Introduction
Ophobningen af intracellulære tau amyloider definerer tauopatier såsom Alzheimers sygdom. I tidlige stadier sygdom, patologi generelt lokaliseret til diskrete områder af hjernen, men med sygdomsprogression, patologi altid spredes langs forskellige neurale netværk 1-5. Akkumulere tyder transcellulær formering af giftige proteinaggregater ligger til grund for denne patologi (revideret i 6-10). I denne model er proteopathic frø (f.eks tau) frigives fra donorceller og indtast naboceller, omdanne native tau-protein i misfoldet form via template konformationsændring 11-15. Den her beskrevne assay blev udviklet til at påvise en sådan følsomt seeding. Den er kompatibel med rekombinant protein og biologiske prøver og muliggør kvantificering af små niveauer af proteopathic seeding aktivitet 16.
HEK 293T-celler, der stabilt udtrykker tau repeat domain (RD) indeholdende sygdomsassocieret P301S mutation fusioneret til enten CFP eller YFP (i det følgende benævnt tau-RD-CFP / YFP celler) fungere som en fast biosensor podningstidspunktet aktivitet. I mangel af proteopathic frø, cellerne fastholde tau som en opløselig monomer, og har ingen mærkbar baggrund FRET. Spontan optagelse eller liposommedieret transduktion af tau frø i celler resulterer imidlertid i RD-CFP og RD-YFP aggregering, som frembringer et FRET signal, der er målt inden for de enkelte celler via flowcytometri.
Talrige elementer i dette assay blev fremstillet til at øge følsomheden og reducere variabilitet. Et monoklonalt cellelinje med en 1: 1 RD-CFP / YFP udtryk forholdet blev valgt, da den giver optimal signal: støj. For at øge følsomheden, er phospholipider anvendes til at indføre frøene direkte ind i celler (selvom at studere biologiske mekanismer af optagelse, kan dette punkt udelades). Endelig flowcytometri skærme FRET på populationen og en enkelt celle niveau, i modsætning til andre proteinaggregering assays. Det endelige resultat foranstaltning, integreret FRET densitet, er meget kvantitativ og redegørelser for både antallet af celler med aggregering og i hvilken grad aggregering er opstået inden for hver celle. Alle disse optimerede parametre forbedre følsomheden og sikre reproducerbarhed.
Dette system blev for nylig ansat i en omfattende undersøgelse i transgene P301S tauopati mus 17, der evaluerede den tidsmæssige debut og progression af tau såning aktivitet i forhold til andre almindeligt anvendte tau patologiske markører (f.eks MC1, AT8, PG5 og ThioflavinS). Seeding er langt den tidligste og mest robuste markering af tau patologi vurderes, forud histologisk påvisning af mindst 6 uger. Såning aktivitet vises ved 1,5 måneder og stiger gradvist med alderen, hvilket tyder på en kausal rolle proteopathic frø i starten og / eller progression af neurodegeneration 16.
e_content "> Præcis kvantificering af små niveauer af frø materiale fra biologiske prøver kan fremme undersøgelser, der overvåger tidligt sygdomsprogression. Ved at forkorte retssagen varighed og muliggør brug af yngre dyr, kan det øge effektiviteten og nøjagtigheden af prækliniske dyreforsøg. For eksempel i den P301S musen tidligere beskrevet, kunne blyforbindelser leveres så tidligt som 4-6 uger (umiddelbart før eller i starten af såning aktivitet), og overvåges for effektivitet 2-4 uger senere. Analysen bør nøjagtigt kvantificere eventuelle nedsættelser i såning FRET flowcytometri har kan testes hurtigt for deres evne til at blokere såning induktion direkte i kultur, enten ved hjælp af rekombinant tau in vitro screening ansøgninger. For eksempel anti-tau reagenser (f.eks, antistoffer, små molekyler, osv) aktivitet. aggregater eller hjerne-afledt lysater som frøkilde (figur 5). Med denne opsætning, når podemateriale fremstilles en exeksperimentere tager kun tre dage til at fuldføre, herunder dataanalyse. Den hurtige kvantificering af proteopathic såning aktivitet kan således fremme mange undersøgelser af neurodegeneration.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Denne protokol lægger vægt på brugen af FRET flowcytometri til påvisning seeding fra muse biologiske prøver. Det er også kompatibel med rekombinante fibriller og humane biologiske prøver. Mus eutanasi og hjerne høst blev udført i overensstemmelse med IACUC-godkendte procedurer.
1. Brain Extraction
- Efter dyb bedøvelse med isofluran (2%), perfundere en mus med iskold PBS indeholdende 0,03% heparin og ekstraher hjernen efter detaljerne beskrevet i Gage et al. 18
- Placer ekstraheret væv i et cryo-hætteglas, og snap fryse ved at placere i flydende nitrogen. Alternativt fryse væv på tøris. Når frosset, overføre vævet til -80 ° C og opbevares i en længere periode, hvis det er nødvendigt.
BEMÆRK: Denne protokol er kompatibel med hele hjernehomogenater eller mikroorganismer-dissekeret hjerneregioner. Se Hagihara et al. For en detaljeret mikro-dissektion protokol 19. 2. Udarbejdelse af Biologisk læggemateriale - Forbered homogeniseringsbuffer ved at opløse proteasehæmmere (EDTA) over i 1x TBS (1 tablet per 10 ml). Vortex kraftigt, og opbevar på is. Proteaseinhibitorer skal være frie EDTA for at bevare biosensor cellelevedygtighed.
- Frosne hjernevæv afvejes i en disponibel vejer båd, og overføre til et 5 ml konisk rør. Tilføj iskold homogeniseringsbuffer således at den endelige løsning er 10% vægt / volumen. Midlertidig lagring på is. Vævsmasse og efterfølgende homogenisering pufferrumfang vil variere afhængigt af hjernens størrelse og / eller regioner anvendes. Her er en voksen mus hemibrain vejer 0,2 g suspenderet i 2 ml til en 10% vægt / vol opløsning.
- Overfør prøver i et koldt rum, og justere en sonde sonikator til de relevante indstillinger. For probesonikering med en Omni Ruptor (vist her), indstille effekt til 20%, hvilket svarer til ca. 75 W. Brug en puls-funktion til at sikre prøverne er ikke over-opvarmet under lydbehandling. Indstil impulsgiver til 30%, svarende til ca. 500 msek.
- Rens spidsen af probesonikator ved skylning med vand, isopropanol og vand igen, aftørring sonden mellem hver opløsning. Vær sikker på at skylle og tørre begge sider og bund af sonden med lab-klude.
- Arbejde med én prøve ad gangen, nedsænkes probespidsen i homogeniseringsbufferen, og start sonikator. Brug af magt og Pulser indstillinger er beskrevet ovenfor, levere 25 total pulser. Sørg for, at vævet er helt i suspension. Vær omhyggelig med at undgå skumning af prøven i dette trin.
BEMÆRK: Prøver er modtagelige for skumning hvis a) det samlede volumen er lav eller b) homogenatet varmer op. Med denne specifikke instrument, ikke sonikeres med mængder mindre end 250 pi. For at sikre prøver bo kølet, kan rørene opbevaret på is under dette trin. - Rengør sonden ved at tørre væk resterende lysat, derefter levere 10 pulser i et bæger of rent vand. Skyl siderne og bunden af sonden med vand, isopropanol og vand igen (som i trin 2.4), tørre tørre mellem hvert trin. For at undgå forurening, grundigt skylles sonden i mellem prøverne.
BEMÆRK: Med tau-aggregater, vi har ikke fundet, at strengere rengøringsmetoder er nødvendige for at forhindre prøve-til-prøve kontaminering. Andre amyloider kan dog kræve yderligere pleje, som er blevet grundigt beskrevet i litteraturen 20,21. - Store homogenater på is indtil alle prøver er blevet behandlet.
- Spin homogenater ved 21.300 xg i 15 minutter ved 4 ° C.
- Overfør supernatanten til et rent rør, pas på ikke at forstyrre bundfaldet. Kassér pellet. Alikvot supernatanten, og gemme lysater ved -80 ° C til yderligere anvendelse. Undgå fryse / tø cyklusser af homogenaterne imidlertid, da dette reducerer seeding effektivitet.
- I et sterilt miljø, aspireres dyrkningsmedium. Skyl celler med varmt PBS, og aspirer. Trypsinisér celler (3 ml trypsin-EDTA (0,05%)) i 3 minutter, stands med varmt kulturmedium (9 ml DMEM, 10% FBS, 1% pen / strep, 1% GlutaMax) og straks overføre cellerne til et konisk rør.
- Centrifuger cellerne ved 1000 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Aspirer medium og resuspender cellepelleten i varmt dyrkningsmedium.
- Anvendelse af et hæmocytometer, bestemme celletætheden for hver cellelinie. Celledensitet vil variere afhængigt af konfluens på tidspunktet for høst og resuspension volumen. Resuspender cellerne høstet fra en 10 cm skål ved 90% konfluens i 10 ml medier, celledensitet til ca. 1 million celler / ml.
- Laveen master blanding af celler + medier, således at hver brønd i en plade med 96 brønde vil indeholde 35.000 celler i 130 pi medie (fx til at en master mix for 100 brønde, resuspender 3,5 millioner celler i 13 ml medium). Ændre celletallet til at passe individuelle forsøgsdesign og tidsfrister. For cellebehandling ~ 18 timer efter udpladning tilsættes 35.000 celler til hver brønd i en 96-brønds plade.
- Ved hjælp af en multi-kanal pipette, langsomt pipette 130 pi masterblanding cellesuspension i hver brønd i en fladbundet vævskultur-behandlet 96-brønds plade. Mens plating, placere pipettespidsen i centrum af brønden, ikke rører bunden af pladen.
BEMÆRK: Selvom plating format kan ændres, hvilket gør n = 4 brønde for hver af cellelinier 1-3 per plade anbefales. Den resterende del af pladen (n = 84) er forbeholdt cellelinie # 4 (biosensor celler). - Lade cellerne afregne ved at lade pladen uforstyrret i 10 minutter ved stuetemperatur. Inkuber O / N ved 37 ° C, 5% CO2, og &# 8805; 80% relativ fugtighed.
- I et rør, kombinere transfektionsreagens, såsom Lipofectamin, med reduceret serum medier, såsom Opti-MEM, at gøre en master mix. Per godt, tilsættes 1,25 pi transfektionsreagens og 8,75 pi reduceret serummedium. Flick røret forsigtigt for at blande kortvarigt spin ned, og der inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
- I et andet rør, kombinere podemateriale (portion af lysat fra trin 2.9) med reduceret serummedium.
BEMÆRK: Volumen af podemateriale vil variere i overensstemmelse med den enkelte eksperiment. Når du vælger frø volumen, tage i betragtning: overflod af frø i en prøve og potentielle toksicitet. Rå homogenater kan være toksiske for celler. Som sådan, skal du bruge den lavest mulige volumen til at overvåge din ønskede effekt. Tidligere testede volumener lysat / brønd område frabout 1-5 pi, svarende til 5-20 pg totalt protein. Sørg for, at den samlede mængde per brønd (frø + reduceret serum medier) er 10 pi. - Kombiner indhold fra de to rør, der er beskrevet i 4.1 og 4.2, svirp forsigtigt for at blande, kortvarigt spinde ned (1000 xg, 5 sek), og inkuberes ved stuetemperatur i mindst 20 minutter og op til 2 timer.
- Forsigtigt pipette 20 pi transduktion kompleks på den side af individuelle biosensor brønde. Brug tre tekniske gentagelser, hvis det er muligt. Retur behandlede celler til inkubatoren i 24-48 timer. Inkuber under de samme betingelser som beskrevet i trin 3.6.
BEMÆRK: fald en betingelse for denne opsætning kontrol biosensor celler behandlet med tomme liposomer (dvs. liposom-reagens + nedsat serum medie), fordi anvendelsen af phospholipider indfører en lille forskydning i fluorescens profil i forhold til biosensor celler ueksponerede til liposom-reagens. - Ved hjælp af en multi-kanal pipette, suge al celle medium (150 ul). Trypsinisér (50 pi) celler i 5 minutter, og stands med 150 pi kølet dyrkningsmedium. Må ikke indeholde en PBS skyl før trypsinering på dette trin, da det kan forårsage celle løft og efterfølgende tab celle. Udelukke enhver kontaminerende døde celler og snavs under flowcytometri via gating strategier.
- Umiddelbart efter standsning, overførsel celler til en 96-brønds rundbundet plade, og der centrifugeres ved 1000 xg i 5 min ved stuetemperatur.
- Aspirer og kassér medium, idet man undgå at forstyrre cellepelleten.
- Forsigtigt, men grundigt, resuspendere cellepelleten i 50 pi 2% paraformaldehyd, og inkuberes i 10 minutter. Alternativt kører celler lever, selv om fiksering giver renere og mere ensartede resultater.
- Centrifuger cellerne ved 1000 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Aspirer og kassér paraformaldehyd, idet man undgå at forstyrre cellepelleten.
- Forsigtigt, men grundigt, resuspender cellepelleten i 200 pi kølet flowcytometri buffer (HBSS, 1% FBS, 1 mM EDTA) og køre pladen så hurtigt som muligt for at undgå sammenklumpning celle.
- Lav en Side Scatter-Area (SSC-A) vs Forward Scatter-Area (FSC-A) bivariate plot, og med cellelinje # 1 kører, justere SSC og FSC spændinger indtil cellen befolkningen er i nederste venstre kvadrant. Klik polygonen værktøj, og definere cellepopulationen (Gate P1). For alle parametre gating se figur 2.
- Lav en FSC-H (højde) versus FSC-A bivariate plot, og anvende Gate P1 til dette plot ved at klikke på "live" over plottet, og vælge P1. Med cellelinie # 1kører, skal du klikke på polygonen værktøj, og definere enkelte celler (Gate P2).
- Lav 3 histogram plots, en for hver af de filtre af interesse: fælles fiskeripolitik, YFP, og FRET. Påfør Gate P2 til alle disse grunde ved at klikke på "live" over parceller, og vælge P2. Med cellelinje # 1 kører, justere spændinger, således at den mediane cellepopulation i den fælles fiskeripolitik, YFP, og FRET histogrammer er alle mellem 0 og 1. For at måle fælles fiskeripolitik og FRET, ophidse celler med 405 nm laser, og fange fluorescens med en 450/50 nm og 525/50 nm filter hhv. For at måle YFP, ophidse celler med en 488 nm laser og fange fluorescens med et 525/50 nm filter. Laser og filterindstillinger er yderligere beskrevet i tabel 2.
- Udfør kompensation for den fælles fiskeripolitik afsmittende i FRET og YFP kanaler.
BEMÆRK: Erstatning er processen med fluorescens spillover korrektion. Fluorescens afsmittende opstår, når fluorescensemissionen ene fluorokrom detekteres inden for et filter designed at måle signalet fra en anden fluorokrom. Med korrekt kompensation, kan den fælles fiskeripolitik afsmittende fluorescens fjernes fra FRET og YFP kanaler.
BEMÆRK: Erstatning kræver tilstedeværelse af både fluorescens -positive og -negative celler. Således at kompensere på celler CFP-positive (cellelinie 2 #), negative celler (cellelinje # 1) skal tilsættes til prøven før kørslen.- Spike i 30 ul cellelinje # 1 suspension fra en enkelt brønd i 200 pi cellelinie # 2 suspension umiddelbart før kompensere.
- Klik på "Instrument Settings" ikonet, derefter fanen 'kompensation «, og tjek' matrix 'for at åbne den erstatning bordet.
- Lav en FRET-A vs CFP-A afsætning med to variabler og anvende porten P2, som beskrevet i trin 6.3. Med cellelinjer 1 + 2 kører, skal du klikke på 'kvadrant' ikon og trække kvadranter således at fluorescens -negative og -positive befolkninger er adskilt af de nederste to kvadranter (Gates LL3 ennd LR3 henholdsvis).
- Opret en statistik tabel, der viser den mediane fluorescensintensitet (MFI) i FRET for LL3 og LR3 porte. Juster parameteren FRET i kompensation matrix indtil MFI af signalet FRET svarer mellem LL3 og LR3. Efter dette trin, MFI af signalet FRET er lig mellem ufarvede celler og CFP-positive celler, hvilket antyder fravær af FFP afsmittende i FRET kanalen.
- Lav en YFP-A vs CFP-A afsætning med to variabler og anvende porten P2, som beskrevet i trin 6.3. Tegn kvadranter (LL4 og LR4) svarende til det gøres i trin 6.4.3.
- Opret en statistik tabel, der viser MFI af YFP for LL4 og LR4. Juster YFP parameter i kompensation matrix indtil MFI af YFP-signalet svarer mellem LL4 og LR4. Efter dette trin, MFI af et YFP signal er lig mellem ufarvede celler og CFP-positive celler, hvilket antyder fravær af FFP afsmittende i YFP kanal.
- Follgrund gate opsætning og kompensation, fremhæve brønde af interesse og køre resten af pladen.
- Når alle prøver er blevet kørt, eksport datafiler ved at klikke på 'Filer', derefter 'kopi'. Vælg fanen 'datafiler «, markere eksperimentet mappe, og klik på' kopi '.
- Åbne FCS filer i flowcytometri analyseprogram.
- Baseret på scatter egenskaber, bruge en polygonal gate at definere cellepopulationen (SSC vs FSC) og singlet population (FSC-H vs FSC-A) fra celler behandlet med tomme liposomer, på lignende måde som beskrevet i afsnit 6.
- Hvis kompensation fælles fiskeripolitik blev udført under opsætningen, ikke længere justere fælles fiskeripolitik.
- Opret en FRET vs YFP bivariate plot. Brug cellelinie # 3Definere en falsk FRET gate ved at tegne en polygonal port, der løber langs hældningen af FRET-positive cellepopulation. Porten udelukker YFP enkelt-positive celler, der udsender et signal i FRET filter og trækkes ligner den tidligere vist ved at forbyde et al. 22
- Definer en FRET port ved at plotte tomme liposombaserede behandlet fælles fiskeripolitik / YFP celler på en FRET vs FFP bivariate plot. Indføre en polygonal gate langs hældningen af befolkningen, der strækker sig opad og mod venstre væk fra befolkningen. Porten bør udelukke de fleste celler (~ 99%), således at baggrunden FRET ≥1% af cellerne. Eventuelle begivenheder, flytte ind i denne port betragtes FRET-positiv.
BEMÆRK: Hver enkelt port er beskrevet ovenfor anvendes på alle prøver før konstruere efterfølgende porte. Følgende analyse, er fire individuelle porte defineret (Cell befolkning singlet, falsk FRET; FRET). - Optag analyseparametre af interesse, herunder: procent FRET positivitet og MFIaf FRET-positive celler. Manuelt beregne den integrerede FRET tæthed ved at måle produktet af procent positivitet og MFI.
BEMÆRK: Hvis integreret FRET densitet anvendes som en parameter, indstille baggrunden FRET (som defineret i trin 7.5) og MFI større end eller lig med 1 for at undgå at beregne et produkt, der er mindre end de to individuelle faktorer.
3. -genudpladning Biosensor Cells
NOTE:Brug fire cellelinjer til denne analyse: HEK 293T (cellelinje # 1), RD-P301S-CFP (cellelinje 2 #), RD-P301S-YFP (cellelinje 3 #), og RD-P301S-CFP / YFP ( cellelinie # 4). Referere venligst Tabel 1 for hver cellelinje bidrag til analysen.
4. Behandling Celler
BEMÆRK: følgende dag, hvor tau biosensor celler er 60-65% sammenflydende, forberede frø transduktion komplekser som følger:
5. Høst Celler til FRET flowcytometri
6. FRET flowcytometri
BEMÆRK: Brug et flowcytometer såsom MACSQuant výber, som er udstyret med FRET-kompatible laser linjer og filtersæt (tabel 2). For hvert skridt i denne sektion, skal du klikke brønden af interesse ved hjælp af softwarens 96 brønde skabelon, og klik"Play" for at begynde prøven optagelse og flow. Foretag plots eller statistikker tabeller ved at klikke på 'ny analyse vinduet' ikon. Skift akse parametre på de enkelte bivariate parceller ved at klikke på titlen på enten X eller Y-aksen og vælge den passende filter. At flytte cellepopulationer eller fluorescenssignaler, øge eller mindske spændingerne forbundet med de passende filtre. Med dette instrument, køre <1,000 hændelser / sek for at sikre præcis overvågning enkelt celle.
7. Dataanalyse
BEMÆRK: Skift akse parametre på de enkelte bivariate parceller ved at klikke på titlen på enten X eller Y-aksen og vælge den passende filter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FRET flowcytometri muliggør følsom, kvantitativ og hurtig påvisning af såning aktivitet fra rekombinante eller biologiske prøver. Assay opsætningen er facile: monoklonale-afledte stabile cellelinjer, der udtrykker tau-RD-CFP / YFP transduceres med frømateriale, inkuberet i 24-48 timer og underkastet flowcytometri analyse (figur 1A). I mangel af frø, biosensor celler opretholde tau i en opløselig, monomer form (figur 1B). I nærvær af frø, dog biosensor celler konvertere tau i en aggregeret tilstand (figur 1C), der producerer en FRET respons, der detekteres på en per-celle-basis med flowcytometri. Kvantitativ vurdering viser, at biosensor celler reagere på femtomolær koncentrationer af frø materiale, og at såning aktivitet kan effektivt målt over tre størrelsesordener (figur 1D).
Gating parametre blev etableret for at sikre påvisning af en stue FRET signal, selv ved lave koncentrationer frø. Først standard gating metoder anvendes til isolering af cellepopulationen (figur 2A) og enkelte celler (figur 2B). Falsk FRET signalet kan opstå fra direkte aktivering af YFP ved 405 nm laser. Således er en falsk FRET gate trækkes fra en enkelt YFP-positive cellepopulation at udelukke kontaminerende signal (figur 2C). Sidst, er FRET gate defineret ud fra podede FFP / YFP dobbelt-positive celler (figur 2D). En port trækkes tæt hældningen af befolkningen, der strækker sig opad og mod venstre væk fra det. Ikke-stimulerede celler skal have en baggrund FRET værdi indstilles til ca. 1%, og FRET-positive celler vil skifte til denne port på en dosis-afhængig måde (sammenlign figur 2E og 2F). Flere parametre tages i betragtning med FRET flowcytometri, herunder: procent positivitet (dvs. antallet af FRET-positive celler pr samlede celletal) Og gennemsnitlig fluorescensintensitet (dvs. i hvilken grad et FRET respons er produceret i en FRET-positive celle). Integreret FRET massefylde er det foretrukne endepunkt, som det er produktet af disse to variabler og fuldstændigt repræsenterer graden af podning aktivitet induceret af en given prøve.
FRET flowcytometri er kompatibel med P301S tauopati museafledt hjerne lysater, selv ved unge alder, som vist på figur 3. Efter mikrodissektion af fire forskellige hjerneregioner, FRET flowcytometri blev anvendt til måling såning aktivitet fra hjernestammen (Figur 3A), neocortex (figur 3B), frontal lobe (figur 3C) og hippocampus (figur 3D) i P301S mus over en række aldre. I hver region, såning aktivitet steg med alderen, og optrådte på blot 1,5 måneder. Men tau knockout-mus ("KO")> 12 MOS aldrig vist seeding. Sammenlignet med histological analyser udført inden for de samme dyr, er dette seks uger hurtigere end forekomsten af enhver anden markør for tau udfældning (figur 3E), herunder markører for konformationelt afvigende tau (MC1), hyperphosphoryleret tau (AT8 og PG5) og amyloid konformation (ThioflavinS). Fra et mekanistisk opfattelse, den proksimale påvisning af tau såning aktivitet antyder frø som en kausal formidler af tauopati debut og / eller progression. Fra en eksperimentel visning, dette tyder på, at analysen af såning aktivitet kan være en ideel supplement til standard resultatmål af tau aflejring, givet sin tidlige og robust udseende.
Ud over transgene mus, FRET flowcytometri er forenelige med den menneskelige hjerne lysater og kan let påvise tau aggregater isoleret fra Alzheimers sygdom forsøgspersoner (figur 4). Når frosset humant hjernevæv homogeniseres på samme måde som beskrevet her for P301S hjernen lysater, seedinger robust detekteret fra alle prøver afledt af AD emner. I modsætning hertil er såning aktivitet aldrig påvist fra lysater af aldersmatchede eller Huntingtons sygdom kontrolpersoner. Dette understreger specificiteten af analysen for tau aggregater.
Mens fokus i denne artikel er følsom detektion af tau såning aktivitet under anvendelse af liposommedieret levering af aggregater i HEK 293T biosensor celler, kan mere fysiologiske cellekultur paradigmer også udføres med FRET flowcytometri til at vurdere basale cellulære optagelse mekanismer. For eksempel kan primære neuronkulturer være inficeret med lentivirus udtrykker tau-RD-CFP og tau-RD-YFP-konstruktioner på tidspunktet for plettering. På DIV4, aggregering er fraværende i ubehandlede celler (figur 5A), men påvises i neuroner behandlet med frø-holdigt materiale (figur 5B). Det er vigtigt, er phospholipider udelukkes i disse forsøg, hvilket tillader undersøgelse af fysiologiske og dup hophysiological seeding mekanismer. Således anvendelsen af tau fibriller fører til neuronal HSPG-medieret optagelse og stimulerer aggregation i en dosisafhængig måde, der kan kvantificeres med FRET flowcytometri (figur 5C). Derudover kan assayet anvendes til terapeutisk vurdering af tau optagelse og såning blokade in vitro under anvendelse HEK 293T tau biosensor celler. Selv i mangel af fosfolipider, både rekombinante fibriller (figur 5D) og P301S hjerne lysater (figur 5E) fremkalde tau sammenlægning. Præinkubation af disse tau frø med heparin (tidligere vist sig at være en potent inhibitor af HSPG-medieret tau optagelse), eliminerer imidlertid deres såning kapacitet. Denne forsøgsopstilling kunne anvendes på et hvilket som helst lægemiddel (f.eks, antistoffer, små molekyler, etc.) og ville muliggøre en hurtig vurdering af optagelse og / eller frø-modificerende lægemidler.
gur 1 "src =" / files / ftp_upload / 53205 / 53205fig1.jpg "/>
Figur 1. FRET flowcytometri følsomt registrerer tau seeding 16. Monoclonal HEK 293T-celler, der udtrykker tau-RD-CFP / YFP blev transduceret med rekombinante eller biologiske prøver, inkuberet i 24-48 timer og analyseret på en enkelt celle-basis under anvendelse af flowcytometri (A). Ikke-stimulerede celler opretholde tau-RD i en monomer tilstand (B), hvorimod celler behandlet med frø-holdigt materiale display fremtrædende indeslutninger (C). Kvantitativ vurdering (gennemsnit ± SEM) i såning aktivitet viser, at ærgre flowcytometri er følsom over for femtomolær koncentrationer (monomer tilsvarende) af rekombinant læggemateriale og detektion strækker sig over tre størrelsesordener (D). Monomer tilsvarende repræsenterer det samlede mængde protein indeholdt i fibrillization reaktion og ikke korrigere for den ufuldstændige &# 160; inkorporering af monomer i aggregeret materiale. Således skal koncentrationen af faktiske aggregater (frø) være mindre end eller lig med dens »monomer tilsvarende«. * Modificeret fra Holmes og Furman et al. 16 Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. gating strategi for FRET flowcytometri. Cellepopulation (A) og singlet / dublet (B) porte er tegnet med standard flowcytometri metode. En falsk FRET port (C) trækkes fra YFP single-positive celler at eliminere YFP bleedthrough i FRET filter. En FRET port (D) er konstrueret af tomme liposom-behandlede celler, såsomdenne baggrund FRET er ≥1%. En befolkning skift i FRET porten vises efter behandling med frø-positivt materiale (E) og skiftet bliver stadig mere fremtrædende med større mængder af frø materiale (F). Endelige udlæsninger omfatter:. Procent FRET positivitet, median fluorescensintensitet (MFI) i FRET-positive begivenheder, og den integrerede FRET densitet (Integrated FRET Density = Procent positive celler * MFI) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Progression af tau såning aktivitet i P301S mus 16. Såning aktivitet (gennemsnit ± SEM) fra hjernehomogenater af P301S mus fremgår på 1,5 måneder i hjernestammen (A), Neocortex (B), frontal lobe (C), og hippocampus (D). Imidlertid er såning aktivitet aldrig observeret i tau knockout-mus (> 12 måneder). Seeding aktivitet stiger med alderen, og går forud for fremkomsten af andre fælles histologiske markører, herunder MC1, AT8 og PG5 (E). * Genoptrykt med tilladelse fra Holmes og Furman et al. 16 Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. forenelighed FRET flowcytometri med humane biologiske prøver 16. Når tau-RD-CFP / YFP biosensor celler transduceres med 20 pg menneskelige hjerne lysat, robust såning (gennemsnit ± SEM) forekommer i alle testede Alzheimers diseaSE hjerner, mens alderskategori og Huntingtons sygdom kontrol lysater mangler såning aktivitet. * Modificeret fra Holmes og Furman et al. 16 Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Alternative applikationer til FRET flowcytometri 16. Primære neuroner transduceret med lentivirus kodning tau-fælles fiskeripolitik og tau-YFP konstruktioner. I fravær af exogene frø der er ingen tilsyneladende aggregering (A), men der er i nærvær af frø (B). Neuronale biosensorer svare dosisafhængigt rekombinante tau frø, selv i fravær af phospholipid-leveringsanordning (C). Præinkubation af rekombinant (D) eller bigiske (E) frøkilder med heparin, en inhibitor af HSPG-medieret tau frø optagelse, udtømmer FRET reaktionsevne HEK 293T biosensor celler. Kvantitativ vurdering skærme (gennemsnit ± SEM). * Modificeret fra Holmes og Furman et al. 16 Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1: Anvendte cellelinjer med FRET flowcytometri. HEK 293T celler anvendes til flowcytometri setup. FFP single-positive celler anvendes til kompensation (*). YFP single-positive celler anvendes til at eliminere falske FRET signal på grund af direkte aktivering af YFP ved 405 nm excitation. CFP / YFP dobbelt-positive celler er FRET-kompatible og tjene somde biosensor celler. Klik her for at se en større version af denne tabel.
Tabel 2:. Flowcytometer laser og filterindstillinger Klik her for at se en større version af denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FRET flowcytometri her beskrevne system er et kraftfuldt værktøj til hurtigt og kvantitativt at vurdere tau seeding. Det kræver kun moderat cellekultur erfaring og et praktisk kendskab til FRET og flowcytometri. Andre seeding assays, såsom thioflavin T-- som udviser forbedret fluorescens, når de er bundet til beta-sheet struktur - er besværlig og kræver en ren, rekombinant protein substrat. Derudover in vitro såning analyser for tau er kun semi-kvantitativ og generelt ufølsom for subnanomolære niveauer af læggemateriale 23,24. Fret flowcytometri, giver dog en kvantitativ og udsøgt følsomme mål for såning aktivitet fra enten rekombinante eller biologiske prøver. Endvidere kan tilpasninger til den procedure gør det nyttigt at studere en række proteinaggregering lidelser.
Mens protokollen beskrevet heri fokuserer på tau såning, kræves kun simple modifikationer to gøre en bruger at overvåge seeding fra alternative typer proteopathic frø. Som vist i Holmes og Furman et al., Oprettelse af et monoklonalt cellelinje stabilt udtrykker α-synuclein huser sygdomstilstanden associeret A53T mutation tagget til enten CFP eller YFP aktiveret følsom påvisning af seeding fra fuld-længde a-synuclein rekombinante fibriller 16 . Lignende forsøg er blevet udført under anvendelse af huntingtin biosensor celler, som også effektivt at påvise protein aggregation. Således ved blot at modificere proteinet biosensor, FRET flowcytometri er kompatibelt med mange frøkilder. Andre modifikationer af assayet, herunder behandling paradigme og celle model kan anvendes til at fremstille FRET flowcytometri mere anvendelig til vurdering af fysiologiske mekanismer. I denne protokol, blev frø indføres direkte i biosensor celler via liposom-medieret transduktion som en måde at øge følsomheden.
Det er vigtigt at nOTE imidlertid, at dette ikke er et krav. Tau aggregater fra rekombinante eller mus biologiske prøver er stadig i stand til såning biosensor celler i fravær af liposomer (figur 5). Således laboratorier interesseret i at studere fysiologiske formering og / eller optagelsesmekanismer af tau frø stadig kan anvende assayet. Derudover FRET flowcytometri er kompatibel med primære neuronale kulturer. Ved at inficere celler med CFP- og YFP-kodede lentivirale konstruktioner på tidspunktet for udpladning, er effektiv reaktionsevne FRET opnået ved nanomolære koncentrationer efter behandling med rekombinant tau fibriller, selv i fravær af liposomer (figur 5). Tilsammen indikerer disse data, at FRET flowcytometri er nyttig til at studere fysiologiske mekanismer af podning af en række proteinaggregater og flere cellekulturmodeller.
Mens FRET flowcytometri systemet er brugervenligt og kan tilpasses, bør visse centrale trin værefølges for at sikre kompatibilitet, herunder prøveforberedelse og korrekt cellekonfluens på tidspunktet for behandlingen. Høj intensitet ultralydbehandling i hjernen prøver er kritisk for en effektiv og optimal isolering af seeding. Under udvikling og optimering, blev det observeret, at denne metode er mere end 10 gange mere effektive til at isolere såning aktivitet fra P301S musehjerner i forhold til andre almindelige teknikker, f.eks håndholdte homogenisering. Det er muligt at meget store tau aggregater har en relativt lav tilbøjelighed seeding, og at probesonikering er mest effektiv for at bryde disse aggregater i mindre, frø-kompatibel fragmenter. Varighed og hyppighed af lydbehandling kan ændres om nødvendigt, selv om de indstillinger, der er beskrevet ovenfor, anbefales til følsom detektion af såning aktivitet.
Cellekonfluens på tidspunktet for behandling er også af yderste vigtighed, da det påvirker både følsomheden og celle sundhed. Hvis celler etre for sammenflydende, de ikke let optager phospholipider og podemateriale, hvorved dramatisk faldende følsomhed. Hvis konfluens er for lav, kan tilsætning af phospholipider og podemateriale være giftige. Empirisk afprøvning viser, at en biosensor konfluens på 60-65% er optimalt til behandling og efterfølgende respons.
Som nævnt i protokollen, er kompensation algoritmer anvendes regelmæssigt til at udelukke den fælles fiskeripolitik afsmittende i YFP og FRET kanaler, hvilket eliminerer falske signaler og øge følsomheden. For en hurtigere og kvalitativ vurdering af såning aktivitet, men dette trin kan udelades eller udføres post hoc anvendelse af flowcytometri analyse software. En renere og mere robust signal opnås følgende kompensation, dog, og dermed for den strengeste og kvantitativ analyse dette trin er stærkt anbefales.
En begrænsning af analysen er dens manglende evne til at rapportere om den biokemiske sammensætningde proteopathic frø. Den nuværende assay måler seeding, en funktionel egenskab af frø. Bestemmelse af biokemiske og biofysiske aktivitet af frøene vil kræve kobling til traditionelle assays, såsom immunopræcipitation, kromatografi, cirkulær dikroisme, massespektrometri, etc. Ikke desto mindre vil dette assay være nyttigt at evaluere podning styrke som et slutpunkt fra talrige prøver.
Denne analyse blev for nylig anvendt til at kvantificere og karakterisere tidsforløbet for såning udvikling og progression i P301S mus i forhold til andre almindelige markører for tau deposition, såsom histologiske pletter. I denne undersøgelse var tau såning aktivitet tilsyneladende over seks uger før den tidligste histologiske markør (MC1), som vi testede 16. På grund af sin tidlige udseende, kan såning aktivitet udgør et vigtigt supplerende eller endog alternativ, effektmål til vurdering af effekten af terapeutiske indgreb, i det mindste for forundersøgelser.Ved at afkorte behandlingsforløb og studere yngre dyr, boligudgifter og eksperimenterende behandlingstid vil falde. Det er tænkeligt, at terapeutiske kunne administreres til mus ved P301S 4-6 uger og hjerner evalueret for seeding 2-4 uger senere. Alternativt kunne evaluering af anti-tau terapeutika i celler udføres inden for få dage ved at vurdere deres evne til at blokere induktion af seeding i biosensor-celler, som vist i figur 5.
Afslutningsvis FRET flowcytometri såning assay er en nem og effektiv måde at detektere tau såning fra rekombinante eller biologiske kilder. Dens følsomhed er uden sidestykke af andre in vitro tau seeding assays, og det kan anvendes til at detektere den tidligste patologiske ændringer i P301S tauopati mus. Endvidere dens fleksibilitet i overvågningen talrige proteopathic frø under forskellige behandlingsbetingelser og med flere cellekulturmodeller, gør den anvendelig tilenhver proteinaggregering laboratorium interesseret i hurtigt at indsamle kvantitative data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TBS | Sigma | T5912 | |
| cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-free) | Roche | 4693159001 | |
| Cryo-vials | Sarstedt | 72.694.006 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 105DU | |
| Weighing Boats | Fisher Scientific | 13-735-743 | |
| 15 ml conical tube | USA Scientific | 1475-0501 | |
| Omni Sonic Ruptor Ultrasonic Homogenizer | Omni International | 18-000-115 | |
| Micro-Tip for Ultrasonic Homogenizer | Omni International | OR-T-156 | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A451 | |
| Noise Cancelling Ear Muffs | Fisher Scientific | 19-145-412 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | S47299 | |
| 1.5 ml tubes | USA Scientific | 1615-5510 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 000.215 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-136 | |
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| 50 ml Conical Tubes | Phenix Research | SS-PH15 | |
| 25 ml reagent resevoirs | VWR | 41428-954 | |
| Multi channel pipet | Fisher Scientific | TI13-690-049 | |
| 96 well flat bottom plates | Corning | 3603 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| 96 well round bottom plates | Corning | 3788 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED2SS | |
| HBSS | Life Technologies | 14185-052 | |
| Sorvall ST 40 Centrifuge | Thermo Scientific | 75004509 | |
| BIOLiner Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientific | 75003796 | |
| Hemacytometer | VWR | 15170-172 | |
| MACSQuant VYB Flow Cytomter | Miltenyi Biotec | 130-096-116 | |
| Chill 96 Rack | Miltenyi Biotec | 130-094-459 | |
| Flow Jo analysis software | Flow Jo | ||
| 20 μl pipet tips | Rainin | GPS-L10 | |
| 200 μl pipet tips | Rainin | GPS-250 | |
| 1 ml pipet tips | Rainin | GPS-1000 | |
| 200 μl pipet tips | USA Scientific | 1111-1800 | |
| 5 ml serological pipett | Phenix Research | SPG-606180 | |
| 10 ml serological pipett | Phenix Research | SPG-607180 | |
| 25 ml Serological pipett | Phenix Research | SPG-760180 |
References
- Seeley, W. W., Crawford, R. K., Zhou, J., Miller, B. L., Greicius, M. D. Neurodegenerative diseases target large-scale human brain networks. Neuron. 62 (1), 42-52 (2009).
- Zhou, J., Gennatas, E. D., Efstathios, D., Kramer, J. H., Miller, B. L., Seeley, W. W. Predicting Regional Neurodegeneration from the Healthy Brain Functional Connectome. Neuron. 73 (6), 1216-1227 (2012).
- Raj, A., Kuceyeski, A., Weiner, M. A Network Diffusion Model of Disease Progression in Dementia. Neuron. 73 (6), 1204-1215 (2012).
- Braak, H., Braak, E.
- Braak, H., Braak, E. Staging of Alzheimer's disease-related neurofibrillary changes. Neurobiol Aging. 16 (3), 271-278 (1995).
- Frost, B., Diamond, M. I.
- Holmes, B. B., Diamond, M. I.
- Kaufman, S. K., Diamond, M. I. Prion-like propagation of protein aggregation and related therapeutic strategies. Neurotherapeutics. 10 (3), 371-382 (2013).
- Holmes, B. B., Diamond, M. I. Prion-like properties of Tau protein: the importance of extracellular Tau as a therapeutic target. J Biol Chem. 289 (29), 19855-19861 (2014).
- Guo, J. L., Lee, V. M. Cell-to-cell transmission of pathogenic proteins in neurodegenerative diseases. Nat Med. 20 (2), 130-138 (2014).
- Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell. J Biol Chem. 284 (19), 12845-12852 (2009).
- Guo, J. L., Lee, V. M. Y. Seeding of normal tau by pathological tau conformers drives pathogenesis of Alzheimer-like tangles. Journal of Biological Chemistry. , (2011).
- Holmes, B. B., et al. Heparan sulfate proteoglycans mediate internalization and propagation of specific proteopathic seeds. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), E3138-E3147 (2013).
- de Calignon, A., et al. Propagation of Tau Pathology in a Model of Early Alzheimer's Disease. Neuron. 73 (4), 685-697 (2012).
- Liu, L., et al. Trans-Synaptic Spread of Tau Pathology In Vivo. PLoS One. 7 (2), e31302 (2012).
- Holmes, B. B., et al. Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), E4376-E4385 Forthcoming.
- Yoshiyama, Y., et al. Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model. Neuron. 53 (3), 337-351 (2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. 65 (65), (2012).
- Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse. J Vis Exp. (33), (2009).
- Yan, Z. X., Stitz, L., Heeg, P., Pfaff, E., Roth, K. Infectivity of prion protein bound to stainless steel wires: a model for testing decontamination procedures for transmissible spongiform encephalopathies. Infect Control Hosp Epidemiol. 25 (4), 280-283 (2004).
- McDonnell, G., et al. Cleaning, disinfection and sterilization of surface prion contamination. J Hosp Infect. 85 (4), 268-273 (2013).
- Banning, C., et al. A flow cytometry-based FRET assay to identify and analyse protein-protein interactions in living cells. PLoS One. 5 (2), e9344 (2010).
- Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. Conformational Features of Tau Fibrils from Alzheimer's Disease Brain Are Faithfully Propagated by Unmodified Recombinant Protein. Biochemistry. , (2013).
- Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein. J Vis Exp. (95), e51537 (2015).
