Summary
本协议描述的方法来剖析，实验操作和鸡胚培养全视网膜植。当高的成功率，有效性和再现性都需要测试质粒电穿孔和/或试剂的物质， 即，酶抑制剂的效应的外植体培养是有用的。
Abstract
视网膜是显影中枢神经系统的良好模型。眼睛的大尺寸和最重要的是可访问的实验操作卵/体内使鸡胚胎视网膜一种多用途和非常有效的实验模型。虽然鸡视网膜容易靶向卵内通过眼内注射或电穿孔，视网膜内的试剂的有效和确切浓度可能难以完全控制。这可能是由于精确注射部位，泄漏从眼睛或物质的不均匀扩散的变体。此外，畸形和死亡率的侵入性操作，如电穿孔后的频率是相当高的。
这个协议描述一个前卵技术培养来自鸡胚整个视网膜植并提供对视网膜试剂的受控曝光的方法。该原COL介绍如何解剖，实验操作，并从鸡胚培养全视网膜植。外植体可以培养约24小时，并可以以不同的操作，例如电穿孔。的主要优点是，该实验是不依赖于胚胎的生存，并且所引入的试剂的浓度可以变化，并为了确定和优化的有效浓度来控制。此外，该技术具有快速，价格便宜，再加上其高实验的成功率，它保证可重复 结果。应当强调的是，它作为一个很好的补充卵内进行的实验。
Introduction
视网膜是中枢神经系统的一部分，它是，与它相对简单和充分表征的细胞结构，一个流行的用于研究的中枢神经系统的发展模式。鸡胚胎的眼睛是相比于胚胎的其余部分比较大。因此， 在卵内进行实验操作，如注射或电方便，而且作为一个优秀的工具来获取知识有关的视网膜细胞和体内发育生物学。尽管有这些主要优势，胚胎的存活率可低时的实验是侵入性的，如与电穿孔，重复注射，或结合实验操作。
电穿孔DNA质粒的进入蛋内的鸡胚是一个重要的和成熟的技术1。它允许神经元的标签，在中央NERV跟踪细胞命运以及神经脊髓束的OU系统和它允许异位基因表达来分析蛋白质的功能在体内 。该技术已用于神经管2的研究，后脑3和视网膜4。胚胎视网膜卵内电穿孔具有的相关的体内情况的一些实验困难。眼睛的位置，由于胚胎的颅折叠，相对靠近心脏。这样的接近会增加心脏骤停的下列电穿孔的风险，并与胚胎的年龄的风险增加。此外，访问眼，有必要打开胚胎膜，从而增加出血，畸形和随后的存活率下降的风险。当测试和经常优化新的DNA的质粒没有已知的表型的结果，这些限制可能会降低该方法的有效性和功率甚至对于有经验的实验者。作为呈现在这个协议中，的瓦特的培养孔视网膜外植体，其定义为整个神经视网膜与色素上皮除去，是在卵内的方法补充了一种有效的方法。
化学试剂眼内注射是比较容易的卵内进行。然而，神经视网膜内注射试剂的有效和确切浓度可能难以完全控制。所注入的体积可能由于渗漏和注射的确切位点可以影响眼睛内的试剂的两个分布并通过玻璃体的扩散。变异将对时即一种酶抑制剂的剂量反应曲线被确定的结果的解释主要影响;特别是如果效果小及效果的时间窗口很窄。而且，只有一个单一的眼睛可以从每个胚卵实验执行时使用，由于通过血液流潜在的全身效应到对侧眼。研究开发与处理和控制的胚胎可能会导致额外的实验变异之间的个体差异时，年龄匹配是非常重要的。
由于这些原因， 卵内的方法的当然基于来自鸡胚视网膜植被开发，其中，所述视网膜神经可暴露于均匀的和体外控制的实验条件下。本协议是根据以前的协议5-9开发。来自阶段视网膜外植体（ST）20（胚胎天[E] 3）〜ST31（E7）鸡胚进行解剖，培养和电穿孔以限定的DNA质粒浓度或暴露于包含一个限定的化学试剂的浓度的介质。这里介绍的协议已经成功地实施了最近的出版物，使用几种不同的化学试剂，包括DNA损伤通路的调节，如KU55933，SB 218078和NSC 109555 DITOsylate，和细胞周期，如CDK1 / 2抑制剂III 10,11。
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Protocol
该协议是根据“指南为协会的实验动物的护理和使用的研究视觉与眼科”，在这些建议进行的。
1.鸡蛋处理和眼收集
- 存储白来航鸡蛋在12-14℃下不超过1周。如果可能，请使用冷藏酒柜储存受精卵。
注：更高的存储温度导致胚胎发育异常，而较低温度增加了死亡率。延长贮存时间增加了死亡率和畸形发展。 - 孵育在37.5℃下的鸡蛋和60％湿度的蛋孵化器轻轻摇动以每24小时5次的频率。
- 从卵孵化在期望胚胎年龄除去温育卵。
注意：鸡胚的年龄被确定为孵育的时间和被表示为胚胎天（E）或作为阶段（ST），根据该系列由汉堡包和汉密尔顿12中所述发育阶段。 - 将所选鸡蛋在层流罩。擦拭用70％乙醇的蛋壳以避免胚胎的污染。
注：进行与无菌溶液无菌条件下的所有程序http://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory"lutions 和仪器。 - 点击蛋这一边抵住硬表面敲开鸡蛋。放置在100毫米培养皿中的内容。用一个小勺子的胚胎移植到含预热（37℃）PBS洗涤，防止干燥组织35毫米的培养皿。
- 把这个包含胚胎组织上在层流罩一双目视觉解剖显微镜35毫米的培养皿。由俭用细镊子颈部杀头的胚胎和丢弃的尸体。
- 用细镊子做一个切口日粗糙口，腹的眼睛。起始于切口部位，撕开围绕整个眼组织。夹断视神经并从眼窝中删除完整的眼球。从相同胚胎，以用作对照或处理过的眼睛收集的左和右眼。
- 用一个小勺子的目光转移到含预热（37°C）1X PBS一个新的35mm平皿。
2.准备工作全视网膜外植体
- 用细镊子清除所有的组织在眼部周围，包括巩膜原基。
注意：所述的组织将分离容易留下玻璃体和晶状体视网膜与色素上皮完整（图1A-B）。 - 用细镊子夹住的小切口插入色素上皮在眼睛的背部，而不会损坏神经视网膜（图1C）。
- 用细镊子轻轻撕开色素上皮starti纳克在切口部位，而使透镜和连接到玻璃体（图1D）的整个视网膜。保持眼睛在温暖（37℃）的1×PBS以利于除去的色素上皮。
注意：色素上皮可能难以除去，尤其是沿瞳孔周围睫状体，在眼睛的前部区域，并沿着脉络膜裂。因此，一些的色素上皮细胞可能会留在神经视网膜（图1E-F）。
3.治疗全视网膜外植体
- 全视网膜外植体电穿孔
注：整个视网膜植电穿孔可以直接步骤2之后进行。- 制备含有1培养基：1的DMEM：F12营养混合物，10％FBS，10U / ml青霉素链霉素，5微克/毫升胰岛素，和2mM L-谷氨酰胺。
- 切断1.5 ml的一次性塑料比色皿（12.5毫米×12.5毫米×45米米）（或任何小容器能够保持300-400微升溶液）约8毫米从底部用细刃锯。
- 选择在1xDPBS的DNA质粒稀释至0.1微克/微升的最终浓度。
- 打开电穿孔和设置参数到15 V为ST20 - ST25（E3-E4）视网膜以及20V ST26 - ST27（E5）视网膜。设置脉冲重复序列5的脉冲50毫秒脉冲长度为1秒的间隔。使用可以由脚踏地板上被控制作为双手将需要保持电极以代替脉冲发生器。
- 铂电极（图2A）连接两个桨形（4毫米扁平，圆形直径），以在脉冲发生器的输出插座。
注：在本协议中所使用的铂电极，由大学研讨会上提出。将电极0.1毫米的铂金板“rondelles”（：950铂/ 5铜铂金级）制成。该连接0.8毫米无线重复使用的塑料管是绝缘的。 - 小心地从2.3步使用聚乙烯巴斯德吸管切断以获得合适的烙铁头，开口尺寸为视网膜外植体顶端的比色皿（或相当小容器）转让全视网膜外植体。避免使用枪头为视网膜容易附着在塑料和撕裂。
- 使用100微升吸管轻轻地去除整个1X PBS周边视网膜外植体，注意不要接触视网膜，避免撕裂。
- 加入100微升的质粒溶液，以反应杯以覆盖整个视网膜外植体。轻轻下压视网膜外植体用钳子，如果它浮在顶部。使用镊子或电极来定位透镜面对反应杯和视神经的任一侧，以比色皿的底部。
- 放置在正极中的透镜和视网膜（图2A）的后面的负电极的前面，而不接触所述组织。
- 通过按下脚踏施加的电流。检查气泡在电极上表示成功出院。
- 使用100μl的移液管除去从试管所有质粒混合，而不会损坏视网膜。所述质粒组合可以重复使用的三到五倍。
- 填满预温（37℃）的1×PBS的试管。使用镊子从试管的壁轻轻分离视网膜外植体。电穿孔后视网膜有时覆盖有气泡，这使得它粘附在反应杯的壁。
- 使用聚乙烯巴斯德吸管向整个视网膜外植体转移到含有1ml预热（37℃），每孔培养基中的24孔平板。每孵育井一视网膜外植体。
- 孵育视网膜外植体在37℃下在旋转器上摇动，用50rpm的恒定速度，细胞培养箱，用5％ 的 CO 2 24小时内。旋转是，以确保最大暴露于介质和preve视网膜至24孔板的底部nt的粘合性。
- 继续执行步骤4。
- 全视网膜外植体的化学试剂处理
注：化学处理的整个视网膜植可以直接步骤2之后进行。- 制备含有1培养基：1的DMEM：F12营养混合物，10％FBS，10U / ml青霉素链霉素，5微克/毫升胰岛素，和2mM L-谷氨酰胺。
- 用小勺子从步骤2.3传输视网膜植于24孔板含有1ml每孔预温（37℃）的培养基。每孵育井一视网膜外植体。
- 加入化学试剂或媒介物之前孵育整个视网膜外植体60分钟，在37℃在旋转器上摇动，用50rpm的恒定速度，细胞培养箱，用5％的CO 2的内部。
- 制备的化学溶液，例如CDK1 / 2抑制剂III，M相进展13的抑制剂，在最终为30μm的DMSO浓度。
- 除去24孔板，包含整个视网膜外植体，从细胞培养箱。直接添加10μl的化学试剂或载体（DMSO）给视网膜介质，导致为300nM CDK1 / 2抑制剂III在0.01％DMSO的最终浓度。手动旋转24孔板以允许均匀分布在溶液中的化学试剂或车辆。
- 孵育视网膜植于37℃在旋转器上摇动，用50rpm的恒定速度，保温箱，用5％的CO 2所需的时间（长达24小时）内。
- 继续执行步骤4。
4.固定和全视网膜Eexplants的冻结
- 除去含有从细胞培养箱的处理的全视网膜外植的24孔板中。
- 用一个小勺子视网膜外植体转移到24孔板含1毫升/冰冷的1XPBS 4％多聚甲醛。 Incuba德在冰上15分钟。
- 用一个小勺子整个视网膜外植体转移到一个24孔平板含有1ml /孔冰冷1XPBS洗涤视网膜。冰上孵育10分钟。
- 用小勺子给整个视网膜外植体转移到24孔板含1毫升/在1XPBS以及冰冷的30％的蔗糖。在冰上孵育1-3小时取决于视网膜的胚胎天。对于ST20 - ST25（E3）视网膜，孵育1小时后，较旧的视网膜需要在蔗糖更长的温育时间。
- 用小勺子给整个视网膜外植体转移到含有约500微升冻结的低温恒温器安装介质的石蜡膜。通过使用小勺子轻轻移动视网膜外植体在冷冻介质删除尽可能多的蔗糖越好。
- 视网膜外植体转移到含有冻结介质的嵌入模具。放置眼以方便日后切片。将载有关于博士全视网膜外植体嵌入模具Ÿ冰，直到媒体被冻成冰。储存在-80℃。
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Representative Results
这个协议描述了从鸡胚整个视网膜植制备（图1A-F）和培养。此协议已被成功地用于整个视网膜植从ST20（E3）的胚胎ST31（E7）。
DNA质粒成整体视网膜外植体电穿孔允许视网膜祖细胞的标记和追踪或过度表达的不同基因产物。对于电的实验中，色素上皮细胞进行了仔细的从ST25（E4½）胚胎的去核眼中除去。整个视网膜外植体，然后放置在含有该DNA的质粒溶液的试管，电极被淹没（ 图2A）和一个施加电流。后培养24小时，GFP阳性细胞中的完整视网膜（图2B）的很大一部分是可见的。切片后，单个的GFP +细胞沿着视网膜的apico -基底轴线（ 连接容易地检测到古尔2C）。电穿孔导致了大面积的视网膜卷取质粒并表达该报道基因。的成功率，由视网膜的数量与电穿孔面积比总视网膜的1/5大时，测得为75％（62总分83视网膜），用于整个视网膜外植体电穿孔，相比14％（37总分263的眼睛），用于卵内电穿孔。在整个视网膜外植体电穿孔的实验已成功在ST20（E3）到ST27（E5）的胚胎进行。
整个视网膜植可以是约24小时（图3A 和B）中培养。较长的孵育时间可能会导致发育迟缓，形态学畸形，凋亡和最终崩解视网膜（图3C）的。当培养鸡视网膜作为整个外植体视网膜的结构保持完整。这包括沿着apico-浅分布在细胞周期的不同阶段的人轴。在正常发育的细胞经历S相上的基底侧，随后有丝分裂上的视网膜14,15的顶侧。从全视网膜外植体A节，培养24小时，被免疫染色用磷酸化组蛋白3（PH 3）的抗体，在晚G 2 / M期（图3D）标记细胞。的PH 3阳性细胞被发现在视网膜上，与正常视网膜发育相符的顶侧。在细胞核中活跃的细胞周期素B1-CDK1复合物将启动M-相变13。阻断CDK1激酶活性将抑制下游事件所必需的细胞周期传播进入有丝分裂。级29（E6）整个视网膜外植体培养的CDK1 / 2抑制剂III 4小时和PH3免疫反应进行了分析。所述CDK1 / 2抑制剂III降低PH 3阳性细胞 （图3E）的数量，表示G2 / M相变的有效块。 treatme后有丝分裂的数量减少核苷酸与CDK1 / 2抑制剂证实，该治疗是有效的。
图1.去除色素上皮细胞。胚胎第6天（ST29）鸡眼睛被解剖并为整个视网膜外植体培养准备。（一）鉴于眼前与瞳孔和镜片和脉络膜裂朝下。色素上皮是完好但巩膜原基和周围结缔组织已被删除。（B）的视图眼后部分。视神经出口和脉络膜裂朝下。（C）的切口中的色素上皮。（D）的大部分的色素上皮细胞已被删除。（E）的某些色素上皮留在沿着睫状体和轮缘（ F）的脉络膜裂。 LE：镜头和睫状体，CF：脉络膜裂，ON：视神经退出。比例尺为0.5毫米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.电穿孔的整个视网膜植。（A）中的铂电极的示意图介绍以及它们如何被定位在该浸没在截短的反应杯DNA质粒液中的全视网膜外植体的任一侧。（B）的后全视网膜植24小时的培养，和（C）的剖视网膜。 ON：视神经退出。比例尺为（A）4毫米，（B）0.5毫米，（C），50微米。 请点击此处查看大图已经 rsion这个数字。
图3.培养全视网膜外植体固定，冰冻，冰冻切片，并用标记免疫组化（A）ST29整个视网膜外植体培养24小时。核染色后（B）的 24小时， 和 （C）48小时的荧光显微镜照片。（D）的甲PH 3抗体来标记细胞在晚G 2 / M相。（E）相对密度（PH 3 +细胞/ mm 2时，平均值±SD）和荧光PH 3 +细胞的显微照片在ST29后CDK1 / 2抑制剂III处理4小时相比，车辆。 ST：汉堡和汉密尔顿阶段，学生的t检验，** P <0.01，N≥4治疗眼，每眼4个部分，H：小时。比例尺为（A）0.5毫米（BE）10微米。jove.com/files/ftp_upload/53202/53202fig3large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
在这项工作中对于夹层，电穿孔或化学处理，并从鸡胚整个视网膜外植培养一个详细的协议，提出。该协议是简单，快捷，可为高的成功率和可重复性 结果。
全视网膜外植体电穿孔产生大面积细胞表达目的基因构建的。这是很容易正确地定位在电极和到视网膜的特定部分暴露到规定DNA质粒浓度。这种方法允许一种可靠的方法，调查与相比卵电穿孔一个通常较高的成功率的视网膜基因功能，整个视网膜外植体也使得可以暴露视网膜的培养基含有确定的化学试剂的浓度给予在视网膜神经试剂的均匀分布。该协议允许对组合的处理，其中所述视网膜第一电穿孔，然后用物质进行处理。单个胚胎间变异性的影响可以被最小化，因为这两个处理过的和对照眼可以从同一胚胎被收集和被独立地处理。
该协议已被优化的ST20（E3）全视网膜外植体，ST27（E5）胚胎电和ST20（E3）到ST31（E7）的胚胎化学物质处理。在更小的级视网膜/视杯太小而脆弱有效处理和卵内电穿孔是最有可能更有效。是不是超过ST27（E5）阶段进行的全视网膜外植体电穿孔。很可能可以从较旧的胚胎适应这个协议外植体。这将包括获得较大的比色皿，孵育较大孔和视网膜培养基的体积增大。然而，通过E12-14色素上皮和的外段感光细胞成为密切关联的，和除去的色素上皮细胞可能会损坏视网膜。视网膜应在整个实验过程和孵育期间完好。
与此解剖和培养协议，视网膜结构的结构完整性中24小时，保持不变的基础上，细胞类型特异性标志物的表达。如所提到的，我们研究了细胞周期进程中的外植体和视网膜祖细胞interkinetic核迁移过程看起来正常。如果执行协议迅速有仅在该外植体发育进展小的效果。然而，发展可以稍微减速，并且已被培养24小时外植体可以表现出发育年龄是1-2小时比正常对应物更年轻。这是应比较外植体与年龄匹配的正常视网膜和它建议使用对侧眼作为实验EXPL蚂蚁的控制。应当指出的是去除的视网膜色素上皮细胞可能会影响外感光体段的发展。还应当指出的是外植体视网膜代表受伤视网膜视神经切断后视网膜神经节细胞。
该协议是简单，因此减少实验误差，但前OVO形势要求几个实验对照。甲特定的发育过程，是受使用该前卵协议也可以研究在平行和进行比较，以正常的卵的情况进行研究。适当的试验对照必须始终包括在内，如用于溶解的物质的车辆。当使用信号通路阻断剂，使用几种不同的抑制剂相同的过程，或者使用靶向酶在所研究的具体途径的多个级别不同的抑制剂。对于电穿孔，一个表达GFP的DNA质粒是有用SA阳性对照。如果这样的质粒不产生任何报告基因的表达，这是最有可能的原因是，在阳极（+）和阴极（ - ）不正确地定位。该DNA的质粒随后将迁移离开视网膜。当测试新的DNA质粒。因此，建议以包括针对表达不同荧光蛋白作为内部电控制的DNA的质粒。在这个协议中所描述的电穿孔参数进行了优化，以产生大量的报道基因的表达细胞。减小电压或脉冲的数量减少了转染细胞的数量，这可能产生假阴性结果。然而，增加电压或脉冲的数量可能导致组织损伤和增加的细胞死亡。三套定制铂电极期间超过两年已用于所有电穿孔没有示出任何减少的容量。的电极必须仔细清洗和电极面传热Ë抛光。商业4毫米桨电极可用。
该协议的重点是DNA质粒的电穿孔和全视网膜外植体的化学处理。有可能进一步扩大该协议以包含其他实验步骤，如基因表达的与使用吗啉代低聚物的击倒。整个视网膜植方法开辟了在一个简单，快速和高度可重复的方式进行短期的实验的可能性。它降低了成本，时间和所需的每个实验动物的数量和最重要的是它会增加获取固体数据的可能性。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1xPBS (tablet) | Life technologies | 18912-014 | |
| 10x DPBS | Life technologies | 14080-048 | |
| 100 mm Petri dish | VWR | 734-0006 | |
| 100 μl pipette tips | VWR | 613-0798 | |
| 1.5 ml disposable plastic cuvette | Thomas Scientific | 8495V01 | |
| 24-well plate | Sigma Aldrich | D7039 | |
| 35 mm Petri dish | VWR | 391-1998 | |
| 70% ethanol | Solveco | 1054 | |
| Cdk1/2 inhibitor III | 217714 | Calbiochem | 300 nM in 0.01% DMSO |
| Cell culture incubator | Thermo Forma | ||
| Dissecting microscope | Leica | ||
| DMEM | Life Technologies | 41966-029 | |
| Electrodes | Platina, custom made | ||
| Electro square porator ECM 830 | Harvard Apparatus | ||
| F12 Nutrient mix | Life Technologies | 31331-028 | |
| FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Forceps | AgnThos | 0108-5-PS | |
| Freezing medium NEG50 | Cellab, Sweden | 6502 | |
| GFP expressing DNA plasmid (pZGs) | |||
| Humidified incubator | Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany | 8204 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | |
| Mounting medium ProLong Gold with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| Paraffin film | VWR | 291-1214P | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 16005-1KG-R | |
| Peel-A-Way embedding mold | Sigma Aldrich | E6032 | |
| Penicillin streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| PhosphoHistone 3 (PH3) | Millipore | 06-570 | Dilution 1/4,000 |
| Platinum electrodes (custom made from "rondelles") | Sargenta | 390-R (rondeller) | Dia: 4mm, 0.1 mm thickness |
| Platimun electrodes | Sonidel | CUY700P4L | Dia: 4 mm |
| Polyethylene pasteur pipette | VWR | 612-2853 | |
| Rotator shaker | VWR | 444-2900 | |
| Small spoon | VWR | 231-2151 | |
| Sucrose | VWR | 443815S | |
| White Leghorn eggs | Local supplier | ||
| Wine cooler | WineMaster 24, Caso, Berlin Germany |
References
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