Introduction
L'accumulo di tau intracellulare amiloidi definisce tauopatie come il morbo di Alzheimer. Nelle fasi iniziali della malattia, la patologia è generalmente localizzata alle regioni discrete del cervello, ma con la progressione della malattia, la patologia si diffonde sempre lungo le reti neurali distinte 1-5. Accumulare evidenza suggerisce transcellulare propagazione di aggregati proteici tossici alla base di questa patologia (rivisto in 6-10). In questo modello, i semi proteopathic (ad esempio, tau) vengono rilasciati dalle cellule del donatore e entrano nelle cellule vicine, trasformando proteina tau nativo nella forma misfolded via su modelli cambiamento conformazionale 11-15. Il test qui descritto è stato sviluppato per rilevare sensibilmente tale attività semina. E 'compatibile con proteina ricombinante e campioni biologici e consente una quantificazione dei livelli di attività di seeding proteopathic 16 minuti.
Cellule HEK 293T che esprimono stabilmente tau ripetizione dOMain (RD) contenente il P301S mutazione associata a malattia fuso a uno CFP o YFP (di seguito indicato come cellule tau-RD-CFP / YFP) servire come biosensore stabile di attività di seeding. In assenza di semi proteopathic, le cellule mantenere tau come monomero solubile, e non hanno sfondo apprezzabile FRET. Assorbimento spontanea o liposomi mediata trasduzione di semi tau nelle cellule, però, si traduce in RD-CFP e aggregazione RD-YFP, che produce un segnale FRET che si misura all'interno delle cellule singole tramite citometria a flusso.
Numerosi componenti di questo test sono stati progettati per migliorare la sensibilità e ridurre la variabilità. Una linea di cellule monoclonale con un rapporto di 1: espressione RD-CFP / YFP 1 è stato scelto, in quanto fornisce il segnale ottimale: il rumore. Per aumentare la sensibilità, fosfolipidi vengono utilizzati per introdurre semi direttamente in cellule (anche per studiare i meccanismi biologici di assorbimento, questo può essere omesso). Infine, citometria a flusso monitor FRET a livello di popolazione e una singola cella livello, a differenza di altre metodiche di aggregazione delle proteine. La misura di esito finale, densità FRET integrata, è altamente quantitativa e spiegherebbe sia il numero di cellule con aggregazione, e il grado in cui si è verificato l'aggregazione all'interno di ogni cella. Tutti questi parametri ottimizzati migliorare la sensibilità e garantire la riproducibilità.
Questo sistema è stato recentemente impiegato in uno studio completo in transgenici P301S topi taupatia 17 che ha valutato l'insorgenza e la progressione temporale di attività di seeding tau rispetto ad altri marker patologici tau comunemente usati (per esempio, MC1, AT8, PG5 e ThioflavinS). Attività di seeding è di gran lunga il marcatore prima e più robusto di tau patologia valutato, precedente rilevazione istologica di almeno 6 settimane. Attività di seeding appare a 1,5 mesi e aumenta progressivamente con l'età, suggerendo un ruolo causale di semi proteopathic nell'insorgenza e / o la progressione della neurodegenerazione 16.
e_content "> quantificazione precisa dei livelli di materiale di seme da campioni biologici minuti può facilitare gli studi che monitorano la progressione della malattia precoce. Accorciando la durata di prova e consentendo l'uso di animali più giovani, ciò potrebbe aumentare l'efficienza e l'accuratezza delle prove sugli animali preclinici. Ad esempio, in il mouse P301S precedentemente descritto, composti di piombo potrebbero essere consegnati già nel 4-6 settimane (immediatamente prima, o inizio dell'attività seeding), e monitorati per l'efficacia 2-4 settimane più tardi. Il dosaggio deve quantificare con precisione eventuali riduzioni di semina attività. FRET citometria a flusso è possibile testare rapidamente in vitro applicazioni di screening così. Ad esempio, reagenti anti-tau (ad esempio, anticorpi, molecole di piccole dimensioni, etc.) per la loro capacità di bloccare la semina di induzione direttamente in coltura, utilizzando tau ricombinante aggregati o lisati cervello-derivato come una fonte di semi (Figura 5). Con questa impostazione, una volta che il materiale seme è preparato, un exsperi- dura solo tre giorni per completare, compresa l'analisi dei dati. La rapida quantificazione dell'attività seeding proteopathic può quindi facilitare molti studi di neurodegenerazione.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Questo protocollo enfatizza l'uso di FRET citometria a flusso per rilevare attività di seeding da campioni biologici del mouse. E 'anche compatibile con fibrille ricombinanti e campioni biologici umani. Mouse l'eutanasia e il cervello raccolta è stata effettuata in conformità con le procedure IACUC approvati.
1. Cervello Estrazione
- A seguito di profonda anestesia con isoflurano (2%), defluire in un mouse con ghiacciata PBS contenente 0,03% di eparina, ed estrarre il cervello seguendo le istruzioni dettagliate riportate nella Gage et al. 18
- Posizionare il tessuto estratto in crio-fiala, e far scattare freeze mettendo in azoto liquido. In alternativa, congelare il tessuto in ghiaccio secco. Una volta congelato, trasferire tessuto a -80 ° C e conservare per un periodo di tempo prolungato, se necessario.
NOTA: Questo protocollo è compatibile con interi omogenati cerebrali o regioni cerebrali micro-sezionato. Vedere Hagihara et al., Per una dettagliata protocollo micro-dissezione 19. 2. Preparazione delle sementi biologiche materiale - Preparare tampone omogeneizzazione sciogliendo inibitori della proteasi (EDTA gratuito) in 1x TBS (1 compressa per 10 ml). Vortex con vigore, e memorizzare sul ghiaccio. Gli inibitori della proteasi devono essere EDTA liberi al fine di preservare la vitalità cellulare biosensore.
- Pesare tessuto cerebrale congelato in una pesa barca usa e getta, e trasferire in una provetta da 5 ml. Aggiungere ghiacciata buffer di omogeneizzazione tale che questa soluzione finale è del 10% peso / volume. Temporaneamente memorizzare sul ghiaccio. Massa di tessuto e successiva omogeneizzazione polmone variano a seconda delle dimensioni del cervello e / o delle regioni utilizzato. Qui, un hemibrain topo adulto peso 0,2 g viene sospeso in 2 ml di 10% w / soluzione vol.
- Campioni di trasferimento in una stanza fredda e regolare un sonicatore sonda per le impostazioni appropriate. Per sonda sonicazione con Omni Ruptor (qui illustrato), impostare la potenza al 20%, che corrisponde a circa 75 W. Utilizzare un modo a impulsi per garantire campioni non sono Over-riscaldata durante sonicazione. Impostare il pulser al 30%, corrispondente a circa 500 msec.
- Pulire la punta della sonda sonicatore risciacquando con acqua, isopropanolo, e ancora acqua, rimuovendo la sonda tra ciascuna soluzione. Essere certi di lavare e pulire entrambi i lati e la parte inferiore della sonda con laboratorio-salviette.
- Lavorare con un campione alla volta, immergere la punta della sonda nel buffer di omogeneizzazione, e avviare il sonicatore. Utilizzando le impostazioni di alimentazione e pulser sopra descritte, consegnare 25 impulsi totali. Assicurarsi che il tessuto è completamente in sospensione. Fare attenzione ad evitare la formazione di schiuma del campione durante questa fase.
NOTA: I campioni sono suscettibili alla formazione di schiuma se a) il volume totale è basso o b) l'omogenato riscalda. Con questo strumento specifico, non sonicare con volumi inferiori a 250 microlitri. Per garantire i campioni rimangono refrigerati, i tubi possono essere conservati in ghiaccio durante questa fase. - Pulire la sonda asciugandosi lisato residua, poi consegnare 10 impulsi in un bicchiere oacqua pulita f. Sciacquare le pareti e il fondo della sonda con acqua, isopropanolo, e l'acqua di nuovo (come al punto 2.4), asciugandosi asciugare tra un passo. Per evitare la contaminazione, sciacquare la sonda in tra i campioni.
NOTA: Con aggregati tau, non abbiamo trovato che i metodi di pulizia più severi sono necessari per prevenire la contaminazione da campione a campione. Altri amiloidi, tuttavia, possono necessitare di cure aggiuntive che è stato ampiamente descritto in letteratura 20,21. - Conservare omogenati in ghiaccio fino sono stati elaborati tutti i campioni.
- Spin omogenati a 21.300 xg per 15 minuti a 4 ° C.
- Trasferire il surnatante in una provetta pulita, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Eliminare il pellet. Aliquota il surnatante, e conservare lisati a -80 ° C per un ulteriore uso. Evitare cicli di congelamento / scongelamento dei omogenati, tuttavia, come questo riduce l'efficienza semina.
- In un ambiente sterile, terreno di coltura aspirato. Lavare le cellule con PBS caldo, e aspirare. Trypsinize cellule (3 ml di tripsina-EDTA (0,05%)) per 3 minuti, spegnere con terreno di coltura caldo (9 ml di DMEM, 10% FBS, 1% penna / strep, 1% Glutamax), e trasferire immediatamente le cellule a una tubo conico.
- Cellule centrifugare a 1000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il terreno, e pellet di cellule risospendere in mezzo di coltura caldo.
- Utilizzando un emocitometro, determinare la densità delle cellule per ciascuna linea cellulare. Densità cellulare varia a seconda confluenza al momento della raccolta e del volume risospensione. Risospendere le cellule raccolte da un piatto 10 cm al 90% di confluenza in 10 ml media, per la densità cellulare di circa 1 milione di cellule / ml.
- Compiereun master mix di cellule + supporti in modo tale che ciascun pozzetto di una piastra ben 96 conterrà 35.000 cellule in 130 microlitri mezzi (ad esempio, per fare un master mix per 100 pozzi, risospendere 3,5 milioni di cellule in 13 ml di media). Modificare il numero di cellulare per soddisfare i singoli progetti sperimentali e scadenze. Per il trattamento delle cellule ~ 18 ore dopo la placcatura, aggiungere 35.000 cellule per ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
- Utilizzando una pipetta multicanale, lentamente pipetta 130 ml di sospensione cellulare master mix in ogni pozzetto di un fondo piatto, tessuto cultura trattati 96 pozzetti. Mentre placcatura, posizionare la punta della pipetta nel centro del pozzo, senza toccare il fondo della piastra.
NOTA: Sebbene formato placcatura può essere modificata, rendendo n = 4 pozzetti per ogni linee cellulari 1-3 per piastra è raccomandato. Il resto della piastra (n = 84) è riservato per linea cellulare # 4 (cellule biosensori). - Permettono alle cellule di stabilirsi lasciando la placca indisturbato per 10 minuti a temperatura ambiente. Incubare O / N a 37 ° C, 5% CO 2, e &# 8805; 80% di umidità relativa.
- In un tubo, unire reagenti di trasfezione, come Lipofectamine, con media-siero ridotto, come Opti-MEM, per fare un master mix. Per bene, aggiungere 1,25 ml di reagente di trasfezione e 8,75 ml di media-siero ridotto. Tubo Flick delicatamente per miscelare brevemente spin down, e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
- In un altro tubo, combinare materiale seme (aliquota di lisato dal punto 2.9) con media-siero ridotto.
NOTA: Volume del materiale di seme varierà secondo l'esperimento individuale. Al momento di scegliere il volume del seme, prendere in considerazione: l'abbondanza di semi in un campione e potenziale tossicità. Omogenati greggio possono essere tossici per le cellule. In quanto tale, utilizzare il volume più basso possibile per monitorare l'effetto desiderato. Volumi precedentemente testati di lisato / pozzetto gamma from 1-5 ml, corrispondenti a proteine totali 5-20 mg. Assicurarsi che il volume totale per pozzetto (semi + media-siero ridotto) è di 10 ml. - Unire il contenuto dei due tubi descritti in 4.1 e 4.2, flick delicatamente per miscelare brevemente spin down (1.000 xg, 5 sec), e incubare a temperatura ambiente per almeno 20 minuti e fino a 2 ore.
- Pipettare delicatamente 20 ml di complesso trasduzione sul lato di singoli pozzetti biosensori. Utilizzare tre repliche tecnici, se possibile. Ritorna cellule trattate per l'incubatore per 24-48. Incubare nelle stesse condizioni come descritto al punto 3.6.
NOTA: La condizione di controllo negativo appropriato per questa configurazione è cellule biosensori trattate con liposomi vuoti (ad esempio, il reagente liposomi + media-siero ridotto), perché l'applicazione di fosfolipidi introduce un leggero cambiamento nel profilo di fluorescenza rispetto al biosensori cellule non esposte al reattivo liposomi. - Utilizzando una pipetta multicanale, aspirare tutte di medie cella (150 ml). Trypsinize (50 ml), le cellule per 5 minuti, e dissetare con 150 ml refrigerata terreno di coltura. Non includere un risciacquo PBS prima di tripsinizzazione in questa fase, in quanto può provocare il sollevamento delle cellule e la successiva perdita di cellule. Escludere eventuali cellule morte contaminanti e detriti durante citometria a flusso, tramite strategie di gating.
- Subito dopo tempra, le cellule di trasferimento ad una piastra di fondo pozzo rotondo 96, e centrifugare a 1000 xg per 5 min a temperatura ambiente.
- Aspirare e scartare medio, avendo cura di evitare di disturbare il pellet.
- Delicatamente, ma a fondo, risospendere il pellet cellulare in 50 ml 2% paraformaldeide, e incubare per 10 min. In alternativa, le cellule eseguire dal vivo, anche se la fissazione fornisce i risultati più puliti e più coerenti.
- Cellule centrifugare a 1000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Aspirare e scartare paraformaldeide, avendo cura di evitare di disturbare il pellet.
- Delicatamente, ma accuratamente, risospendere il pellet cellulare in 200 microlitri di flusso refrigerata citometria tampone (HBSS, 1% FBS, 1 mM EDTA) ed eseguire la piastra appena possibile per evitare grumi cellule.
- Fai un Side Scatter-Area (SSC-A) vs Forward Scatter-Area (FSC-A) plot bivariata, e con linea cellulare # 1 in funzione, regolare le tensioni di SSC e FSC fino a quando la popolazione cellulare è nel quadrante in basso a sinistra. Fare clic sullo strumento poligono, e definire la popolazione cellulare (Porta P1). Per tutti i parametri di gating vedi figura 2.
- Fare un FSC-H (altezza) vs plot FSC A bivariate, e applicare Porta P1 a tale grafico, facendo clic su "live" al di sopra della trama, e selezionando P1. Con la linea di cellule # 1in esecuzione, fare clic sullo strumento poligono, e definire singole cellule (Porta P2).
- Fai 3 istogramma, uno per ognuno dei filtri di interesse: CFP, YFP e FRET. Applicare Porta P2 a tutte queste trame cliccando su "live" sopra le trame, e selezionando P2. Con la linea di cellule # 1 in funzione, regolare le tensioni in modo che la popolazione di cellule mediana nella PCP, YFP, e ti agiti istogrammi sono tutti tra 0 e 1. Per misurare la PCP e FRET, eccitare le cellule con il laser 405 nm, e la cattura di fluorescenza con una 450/50 nm e 525/50 nm filtro, rispettivamente. Per misurare YFP, eccitare le cellule con un laser e cattura la fluorescenza 488 nm con un 525/50 nm filtro. Impostazioni laser e filtro sono ulteriormente descritti nella Tabella 2.
- Eseguire il risarcimento dei CFP spillover nei canali FRET e YFP.
NOTA: Il risarcimento è il processo di correzione di fluorescenza spillover. Fluorescenza spillover si verifica ogni volta che viene rilevata l'emissione di fluorescenza di un fluorocromo all'interno di un filtro designato per misurare il segnale da un altro fluorocromo. Con una corretta compensazione, le ripercussioni di fluorescenza PCP può essere rimosso dai canali FRET e YFP.
NOTA: Compensazione richiede la presenza di entrambe le celle -positive e -negative fluorescenza. Pertanto, per compensare su cellule PCP-positive (linea cellulare 2 #), cellule negative (linea cellulare # 1) devono essere aggiunti al campione prima della corsa.- Spike in 30 ml di linea cellulare # 1 sospensione da un singolo pozzo in 200 ml di linea cellulare # 2 sospensione immediatamente prima di compensazione.
- Fare clic sull'icona "Impostazioni strumento", quindi la scheda 'indennizzo', e verificare 'matrice' per aprire la tabella di compensazione.
- Fare un FRET-A vs CFP-Una trama bivariate, e applicare porta P2, come descritto al punto 6.3. Con le linee di cellule 1 + 2 in esecuzione, fare clic sull'icona 'quadrante' e disegnare quadranti tale che le popolazioni di fluorescenza -negative e -positive sono separati da due quadranti inferiori (Gates LL3 unnd LR3, rispettivamente).
- Creare una tabella delle statistiche che visualizza l'intensità media di fluorescenza (MFI) di FRET per la LL3 e cancelli LR3. Regolare il parametro FRET nella matrice di compensazione fino alla MFI del segnale FRET è equivalente tra LL3 e LR3. Dopo questo passo, l'MFI del segnale FRET è uguale tra le cellule e le cellule non colorate CFP-positive, suggerendo l'assenza di PCP spillover nel canale FRET.
- Fare un YFP-A vs CFP-Una trama bivariate, e applicare porta P2, come descritto al punto 6.3. Disegna quadranti (LL4 e LR4) simile a quella fatta nel passaggio 6.4.3.
- Creare una tabella delle statistiche che visualizza la MFI di YFP per LL4 e LR4. Regolare il parametro YFP nella matrice di compensazione fino alla MFI del segnale YFP è equivalente tra LL4 e LR4. Dopo questo passo, l'MFI di un segnale YFP è uguale tra le cellule e le cellule non colorate CFP-positive, suggerendo l'assenza di PCP spillover nel canale YFP.
- Folla causa di configurazione porta e la compensazione, evidenziare pozzi di interesse ed eseguire il resto del piatto.
- Dopo che tutti i campioni sono stati eseguiti, i file di dati di esportazione facendo clic su 'file', quindi 'copia'. Selezionare la scheda 'file di dati ", evidenziare la cartella esperimento, e fare clic su' copia '.
- Aprire i file FCS nella citometria a flusso programma di analisi.
- In base alle proprietà di dispersione, utilizzare una porta poligonale per definire la popolazione cellulare (SSC vs FSC) e la popolazione singoletto (FSC-H vs FSC-A) da cellule trattate con liposomi vuoti, simile a quella descritta nella sezione 6.
- Se la compensazione PCP è stato eseguito durante l'installazione, non regolare ulteriormente PCP.
- Creare una FRET vs YFP bivariata trama. Utilizzando linea cellulare # 3, Definire un cancello FRET falso disegnando un cancello poligonale che corre lungo il pendio della popolazione di cellule FRET-positivo. Questa porta esclude YFP singole cellule positive che emettono un segnale all'interno del filtro FRET, ed è attratto simile a quello precedentemente indicato, vietando et al. 22
- Definire un cancello FRET tracciando cellule CFP / YFP liposomi trattati vuote su una FRET vs. PCP bivariata trama. Introdurre un cancello poligonale lungo il pendio della popolazione che si estende verso l'alto e verso sinistra dalla popolazione. Questa porta deve escludere maggior parte delle cellule (~ 99%), in modo tale che sfondo FRET è ≥1% delle cellule. Tutti gli eventi che spostano in questa porta sono considerate FRET-positivo.
NOTA: Ogni individuo porta sopra descritto si applica a tutti i campioni prima di costruire porte successive. A seguito di analisi, quattro porte individuali sono definiti (popolazione cellulare; singoletto, falso FRET, FRET). - Parametri di analisi record di interesse, tra cui: cento FRET positività e MFIdi cellule FRET-positive. Calcolare manualmente la densità FRET integrata misurando il prodotto della percentuale di positività e di MFI.
NOTA: Se la densità FRET integrato viene utilizzato come misura di esito, impostare sfondo FRET (come definito al punto 7.5) e MFI maggiore o uguale a 1 per evitare il calcolo di un prodotto che è inferiore rispetto ai suoi due fattori individuali.
3. Cellule replating biosensore
NOTA:Utilizzare quattro linee di cellule per questo dosaggio: HEK 293T (linea cellulare # 1), RD-P301S-CFP (linea cellulare 2 #), RD-P301S-YFP (linea cellulare 3 #), e RD-P301S-CFP / YFP ( linea cellulare # 4). Si prega di fare riferimento Tabella 1 per il contributo di ogni linea cellulare per il test.
4. Cellule Trattamento
NOTA: Il giorno seguente, quando le cellule biosensori tau sono 60-65% confluenti, preparare semi di complessi di trasduzione come segue:
5. Celle di raccolta per FRET Citometria a flusso
6. FRET Citometria a Flusso
NOTA: Utilizzare un citofluorimetro come il MACSQuant VYB, che è dotato di FRET-compatibile linee laser e set di filtri (Tabella 2). Per ogni passo all'interno di questa sezione, fare clic sul pozzo di interesse utilizzando il modello a 96 pozzetti del software, quindi fare clic su"Play" per iniziare l'assorbimento e il flusso del campione. Fai trame o tabelle statistiche cliccando sull'icona 'nuova finestra di analisi'. Modificare i parametri degli assi su singoli appezzamenti bivariati facendo clic sul titolo sulla X o Y e selezionare il filtro appropriato. Per spostare popolazioni cellulari o segnali di fluorescenza, aumentare o diminuire le tensioni associate con i filtri appropriati. Con questo strumento, eseguire <1.000 eventi / sec per garantire un monitoraggio cella singola accurata.
Analisi 7. I dati
NOTA: i parametri degli assi cambiamento su singoli appezzamenti bivariati facendo clic sul titolo sulla X o Y e selezionare il filtro appropriato.
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Representative Results
FRET citometria a flusso consente sensibile, quantitativa, e la rapida individuazione di attività semina da campioni ricombinanti o biologici. Messa a punto del test è facile: le linee cellulari stabili monoclonali-derivati che esprimono tau-RD-CFP / YFP sono trasdotte con materiale di seme, incubate per 24-48 ore, e sottoposti ad analisi di citometria di flusso (Figura 1A). In assenza di semi, cellule biosensori mantengono tau in un solubile, forma monomerica (Figura 1B). In presenza di semi, tuttavia, le cellule biosensori convertono tau in uno stato aggregato (Figura 1C), producendo una risposta FRET che viene rilevato su una base per-cella con citometria a flusso. Valutazione quantitativa dimostra che le cellule biosensore rispondono a concentrazioni femtomolar di materiale di seme e che l'attività semina possono essere efficacemente misurati su tre ordini di grandezza (Figura 1D).
Parametri di gating sono stati istituiti per garantire l'individuazione di una true Fret segnale, anche a concentrazioni basse di semi. Primo, gating metodi standard sono utilizzati per isolare la popolazione di cellule (Figura 2A) e singole cellule (Figura 2B). FRET segnale falso può derivare da attivazione diretta del YFP dal laser 405 nm. Così, un cancello FRET False viene prelevato da una popolazione di cellule singolo positivo YFP escludere contaminanti segnale (Figura 2C). Infine, il cancello FRET è definito da non teste di serie CFP / YFP cellule dual-positivi (Figura 2D). Viene tracciato un gate in prossimità del pendio della popolazione che si estende verso l'alto e verso sinistra a partire da esso. Cellule non stimolate dovrebbero avere uno sfondo FRET valore impostato a circa 1%, e le cellule FRET-positive si sposterà in questa porta in modo dose-dipendente (Figura 2E e confrontare 2F). Più parametri vengono presi in considerazione con FRET citometria a flusso, tra cui: percentuale di positività (cioè, il numero di cellule FRET-positive per conta delle cellule totale) E intensità di fluorescenza mediana (cioè, il grado in cui una risposta FRET è prodotto in una cella FRET-positivo). Densità Integrated FRET è la misura risultato preferito, in quanto è il prodotto di queste due variabili e totalmente rappresenta il grado di attività semina indotta da qualsiasi dato campione.
FRET citometria a flusso è compatibile con P301S taupatia topo di derivazione lisati cervello, anche in giovane età, come mostrato in figura 3. A seguito di microdissezione di quattro regioni del cervello diverse, Fret citometria a flusso è stato utilizzato per misurare l'attività di semina da tronco encefalico (figura 3A), neocorteccia (Figura 3B), lobo frontale (Figura 3C), e l'ippocampo (Figura 3D) in topi P301S in un range di età. In ogni regione, attività di seeding aumenta con l'età ed è apparso a soli 1,5 mesi. Tuttavia, i topi knockout (tau "KO")> 12 mesi non ha mostrato attività seeding. Rispetto histologico analisi svolte all'interno degli stessi animali, questo è di sei settimane prima di quanto l'aspetto di qualsiasi altro marcatore di tau deposizione (Figura 3E), compresi i marcatori di tau conformazionalmente-aberrante (MC1), tau iperfosforilata (AT8 e PG5), e amiloide conformazione (ThioflavinS). Da una visione meccanicistica, il rilevamento prossimale di attività di seeding tau suggerisce semi come mediatore causali di insorgenza e / o la progressione taupatia. Dal punto di vista sperimentale, questo suggerisce che l'analisi delle attività di seeding può essere un complemento ideale per misure standard di outcome di tau deposizione, data la sua comparsa precoce e robusta.
Oltre a topi transgenici, Fret citometria a flusso è compatibile con lisati cervello umano e può facilmente rilevare aggregati tau isolati da malattia di Alzheimer soggetti (Figura 4). Quando il tessuto congelato cervello umano viene omogeneizzato nello stesso modo come descritto qui per P301S lisati cerebrali, semina attivitàè robusto rilevata da tutti i campioni provenienti da soggetti AD. Al contrario, l'attività seeding non è mai rilevata da lisati di soggetti di controllo della malattia pari età o di Huntington. Questo sottolinea la specificità del test per gli aggregati tau.
Mentre l'attenzione di questo articolo è il rilevamento sensibile di attività seeding tau con consegna liposomi-mediata di aggregati in cellule HEK 293T biosensori, più fisiologiche paradigmi di colture cellulari possono essere eseguite anche con FRET citometria a flusso per valutare meccanismi di base di assorbimento cellulare. Ad esempio, colture primarie neuronali possono essere infettati con lentivirus esprime il tau-RD-CFP e tau-RD-YFP costruisce al momento della placcatura. A DIV4, aggregazione è assente nelle cellule non trattate (Figura 5A) ma rilevabile nei neuroni trattati con materiale di seme contenente (Figura 5B). È importante sottolineare che, fosfolipidi sono esclusi in questi esperimenti, permettendo la ricerca di fisiologica e pat Meccanismi di semina hophysiological. Pertanto, l'applicazione di fibrille tau porta ad assorbimento neuronale mediata HSPG e stimola l'aggregazione in modo dose-dipendente che può essere quantificata con flusso FRET citometria (Figura 5C). Inoltre, il test può essere impiegato per la valutazione terapeutica di tau assorbimento e la semina blocco in vitro utilizzando cellule tau biosensori HEK 293T. Anche in assenza di fosfolipidi, sia fibrille ricombinanti (Figura 5D) e P301S lisati cerebrali (Figura 5e) inducono aggregazione tau. Pre-incubazione di questi tau semi con eparina (precedentemente dimostrato di essere un potente inibitore di HSPG mediata captazione tau), tuttavia, elimina la loro capacità di semina. Questa configurazione sperimentale potrebbe essere applicata a qualsiasi farmaco (ad esempio, anticorpi, piccole molecole, etc.) e consentirebbe rapida valutazione di assorbimento e / o terapeutici semi-modifica.
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Figura 1. flusso FRET citometria sensibile rileva tau attività di seeding 16. Le cellule 293T monoclonale HEK esprimenti tau-RD-CFP / YFP sono state trasdotte con campioni ricombinanti o biologici, incubate per 24-48 ore, e analizzati su base singola cella utilizzando la citometria a flusso (A). Cellule non stimolate mantengono tau-RD in uno stato monomerico (B), mentre le cellule trattate con esposizione materiale inclusioni di spicco di semi contenenti (C). Valutazione quantitativa (media ± SEM) di spettacoli di attività semina che Fret citometria a flusso è sensibile a concentrazioni femtomolar (monomero equivalenti) di materiale semi ricombinante e rilevamento estende su tre ordini di grandezza (D). Equivalente monomero rappresenta la quantità totale di proteina contenuta nella reazione fibrillization e non risolve del incomplete &# 160; incorporazione di monomero nel materiale aggregato. Pertanto, la concentrazione di aggregati effettivi (semi) deve essere inferiore o uguale al suo 'equivalente monomero'. * Modificato da Holmes e Furman et al. 16 Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. strategia di gating per FRET citometria a flusso. Popolazione cellulare (A) e / singoletto doppietto (B) porte sono disegnate con citometria di flusso standard metodologia. Un falso cancello FRET (C) è tratto da cellule singolo-positive YFP per eliminare YFP bleedthrough nel filtro FRET. Un cancello FRET (D) è costruito da cellule trattate con liposomi vuoti, taleIn tale contesto FRET è ≥1%. Uno spostamento di popolazione nella gate FRET appare dopo il trattamento con materiale di seme-positivo (E) e lo spostamento diventa sempre più importante con una maggiore quantità di materiale di seme (F). Letture finali comprendono:. Cento FRET positività, mediana dell'intensità di fluorescenza (MFI) di eventi FRET-positivi, e la densità di FRET integrato (Integrated cellule FRET Densità = cento positivo * MFI) Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Progressione di attività seeding tau nei topi P301S 16. Attività di seeding (media ± SEM) da omogenati di cervello di topi P301S è evidente a 1,5 mesi nel tronco encefalico (A), Neocorteccia (B), lobo frontale (C), e nell'ippocampo (D). Tuttavia, l'attività seeding non è mai osservata nei topi knockout tau (> 12 mesi). Semina attività aumenta con l'età e precede la comparsa di altri marcatori istologici comuni, tra MC1, AT8, e PG5 (E). * Ristampato con il permesso di Holmes e Furman et al. 16 Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Compatibilità FRET citometria a flusso con campioni biologici umani 16. Quando le cellule del biosensore tau-RD-CFP / YFP sono trasdotte con 20 mg lisato cervello umano, robusto semina (media ± SEM) si verifica in tutti testati Diseà di Alzheimercervelli sé, mentre lisati di controllo della malattia pari età e di Huntington mancano attività di seeding. * Modificato da Holmes e Furman et al. 16 Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Le domande di FRET alternativi citometria a flusso 16. Neuroni primari trasdotte con la codifica lentivirus tau-PCP e tau-YFP costruisce. In assenza di semi esogeni non c'è aggregazione apparente (A), ma vi è in presenza di semi (B). Biosensori neuronali rispondono dose-dipendente di semi tau ricombinanti, anche in assenza di consegna fosfolipidi-mediata (C). Pre-incubazione di ricombinante (D) o biological (E) fonti di semi con l'eparina, un inibitore di HSPG mediata assorbimento seme tau, esaurisce FRET di risposta delle cellule biosensori HEK 293T. Display valutazione quantitativa (media ± SEM). * Modificato da Holmes e Furman et al. 16 Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Le linee cellulari utilizzate con FRET citometria a flusso. Cellule HEK 293T sono utilizzati per la citometria a flusso di installazione. Cellule singolo-positive della PCP vengono utilizzati per la compensazione (*). Cellule singolo-positive YFP vengono utilizzati per eliminare il segnale FRET falso a causa di attivazione diretta di YFP da 405 nm di eccitazione. CFP / YFP cellule dual-positive sono compatibili con FRET e servono comele cellule biosensore. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa tabella.
Tabella 2:. Citometro di flusso impostazioni laser e filtro Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa tabella.
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Discussion
Il sistema FRET citometria a flusso qui descritto è un potente strumento per valutare in modo rapido e quantitativamente l'attività tau seeding. Si richiede solo moderato esperienza coltura cellulare e una conoscenza di FRET e citometria a flusso. Altri saggi semina, come Thioflavin T - che espone migliorata fluorescenza quando si lega alla struttura foglietto beta - sono laboriosi e richiedono un puro, substrato proteina ricombinante. Inoltre, i test in vitro per la semina in tau sono solo semi-quantitativa e generalmente insensibile a livelli subnanomolari di materiale di seme 23,24. Fret citometria a flusso, tuttavia, fornisce una misura quantitativa e squisitamente sensibile di attività di seeding da campioni o ricombinanti o biologici. Inoltre, gli adattamenti alla procedura può rendere utile studiare una serie di disturbi di aggregazione proteica.
Mentre il protocollo qui descritto si concentra su tau semina, sono t necessari solo semplici modificheo consentire a un utente di monitorare l'attività di semina da tipi alternativi di semi proteopathic. Come dimostrato in Holmes e Furman et al., La creazione di una linea cellulare monoclonale che esprimono stabilmente α-sinucleina harboring il A53T mutazione associata a malattia tag a uno CFP o YFP abilitato il rilevamento sensibile di attività semina da full-length alfa-sinucleina fibrille ricombinanti 16 . Esperimenti simili sono stati condotti utilizzando cellule biosensori huntingtina, che rilevano anche efficacemente aggregazione proteica. Così, semplicemente modificando il biosensore proteine, Fret citometria a flusso è compatibile con numerose fonti di semi. Altre modifiche al test, tra cui paradigma di trattamento e il modello delle cellule, può essere usato per fare FRET citometria a flusso più applicabile alla valutazione meccanismi fisiologici. In questo protocollo, i semi sono stati introdotti direttamente nelle cellule biosensori via di trasduzione liposomi mediata come un modo per aumentare la sensibilità.
È importante nota, tuttavia, che questo non è un requisito. Tau aggrega da campioni biologici ricombinanti o mouse sono ancora in grado di semina di cellule biosensore in assenza di liposomi (Figura 5). Così, i laboratori interessati a studiare la propagazione fisiologico e / o meccanismi di assorbimento di semi tau può ancora utilizzare il test. Inoltre, FRET citometria a flusso è compatibile con colture primarie neuronali. Infettando cellule con costrutti lentivirali CFP- e YFP-codificati al momento della placcatura, efficiente reattività FRET è raggiunto a concentrazioni nanomolari seguito di trattamento con fibrille tau ricombinante, anche in assenza di liposomi (Figura 5). Presi insieme, questi dati indicano che il flusso citometria FRET è utile per studiare i meccanismi fisiologici di semina per una varietà di aggregati proteici e in diversi modelli di coltura cellulare.
Mentre il FRET citometria a flusso sistema è facile da usare e adattabile, alcuni passaggi chiave dovrebbero essereseguita per garantire la compatibilità, compresa la preparazione del campione e la corretta confluenza cella al momento del trattamento. Ad alta intensità sonda sonicazione dei campioni del cervello è fondamentale per un efficace e ottimale isolamento di attività di seeding. Durante lo sviluppo e l'ottimizzazione, è stato osservato che tale forma oltre 10 volte più efficace di isolare attività semina da cervello di topo P301S relativi ad altre tecniche comuni, ad esempio omogeneizzazione palmare. È possibile che molto grandi aggregati tau hanno una relativamente bassa propensione semina, e che la sonda sonicazione è più efficace per spezzare tali aggregati in frammenti più piccoli compatibili seme. Durata e frequenza della sonicazione possono essere modificati, se necessario, anche se le impostazioni sopra descritte sono raccomandate per rilevamento sensibile dell'attività semina.
Confluenza cellulare al momento del trattamento è di estrema importanza, in quanto riguarda sia la sensibilità e la salute delle cellule. Se le cellule di unre troppo confluenti, non prontamente occupano fosfolipidi e materiale di seme, in tal modo riducendo significativamente la sensibilità. Se confluenza è troppo bassa, l'aggiunta di fosfolipidi e materiale di seme può essere tossico. Prove empiriche mostrano che una confluenza del 60-65% biosensore è ottimale per il trattamento e la successiva risposta.
Come indicato nel protocollo, algoritmi di compensazione vengono regolarmente utilizzati per escludere CFP ricaduta nella YFP e FRET canali, eliminando falsi segnali e aumentando la sensibilità. Per una valutazione più rapida e qualitativa dell'attività semina, tuttavia, questo passo può essere omesso o eseguito post hoc utilizzando il software di analisi di citometria a flusso. Un segnale più pulito e più robusto si ottiene a seguito di compensazione, però, e quindi per l'analisi più rigorosa e quantitativa è altamente raccomandato questo passo.
Un limite del saggio è la sua incapacità di riferire sulla biochimica composizionei semi proteopathic. Il dosaggio misura corrente attività di seeding, una proprietà funzionale di semi. Determinazione della natura biochimica e biofisica dei semi richiederà accoppiamento saggi tradizionali come immunoprecipitazione, cromatografia, dicroismo circolare, spettrometria di massa, ecc Tuttavia, questo saggio sarà utile per valutare semina potenza come un endpoint da una miriade di campioni.
Questo test è stato recentemente utilizzato per quantificare e caratterizzare il timecourse di seeding sviluppo e la progressione nei topi P301S rispetto ad altri indicatori comuni di tau deposizione, come macchie istologiche. In questo studio, l'attività tau seeding è stato evidente nel corso di sei settimane prima del primo marcatore istologico (MC1) che abbiamo provato 16. Data la sua comparsa precoce, semina attività può rappresentare un importante supplementare, o anche alternativa, misura di esito per valutare l'efficacia degli interventi terapeutici, almeno per studi preliminari.Accorciando ciclo di trattamento e studiando giovani animali, le spese di alloggio e di tempi di lavorazione sperimentale diminuirà. È concepibile che terapeutica potrebbero essere somministrati a topi P301S a 4-6 settimane e cervelli valutati per l'attività di seeding 2-4 settimane più tardi. In alternativa, la valutazione di terapie anti-tau nelle cellule potrebbe essere eseguita in pochi giorni valutando la loro capacità di bloccare l'induzione dell'attività di semina in cellule biosensori, come mostrato nella Figura 5.
In conclusione, il flusso di FRET citometria di semina saggio è un modo semplice ed efficiente per rilevare tau semina da fonti ricombinanti o biologiche. La sua sensibilità è ineguagliabile da altri in tau vitro semina, e può essere impiegato per rilevare il primo cambiamento patologico in topi taupatia P301S. Inoltre, la sua flessibilità nel monitoraggio numerosi semi proteopathic in diverse condizioni di trattamento, e con più modelli di coltura cellulare, lo rende utile perqualsiasi laboratorio aggregazione proteica interessato a raccogliere rapidamente dati quantitativi.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TBS | Sigma | T5912 | |
| cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-free) | Roche | 4693159001 | |
| Cryo-vials | Sarstedt | 72.694.006 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 105DU | |
| Weighing Boats | Fisher Scientific | 13-735-743 | |
| 15 ml conical tube | USA Scientific | 1475-0501 | |
| Omni Sonic Ruptor Ultrasonic Homogenizer | Omni International | 18-000-115 | |
| Micro-Tip for Ultrasonic Homogenizer | Omni International | OR-T-156 | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A451 | |
| Noise Cancelling Ear Muffs | Fisher Scientific | 19-145-412 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | S47299 | |
| 1.5 ml tubes | USA Scientific | 1615-5510 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 000.215 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-136 | |
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| 50 ml Conical Tubes | Phenix Research | SS-PH15 | |
| 25 ml reagent resevoirs | VWR | 41428-954 | |
| Multi channel pipet | Fisher Scientific | TI13-690-049 | |
| 96 well flat bottom plates | Corning | 3603 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| 96 well round bottom plates | Corning | 3788 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED2SS | |
| HBSS | Life Technologies | 14185-052 | |
| Sorvall ST 40 Centrifuge | Thermo Scientific | 75004509 | |
| BIOLiner Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientific | 75003796 | |
| Hemacytometer | VWR | 15170-172 | |
| MACSQuant VYB Flow Cytomter | Miltenyi Biotec | 130-096-116 | |
| Chill 96 Rack | Miltenyi Biotec | 130-094-459 | |
| Flow Jo analysis software | Flow Jo | ||
| 20 μl pipet tips | Rainin | GPS-L10 | |
| 200 μl pipet tips | Rainin | GPS-250 | |
| 1 ml pipet tips | Rainin | GPS-1000 | |
| 200 μl pipet tips | USA Scientific | 1111-1800 | |
| 5 ml serological pipett | Phenix Research | SPG-606180 | |
| 10 ml serological pipett | Phenix Research | SPG-607180 | |
| 25 ml Serological pipett | Phenix Research | SPG-760180 |
References
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