هذه الطرق مفيدة للباحثين الذين يرغبون في اختبار آثار العوامل التي يمكن أن تنظم شكل تدرجات محدثة التخلق.

Introduction

أثناء التطور الجنيني المبكر، والخلايا التي ارتكبت تدريجيا لمتابعة الأنساب محددة من التمايز: وهذا يعني مجموعة من مكتملة النمو (أو المحفزة) الخلايا تصبح مقيدة تدريجيا إلى إقامة السكان من الخلايا الاصلية العزم على أن تؤدي إلى نوع خلية واحدة. إشارات الخلية خلية مركزية لتنظيم مواصفات النسب أثناء التطور الجنيني. سوف تكون هناك حاجة التلاعب في هذه الإشارات لتوجيه الخلايا الجذعية نحو مصائر خاصة لدعم العلاجات الطبية الجديدة.

وأكد عدد صغير نسبيا من مسارات الإشارات خلال التنمية، بما في ذلك مسارات الاستجابة إلى الفصيلة TGF (nodals وأفضل الممارسات الإدارية) 1-2، عوامل النمو FGFs 3، 4 Wnts، والقنافذ 5. هذه البروتينات يفرز ربط مستقبلات موجودة على غشاء الخلية لتنشيط نقل الإشارة وبالتالي تغيير التعبير الجيني و / أو سلوك الخلية. تنظيم محكم من علامة الخليةalling أمر ضروري للمواصفات سلالة الخلايا والتطور الطبيعي. في حين أن الحديث المتبادل بين هذه الممرات مهم في تحديد مصير الخليوي، ويجند نفسه واحد يمكن أن تثير ردود متميزة في تركيزات مختلفة. وقد وصفت التدرجات محدثة التخلق منذ أكثر من 100 سنة بوصفها نظرية لشرح كيفية مختلف أنواع الخلايا يمكن أن تجنيها من حقل الخلايا 6. تشوير الجزيئات التي تنتجها مجموعة واحدة من الخلايا قد نشر على نطاق معين، وخفض التركيز في مسافة أكبر من المصدر. والخلايا المعرضة للإشارة لرد على تركيز المحلية في مركزها في مجال الخلايا، والخلايا في مواقع متميزة تستجيب بشكل مختلف لمستويات مختلفة من الإشارات. الدليل على وجود morphogens يأتي من الدراسات في وقت مبكر من ذبابة الفاكهة الجنين 7 و القرص الجناح وكذلك الأطراف الفقارية 9 و 10 الأنبوب العصبي.

وهناك حاجة إلى أساليب لفيvestigate كيف التدرجات محدثة التخلق يتم وضع وتحديد جزيئات أخرى مهمة في تنظيم هذه التدرجات. وقد استخدمت التجارب أنيقة باستخدام المناعية لتصور البروتينات الذاتية في الجسم الحي في سياق خلفيات وراثية مختلفة لتحقيق التدرجات محدثة التخلق 11-12. ومع ذلك، والأجسام المضادة جيدة والمسوخ محددة ليست متوفرة دائما، لذلك نحن هنا وصف البروتوكول باستخدام overexpression من بروابط الفلورسنت في القيطم، لتوفير بديل، طريقة بسيطة لتشريح كيفية منتجات الجين الخارجية يمكن أن تؤثر في توزيع بروابط عبر حقل من الخلايا. يوفر القيطم المورق نظام ممتاز لإجراء هذا النوع من التجارب مع تطور الأجنة من الخارج بحيث يمكن الوصول إليها في المراحل الأولى. حجمها كبير (1-1.5mm في القطر) يبسط microinjection والتلاعب الجراحية ومراحل الأريمة الخلايا هي سهلة لصورة لأنها لا تزال كبيرة نسبيا (حوالي 2081؛ م عبر). دراسات Overexpression في القيطم هي بسيطة للقيام: مرنا حقنها في الجنين في وقت مبكر يمكن أن تستهدف خلايا معينة، ويتم ترجمتها بكفاءة.

تم إنشاء الموسومة fluorescently بنيات Wnt8a / Wnt11b-HA-EGFP باستخدام pCS2 Wnt8a-HA 13، pCS2 Wnt11b-HA 14 و EGFP. الببتيد HA مهم لتشمل، ليس فقط لتوفير علامة الجزيئية إضافية، ولكن أيضا لأنه يعتقد أن تتصرف كفاصل فصل البروتينات WNT وEGFP يسمح كل من المنتجات الجينات لتعمل. التركيبة المستخدمة لتصور Shh على استخدمت في السابق لتوليد الماوس المعدلة وراثيا تعبر عن Shh على-EGFP الانصهار البروتين 15؛ هذا وقدمت تفضلت اندي مكماهون. الأهم من ذلك، هو استنساخ العلامة GFP لجميع بنيات 3 'إلى تسلسل إشارة بحيث يتم الاحتفاظ بها بعد المعالجة. ومن الضروري أيضا لضمان أن البروتين النهائي يتضمن تسلسل المطلوبة للتعديلات، مثل وadditioن من الدهون كما هو الحال بالنسبة لShh على وWNT ligands.The cDNAs تم subcloned في pCS2 + ناقلات التعبير الذي هو الأمثل لبرودوشن مرنا الاصطناعية. ويشمل المروج SP6 وإشارة تذييل بعديد الأدينيلات (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors).

العمل الموصوف هنا يوفر بروتوكول بسيط للمقارنة بين إفراز ونشر الموسومة fluorescently WNT وShh على الموسومة بروابط. عن طريق حقن كميات محددة من مرنا الاصطناعية، وبروتوكول circumnavigates أي مشاكل المرتبطة التعبير متغير من نواقل مختلفة استخدام منشطات مختلفة. وقد تم مؤخرا تطبيق هذه الأساليب لتحقيق في الآثار المترتبة على سلفات endosulfatase heparan Sulf1 على Shh على-EGFP وWnt8a / إفراز Wnt11b-HA-EGFP ونشرها في القيطم 16-17.

Protocol

وقد أجريت التجارب على الحيوانات تحت رخصة مكتب المملكة المتحدة الرئيسية في الهندسة الكهربائية والميكانيكية وتمت الموافقة على التجارب التي أجريت من قبل لجنة جامعة يورك الأخلاق في الامتثال للوصول: الأخلاق بيان (الحيوان البحوث: الإبلاغ عن التجارب المجراة) المبادئ…

Representative Results

يقدم تحليلا متحد البؤر من إإكسبلنتس الغطاء الحيواني معربا عن البروتينات الموسومة fluorescently نظام فعال لتصور توزيع يجند تحت ظروف تجريبية مختلفة. في مثال واحد، وتوزيع GFP الموسومة يظهر Shh على (الشكل 1). في المرحلة 2-خلية، يتم حقن أجنة القيطم في كل من الخلايا الت?…

Discussion

جزء أساسي من هذا البروتوكول هو توليد بروابط نشطة بيولوجيا والتي تتم معالجتها عادة، يفرز، وقادرة على استثارة رد فعل في الخلية المستقبلة، على الرغم من وجود شاردة الفلورسنت المرفقة. فمن الأهمية بمكان لإثبات أن المنتج الجينات fluorescently الموسومة نشطة بيولوجيا باستخدام ال?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد تم تمويل من قبل BBSRC هذا العمل منحة الهندسة الكهربائية والميكانيكية (BB / H010297 / 1)، حصة studentship BBSRC ريال، وstudentship MRC إلى SWF.

Materials

Agarose Melford MB 1200
Ammonium acetate Ambion From Megascript SP6 Kit AM 1330
Bicarbonate VWR International RC-091
Calcium nitrate Sigma C13961
Cap analog (m7G(5')) Applied Biosystems AM 8050
Chloroform Sigma C 2432
 L-Cysteine hydrochloride monohydrate Sigma C7880
dNTPs Invitrogen 18427-013
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma O3690
Ethanol VWR International 20821.33
Ficoll 400 Sigma F 4375
Fiji image J software N/A N/A Free download http://fiji.sc/Fiji
Gentamycin Melford G 0124
Glacial acetic acid Fisher Scientific A/0400/PB17
Glass cover slips, No.1.5  Scientific Laboratory Supplies 22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030 
Glass needle puller Narishige Narishige PC -10
Glass pull needles Drummond Scientific 3-000-203-G/X
Human chronic gonadotropin (HCG) Intervet
Isopropanol Fisher Scientific P/7500/PB17
Lithium chloride (LiCl) Sigma L-7026
LSM710 and Zen software (2008-2010) Carl Zeiss
Matlab software Mathworks http://uk.mathworks.com/
Molecular grade water  Fisher Scientific BP 2819-10
Nail varnish  Boots Bar code 3600530 373048
Spectrophotometer Lab.tech International ND-1000 / ND8000
Petri dish (55mm) VWR International 391-0865
Phenol-chloroform Sigma P3803
Photoshop software Adobe N/A http://www.photoshop.com/products
High fidelity DNA polymerase and buffers  Biolabs M0530S  Buffer – M0531S
Potassium chloride (KCl) Fisher Scientific P/4280/53
PVC insulation tape Onecall SH5006MPK
Gel extraction kit  Qiagen S28704
Restriction enzymes buffers Roche SuRE/CUT Buffer Set 11082 035 001
RNAse-free DNAse Promega ME10A
Steel back single edge blades Personna 66-0403-0000
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific 27810.364
SP6 transcription kit Ambion AM1330
Glass slides Thermo Fisher SHE 2505
Tris base Invitrogen 15504-020
Tungsten needles N/A N/A homemade
Zen lite software Carl Zeiss N/A Free download  http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html

References

  1. Shen, M. M. Nodal signaling: developmental roles and regulation. Development. 134 (6), 1023-1034 (2007).
  2. Shimmi, O., Newfeld, S. J. New insights into extracellular and post-translational regulation of TGF-beta family signalling pathways. J Biochem. 154 (1), 11-19 (2013).
  3. Pownall, M. E., Isaacs, H. V. . FGF Signalling in Vertebrate Development. 1, 1-75 (2010).
  4. Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell. 127 (3), 469-480 (2006).
  5. Ingham, P. W., McMahon, A. P. Hedgehog signaling in animal development: paradigms and principles. Genes and Development. 15 (23), 3059-3087 (2001).
  6. Wolpert, L. One hundred years of positional information. Trends in Genetics. 12 (9), 359-3564 (1996).
  7. Rushlow, C. A., Shvartsman, S. Y. Temporal dynamics, spatial range, and transcriptional interpretation of the Dorsal morphogen gradient. Current Opinion in Genetics and Development. 22 (6), 542-546 (2012).
  8. Erickson, J. L. Formation and maintenance of morphogen gradients: an essential role for the endomembrane system in Drosophila melanogaster wing development. Fly (Austin). 5 (3), 266-271 (2011).
  9. Towers, M., Wolpert, L., Tickle, C. Gradients of signalling in the developing limb. Current Opinions in Cell Biology. 24 (2), 181-187 (2012).
  10. Dessaud, E., McMahon, A. P., Briscoe, J. Pattern formation in the vertebrate neural tube: a sonic hedgehog morphogen-regulated transcriptional network. Development. 135 (15), 2489-2503 (2008).
  11. Briscoe, J., et al. Homeobox gene Nkx2.2 and specification of neuronal identity by graded Sonic hedgehog signalling. Nature. 398 (6728), 622-627 (1999).
  12. Ribes, V., et al. Distinct Sonic Hedgehog signaling dynamics specify floor plate and ventral neuronal progenitors in the vertebrate neural tube. Genes and Development. 24 (11), 1186-1200 (2010).
  13. Freeman, S. D., Moore, W. M., Guiral, E. C., Holme, A., Turnbull, J. E., Pownall, M. E. Extracellular regulation of developmental cell signaling by XtSulf1. Developmental Biology. 320 (2), 436-445 (2008).
  14. Tao, Q., et al. Maternal wnt11 activates the canonical wnt signaling pathway required for axis formation in Xenopus embryos. Cell. 120 (6), 857-871 (2005).
  15. Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning. Development. 135 (6), 1097-1106 (2008).
  16. Ramsbottom, S. A., Maguire, R. J., Fellgett, S. W., Pownall, M. E. Sulf1 influences the Shh morphogen gradient during the dorsal ventral patterning of the neural tube in Xenopus tropicalis. Developmental Biology. 391 (2), 207-218 (2014).
  17. Fellgett, S. W., Maguire, R. J., Pownall, M. E. Sulf1 has ligand dependent effects on canonical and non-canonical WNT signalling. Journal of Cell Science. 128 (7), 1408-1421 (2015).
  18. Dytham, C. . Choosing and using statistics : A biologist’s guide. , (2005).
  19. Fay, M. P., Proschan, M. A. Wilcoxon-Mann-Whitney or t-test? On assumptions for hypothesis tests and multiple interpretations of decision rules. Statistical Surveys. 4, 1-39 (2010).
  20. Christian, J. L., McMahon, J. A., McMahon, A. P., Moon, R. T. Xwnt-8, a Xenopus Wnt-1 /int-1-related gene responsive to mesoderm-inducing growth factors, may play a role in ventral mesodermal patterning during embryogenesis. Development. 111 (4), 1045-1055 (1991).
  21. Du, S. J., Purcell, S. M., Christian, J. L., McGrew, L. L., Moon, R. T. Identification of distinct classes and functional domains of Wnts through expression of wild-type and chimeric proteins in Xenopus embryos. Molecular and Cellular Biology. 15 (5), 2625-2634 (1995).
  22. Tada, M., Smith, J. C. Xwnt11 is a target of Xenopus Brachyury: regulation of gastrulation movements via Dishevelled, but not through the canonical Wnt pathway. Development. 127 (10), 2227-2238 (2000).
  23. Williams, P. H., Hagemann, A., Gonzalez-Gaitan, M., Smith, J. C. Visualizing long-range movement of the morphogen Xnr2 in the Xenopus embryo. Current Biology. 14 (21), 1916-1923 (2004).
  24. McDowell, N., Zorn, A. M., Crease, D. J., Gurdon, J. B. Activin has direct long-range signalling activity and can form a concentration gradient by diffusion. Current Biology. 7 (9), 671-681 (1997).
  25. Chen, Y., Schier, A. F. The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen. Nature. 411 (6837), 607-610 (2001).
  26. Miller, J. R., Rowning, B. A., Larabell, C. A., Yang-Snyder, J. A., Bates, R. L., Moon, R. T. Establishment of the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos coincides with the dorsal enrichment of dishevelled that is dependent on cortical rotation. Journal of Cell Biology. 146 (2), 427-437 (1999).
  27. Schohl, A., Fagotto, F. B. e. t. a. -. c. a. t. e. n. i. n. MAPK and Smad signaling during early Xenopus development. Development. 129 (1), 37-52 (2002).
  28. Muller, P., et al. Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system. Science. 336, 721-724 (2012).
  29. Yu, S. R., Burkhardt, M., Nowak, M., Ries, J., Petrasek, Z., Scholpp, S., Schwille, P., Brand, M. Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules. Nature. 461, 533-536 (2009).
  30. Janda, C. Y., Waghray , D., Levin, A. M., Thomas, C., Garcia, K. C. Structural basis of Wnt recognition by Frizzled. Science. 337, 59-64 (2012).
  31. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , (2010).

Play Video

Cite This Article
Fellgett, S. W., Ramsbottom, S. A., Maguire, R. J., Cross, S., O’Toole, P., Pownall, M. E. Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients. J. Vis. Exp. (106), e53162, doi:10.3791/53162 (2015).

View Video