Introduction
细胞内的tau淀粉样蛋白的积累定义τ病变如阿尔茨海默氏病。在早期疾病阶段，病理通常定位于大脑的离散区域，但随着疾病进展，病理学总是沿不同的神经网络1-5传播。越来越多的证据表明，有毒蛋白聚集体跨细胞繁殖underlies此病理（6-10综述）。在这个模型中，proteopathic种子（例如，tau蛋白）释放从供体细胞，并进入邻近细胞，转化天然tau蛋白成经由模板化的构象变化11-15错误折叠形式。此处所描述的测定法的开发灵敏检测这种播种活性。它是用重组蛋白和生物样品相容并允许proteopathic播种活动16分钟程度的定量。
HEK 293T细胞稳定表达tau蛋白重复ðomain（RD）含有与疾病相关的突变P301S融合到CFP或YFP（以下简称为tau蛋白-RD-CFP / YFP的细胞）作为播种活性的稳定的生物传感器。在没有proteopathic种子，细胞保持tau蛋白作为水溶性单体，和具有没有明显的背景的FRET。自然吸收或牛头种子脂质体介导转导到细胞内，但是，结果在RD-CFP和RD-YFP聚集，产生的是单个细胞内通过流式细胞仪测量的FRET信号。
该测定的众多成分设计，以提高灵敏度和降低可变性。带1的单克隆细胞系：1的RD-CFP / YFP表达比率被选择的，因为它提供了最佳的信号：噪声。为了增加灵敏度，磷脂用来引入种子直接导入细胞（尽管研究摄取生物学机制，这可以省略）。最后，流式细胞仪监测FRET在群体水平和单个细胞平，与其他蛋白质聚集测定。最终的测量结果，集成的FRET密度，是高度的定量和两对细胞凝集的数量，和聚集已经发生向其中每个单元内的程度帐户。所有这些优化的参数，提高了灵敏度，并确保重现性。
该系统最近采用了全面的研究转基因P301S tau蛋白病小鼠17进行评估的时间开始和相关头播种活动进展到其他常用的tau病理学标志（ 例如 ，MC1，AT8，PG5，并ThioflavinS）。播种活动是迄今为止头病理的最早和最强大的标志物进行评估，组织学检测由至少6周之前。播种活性似乎在1.5个月，并逐渐随着年龄增大，这表明proteopathic种子在其发作和/或神经变性16的级数的因果作用。
e_content“>从生物样品中的种子材料分钟水平的精确定量可以促进监测早期疾病进展的研究。通过缩短测试时间并且使得能够使用较年轻的动物，这可能增加的临床前动物试验的效率和准确性。例如，在在P301S鼠标如前所述，铅化物可作为交付早在4-6周，2-4周后进行疗效监测。该法应准确量化播种的任何削减（，或在发病播种活动的前夕）活性。FRET流式细胞仪已经在体外筛选的应用，以及，例如，抗tau蛋白的试剂（例如，抗体，小分子等），可以迅速地对它们阻断直接在培养接种诱导，使用任一重组tau蛋白的能力进行测试聚集体或脑源性裂解物作为种子源（图5）。采用这种设置，一旦晶种材料制备，一个前periment只需要三天完成，包括数据分析。 proteopathic播种活动的快速定量因此可以促进神经退行性疾病的许多研究。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注：该协议强调利用FRET的流式细胞仪从小鼠生物样本检测播种活动。它还与重组原纤和人类生物样品兼容。按照IACUC批准的程序进行鼠标安乐死与脑收获。
1.脑提取
- 以下用异氟烷（2％）深麻醉，灌注的小鼠用含有0.03％肝素冰冷的PBS，并提取在以下量具等描述的细节的大脑 。18
- 放置提取的组织在一个冷冻小瓶中，并通过将在液氮中冷冻单元。可选择地，冷冻在干冰上的组织。一旦冻结，如果有必要转移组织至-80℃，并存储用于在延长的时间周期。
注：此协议是与全脑匀浆或微观解剖的大脑区域兼容。见萩原等人进行了详细的显微解剖协议19。 2.制备生物种材料 - 通过将蛋白酶抑制剂（不含EDTA）到1X TBS（每10ml 1片）准备同质化的缓冲区。涡大力，和存储在冰上。蛋白酶抑制剂必须是不含EDTA，以保持生物传感器细胞活力。
- 权衡冷冻的脑组织中的一次性称重舟，并转移到一个5毫升锥形管中。添加冰冷的均化缓冲液，使得最终溶液是10％重量/体积。暂时储存在冰。组织块和随后的均化缓冲液量将根据所使用的脑大小和/或区域而有所不同。这里，成年小鼠hemibrain称量0.2克悬浮在2毫升10％重量/体积溶液。
- 转移样品到寒冷的房间，并调整探头超声仪来进行相应的设置。为探针超声处理用的Omni Ruptor（此处示出），设置功率至20％，其对应于约75 W·使用一个脉冲模式，以确保样品不OV在超声ER-加热。脉冲发生器设置为30％，相当于约500毫秒。
- 通过与水，异丙醇，和水再次漂洗，拭去探针在每种溶液之间清洁探头超声仪的尖端。是一定的冲洗和擦拭两侧和探头与实验室擦拭物底部。
- 与一个样本的工作的时间，淹没探针针尖插入匀浆缓冲，并启动超声发生器。使用上述的功率和脉冲发生器的设置，提供25总脉冲。确保组织是完全悬浮。请注意，以避免在该步骤中样品的泡沫。
注：样品易于发泡如果一个）的总体积为低或b）将匀浆升温。有了这个特殊的仪器，不要用超声处理体积小于250微升。为了确保样本留冷藏，管可以在该步骤中保存在冰上。 - 清洁探头由抹着剩余的裂解液，然后交付10个脉冲到烧杯中Øf清洁时的水。冲洗的侧面和探头与水，异丙醇，和水再次的底部（如在步骤2.4），擦拭干在每个步骤之间。为了避免污染，彻底冲洗探头样本之间。
注意：对于tau聚集，未发现更严格的清洗方法是必要的，以防止样品到样品的污染。其他淀粉样蛋白，然而，可能要求已在文献20,21被广泛描述的附加 服务。 - 商店匀浆在冰上直至所有样本都被处理。
- 自旋匀浆在21300×g离心15分钟，在4℃。
- 上清转移到一个干净的试管，注意不要打扰颗粒。弃沉淀。等分上清液，并在-80℃用于进一步使用商店裂解物。然而避免匀浆冷冻/解冻循环，因为这会减少播种效率。
- 在无菌环境中，吸培养基。细胞冲洗用温水PBS，并吸出。 Trypsinize细胞（3 ml的胰蛋白酶-EDTA（0.05％）的）下3分钟，淬火用温培养基（9 ml的DMEM中，10％胎牛血清，1％青霉素/链霉素，1％Glutamax的），并立即细胞转移到一个锥形管中。
- 离心细胞在1000×g离心5分钟，室温。吸出培养基，在温暖的培养基悬浮细胞沉淀。
- 使用血细胞计数器，确定细胞密度为每个细胞系。细胞密度将根据汇合在收获和再悬浮体积时间变化。从10cm皿在10ml培养基收获在90％汇合，细胞密度悬浮细胞为约100万个细胞/毫升。
- 使细胞的一个主混合物+媒体，使得一个96孔板的各孔将包含35,000个细胞的130微升培养基（例如，使一个主混合物为100孔，悬浮3.5百万细胞在13ml培养基）。修改手机号码，以适应个人的实验设计和时间表。用于细胞治疗〜铺板后18小时，加入35,000个细胞到96孔板的每个孔中。
- 使用多通道移液管，慢慢吸取130微升主混合物的细胞悬浮液到一个平底的每个孔中，组织培养处理的96孔板中。而电镀，将吸管尖在井的中心，而不是接触板的底部。
注意：虽然镀格式可以被修改，使得n = 4的孔中的每一个细胞系的1％至3板被推荐的。该板（N = 84）的其余部分为细胞系＃4（生物传感器细胞）保留。 - 使细胞通过离开该板静置在室温10分钟以沉淀。孵育O / N在37℃，5％的CO 2，和与＃8805; 80％的相对湿度。
- 在一个管中，结合转染试剂，如脂质体，具有减少的血清培养基，如的Opti-MEM，以使一个主混合物。每口井，增加1.25微升转染试剂和8.75微升减少血清培养基。轻轻一抖管搭配，简单地降速，孵化5分钟，在室温。
- 在另一个管中，结合种子材料（来自步骤2.9的裂解物等分试样）具有降低血清培养基。
注：晶种材料的量会根据个体实验而变化。当选择种子体积，考虑到：丰种子样本和潜在毒性的。原油匀浆可能是有毒的细胞。因此，使用最低量可以监视你想要的效果。裂解液/孔范围FR以前测试卷嗡1-5微升，对应于：5-20微克总蛋白。确保每孔的总体积（种子+还原血清培养基）是10微升。 - 从4.1和4.2，说明甩尾轻轻混合两管相结合的内容，简要降速（1000 XG，5秒），并在室温下孵育至少20分钟，最多2小时。
- 轻轻吸取个别生物传感器孔的侧20微升转导复合物。使用三个技术重复，如果可能的话。返回处理的细胞以孵化24-48小时。在相同条件下孵育，如步骤3.6中所述。
注：合适的阴性对照条件，这种设置是空脂质体（ 即脂质体试剂+降低血清培养基）处理的生物传感器细胞，因为应用程序磷脂引入了荧光剖面相对生物传感器细胞未曝光的脂质体试剂的轻微变化。 - 使用多通道移液管，吸所有细胞培养基（150微升）。 Trypsinize（50微升）细胞5分钟，并骤冷以150微升冷却的培养基。不包括以胰蛋白酶在这一步，因为它可能会导致细胞的提升和随后的细胞丢失前一个PBS冲洗。通过门控策略，流式细胞仪过程中排除任何污染的死细胞和碎片。
- 立即淬火，转移细胞到96孔圆底板，和离心机在1000×g离心5英里后n将在RT。
- 吸并丢弃中，注意避免干扰细胞沉淀。
- 轻轻地，彻底，重悬在50μl的2％多聚甲醛的细胞沉淀，并孵育10分钟。或者，运行细胞活着，虽然固定提供更清洁，更一致的结果。
- 离心细胞在1000×g离心5分钟，室温。吸并丢弃多聚甲醛，注意避免干扰细胞沉淀。
- 轻轻地，彻底，重悬细胞沉淀在200微升冷却的流式细胞仪缓冲液（HBSS，1％FBS，1mM EDTA）中，并尽快运行板，以避免细胞聚集。
- 做一个侧面散射面积（SSC-A）与前向散射面积（FSC-A）二元情节，并与小区1号线的运行，调整SSC和FSC电压，直到细胞群体是在左下象限。单击多边形工具，并定义细胞群（门P1）。对于所有的门控参数见图 2。
- 做一个FSC-H（高度）与FSC-A二元情节，并申请门P1到该小区通过点击“活”以上的情节，并选择P1。随着细胞系＃1运行后，单击多边形工具，并定义单个细胞（门P2）。
- 使3直方图，每个所关心的过滤器：CFP，YFP和FRET。通过点击“活”上述地块，并选择P2应用门P2到所有这些地块。同细胞系＃1的运行，调整电压使得该位数细胞群中在CFP，YFP和FRET直方图都是0和1之间要测量的CFP和FRET，激发细胞用405nm的激光，和捕获荧光带五十分之四百五十nm和50分之525纳米过滤器，分别为。为了测量YFP，激发细胞与488 nm激光和捕捉荧光带50分之525纳米过滤器。激光和过滤器设置在表2中进一步描述。
- 对于CFP外溢到FRET和YFP渠道进行补偿。
注：补偿是荧光溢出校正的过程。每当1荧光染料的所述荧光发射内的过滤器检测DESI发生荧光外溢gned从另一个荧光染料测量信号。有了适当的补偿，CFP溢出的荧光可以从FRET和YFP的通道被删除。
注：补偿既需要荧光阳性和阴性细胞的存在。因此，为了补偿在CFP阳性细胞（细胞系＃2），阴性细胞（细胞系＃1）必须被添加到之前的运行样品。- 穗在30微升的细胞系＃1时从单井到200微升的细胞系＃2停牌前夕补偿。
- 点击“仪器设置”图标，然后“补偿”选项卡，并选中“矩阵”，打开补偿表。
- 做一个FRET-A对CFP-A二元情节，并申请门P2，如步骤6.3中所述。随着细胞系1 + 2的运行，点击“象限”图标，并绘制象限，使得荧光阴性和阳性的人口是由下面的两个象限分离（盖茨LL3一个第二LR3，分别）。
- 创建显示FRET为LL3和LR3门中位数荧光强度（MFI）一个统计表。调整的补偿矩阵的FRET参数，直到FRET信号的MFI是LL3和LR3之间的等价物。在此步骤之后，FRET的信号的MFI等于未染色的细胞和CFP阳性细胞之间，这表明不存在CFP溢出到FRET通道。
- 做一个YFP-A对CFP-A二元情节，并申请门P2，如步骤6.3中所述。绘制象限（LL4和LR4）相似，在步骤6.4.3完成。
- 创建显示YFP的MFI为114和LR4一个统计表。调整在补偿矩阵YFP的参数，直到YFP信号的MFI为114和LR4之间的等价物。在该步骤之后，一个信号的YFP的MFI是未染色等于细胞和CFP-阳性细胞之间，这表明由于缺乏CFP溢出进入YFP通道。
- FOLL由于门的设置和补偿，突出感兴趣的水井和运行板的其余部分。
- 毕竟样品已运行，导出数据文件，通过点击“文件”，然后“复制”。选择“数据文件”选项卡，选中实验文件夹，然后单击“复制”。
- 在流式细胞仪分析程序流程打开FCS文件。
- 基于散射特性，使用多边形门从空脂质体处理的细胞定义的细胞群体（SSC VS FSC）和单群（FSC-H VS FSC-A），同样，在第6节。
- 如果在安装过程中进行CFP补偿，不进一步调整CFP。
- 创建FRET VS YFP二元情节。使用细胞系＃3，通过绘制多边形栅极沿FRET的阳性细胞群的斜率运行定义一个虚假的FRET栅极。此门排除YFP单阳性细胞发射FRET的过滤器内的信号，并绘制类似于先前由禁止等人22所示
- 通过在FRET VS CFP二元阴谋策划空脂质体处理的CFP / YFP细胞定义FRET门。沿着向上延伸，并向左远离人口的人口的斜率引入一个多边形栅极。此门应排除大多数细胞（〜99％），以使得背景FRET是细胞≥1％。即转入这个门的任何事件都被认为FRET阳性。
注意：上述每个单独的栅极被施加到所有样品构建后续入口处。下面的分析中，四个独立的门被定义（细胞群;单;假FRET; FRET）。 - 感兴趣的记录分析参数，其中包括：％的FRET积极性和MFI的FRET阳性细胞。通过测量％的积极性和小额信贷机构的产品手动计算综合FRET密度。
注意：如果集成FRET密度用作衡量的结果，设定背景FRET和MFI，以避免计算产品是小于其两个个别因素（如在步骤7.5中定义）为大于或等于1。
3. Replating生物传感器细胞
注意：使用四种细胞系用于该测定：HEK 293T（株＃1），则RD-P301S-CFP（细胞系＃2），的RD-P301S-YFP（细胞系＃3），和RD，P301S-CFP / YFP（细胞系＃4）。请参考表1来测定每个细胞系的贡献。
4.处理细胞
注意：以下天，当tau蛋白生物传感器细胞为60-65％汇合，制备种子转导复合物如下：
5.收获细胞FRET流式细胞仪
6. FRET流式细胞仪
注意：使用流式细胞仪如MACSQuant VYB，其配备的FRET-兼容激光线和过滤器组（ 表2）。在本节中的每个步骤中，单击感兴趣的以及使用软件96孔模板，单击“玩”开始样品提升和流量。通过点击“新分析窗口”图标，让绘图或统计信息表。通过点击标题的X或Y轴，并选择适当的过滤器更换个别二元地块轴参数。要改变细胞群或荧光信号，增加或减少与适当的过滤器相关联的电压。有了这个仪器，运行<1000次/秒，以确保精确的单细胞的监控。
7.数据分析
注：点击标题对X或Y轴，并选择适当的过滤个别二元地块更改轴参数。
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Representative Results
FRET流式细胞仪能敏感，定量，并从重组或生物样本快速检测播种活动。实验设置是容易的：表达的tau-RD-CFP / YFP单克隆来源的稳定细胞系转导的种子材料，孵育24-48小时，并进行流式细胞术分析（图1A）。在没有种子，生物传感器细胞保持tau蛋白以可溶，单体形式（图1B）。在种子的情况下，然而，生物传感器细胞将tau蛋白为凝聚状态（图1C）中，产生一个是针对每个小区的基础流式细胞仪检测到的FRET响应。定量评估表明，生物传感器细胞响应飞摩尔浓度种子材料，并且播种活性可以跨越三个数量级（图1D）有效地测量。
建立门控参数，以确保检测的trUE FRET信号，即使在低浓度的种子。首先，标准的门控方法用于分离细胞群（图2A）和单细胞（ 图2B）。可以通过405纳米的激光产生的虚假FRET信号直接激活YFP的。因此，假FRET栅极由YFP单阳性细胞群吸引到排除污染信号（图2C）。最后，FRET的栅极从未经播撒CFP / YFP双阳性细胞 （图2D）中所定义。栅极绘制该向上延伸的人口的斜率邻近和向左远离它。未刺激的细胞应该有一个背景FRET值设定为约1％，和FRET的阳性细胞会转移到这个门以剂量依赖的方式（对比图2E和2F）。多个参数都考虑到与FRET流式细胞仪，包括：百分之阳性（即每总细胞计数FRET的阳性细胞数）和中值荧光强度（即，在何种程度上一个FRET响应中产生一个FRET的阳性细胞）。集成FRET密度是优选的测量结果，因为它是这两个变量的乘积和全表示诱导任何给定样品接种活动的程度。
FRET流式细胞仪是具有P301S tau蛋白病源于小鼠的脑裂解物兼容，甚至在年轻的年龄，如显示图3。以下四种不同脑区显微切割，FRET流式细胞术用来测量从脑干播种活性 （图3A），新皮质（图3B），额叶（图3C），和海马（图3D）中P301S小鼠在一定范围的青睐。在每一个地区，播种活动随着年龄的增长，并出现在只有1.5个月。然而，牛头基因敲除小鼠（“KO”）> 12 MOS从不显示播种活动。相比于Histological分析同一动物中进行的，这是6个星期早于tau蛋白沉积（图3E），包括构象-异常tau蛋白（MC1），tau蛋白（AT8和PG5），和淀粉样蛋白构象的标记的任何其他标记的外观（ThioflavinS）。从机械视图，近端检测的tau播种活性表明种子为τ蛋白病发作和/或进展的因果介质。从实验来看，这表明播种活性分析可能是一种理想的补充tau蛋白沉积的标准结果的措施，鉴于其早期和健壮的外观。
除了 转基因小鼠，FRET流式细胞仪是与人脑裂解物相容，并可以容易地检测tau聚集来自阿尔茨海默病患者（图4）中分离。当冷冻的人脑组织均化以相同的方式所描述此处P301S脑裂解物，播种活动正在稳健地从AD对象派生的所有样品检测。与此相反，播种活动永远不会从年龄相当或亨廷顿氏病对照受试者的裂解液进行检测。这强调了测定法tau聚集的特异性。
虽然本文的重点是tau蛋白播种活性使用聚集体的脂质体介导的递送到HEK 293T细胞生物传感器灵敏的检测，更生理细胞培养范例也可与FRET进行流式细胞术来评估基本细胞摄取机制。例如，初级神经元文化可以感染慢病毒表达τ-RD-CFP和tau-RD-YFP构建的电镀时间。在DIV4，聚合是在未经处理的细胞（图5A）缺席但可检测与含有种子材料（图5B）处理的神经元。重要的是，磷脂被排除在这些实验中，允许的生理和帕特调查 hophysiological播种机制。因此，应用的tau纤丝导致神经元HSPG介导的摄取，刺激聚合以剂量依赖的方式，可以与FRET流式细胞术（ 图5C）来量化。另外，该测定可用于tau蛋白摄取治疗评估以及使用HEK 293T tau蛋白的生物传感器细胞接种封锁体外 。即使在没有磷脂，两个重组原纤维（图5D）和P301S脑裂解物（图5E）诱导的tau聚集。预孵育这些tau蛋白种子用肝素（以前证明是HSPG介导的tau摄取的有效抑制剂），然而，消除了它们的播种能力。这个实验装置可以适用于任何药物（例如，抗体，小分子等 ），并能够使吸收和/或种子改性治疗剂的快速评估。
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图1. FRET流式细胞灵敏检测的tau播种活动16。表达tau蛋白-RD-CFP / YFP单克隆HEK 293T细胞转导或重组的生物样品，温育24-48小时，并使用流式细胞仪单个细胞基础分析（A）。未刺激的细胞维持tau蛋白-RD以单体状态 （B），而用含种子的材料显示突出夹杂物（C）的处理过的细胞。定量评价（平均值±SEM）的播种活性表明，FRET流式细胞仪是重组种子材料的飞摩尔浓度（单体当量）敏感并且检测跨越幅度（D）的三个数量级。单体等效表示蛋白含有的纤维化反应中的总量，不校正不完全与＃160;掺入单体到聚合材料。因此，实际的聚集体（种子）的浓度必须小于或等于其“单体等效'。 *从福尔摩斯和弗曼等 16修改请点击此处查看该图的放大版本。
图2.门控策略的FRET流式细胞仪，细胞群（A）和单峰/双峰（B）的栅极被绘制标准流式细胞仪的方法。假栅极的FRET（C）选自 YFP单阳性细胞吸引到消除YFP bleedthrough到FRET滤波器。甲FRET门（D）中，从空脂质体处理的细胞构成，如这样的背景下FRET是≥1％。甲人口换挡到FRET栅极出现下列种子阳性材料（E）的治疗和换档变得与较高量的种子材料（F）的日益突出。最终读数包括：。％的FRET阳性，平均荧光强度（MFI）的FRET阳性事件，和集成的FRET密 度（综合FRET密 度=阳性细胞百分数* MFI） 点击此处查看该图的放大版本。
图3. P301S小鼠16级数头播种活动。 从P301S小鼠脑组织匀浆播种活动（平均值±SEM）是在脑干1.5个月（A明显），新皮层（B）中，额叶（C）和海马（D）中。然而，播种活动从来没有在tau蛋白基因敲除小鼠（> 12个月）观察。播种活动随着年龄的增大而先于其他常见的组织学标志物，包括MC1，AT8和PG5（E）的出现。 *转载自霍姆斯和弗曼等 [16]的权限，请点击此处查看该图的放大版本。
FRET图4.兼容性与人体生物样品16流式细胞仪 。当τ-RD-CFP / YFP生物传感器细胞转导与20微克人脑裂解液，健壮的种子（平均值±SEM）发生在所有测试的阿尔茨海默氏症diseaSE的大脑，而年龄匹配和亨廷顿氏病控制裂解液缺乏播种活动。 *从福尔摩斯和弗曼等 16修改请点击此处查看该图的放大版本。
图5.替代应用FRET流式细胞仪16。转导与慢病毒编码的tau蛋白CFP初级神经元和tau-YFP构建。在没有外源性种子没有明显的聚集（A）中 ，但也有是在种子的存在下（B）中。神经元的生物传感器响应剂量依赖性重组tau蛋白的种子，甚至在不存在磷脂介导的递送（C）的。预孵育重组体（D）或双向的ological（ 五）种源与肝素，对HSPG介导的tau蛋白种子摄取抑制剂，消耗FRET HEK 293T细胞生物传感器的响应速度。定量评估显示（平均值±SEM）。 *从福尔摩斯和弗曼等 16修改请点击此处查看该图的放大版本。
表格1： 用FRET使用细胞系流式细胞仪。HEK 293T细胞用于流式细胞仪的设置。 CFP单阳性细胞用于补偿（*）。 YFP单阳性细胞用于消除假的FRET信号由于直接激活YFP的通过405nm激发。 CFP / YFP双阳性细胞是FRET的兼容，并作为生物传感器单元格。 请点击这里查看此表的放大版本。
表2：流式细胞仪的激光和过滤器设置 请点击这里查看此表的放大版本。
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Discussion
此处所描述的FRET流式细胞仪系统是一个功能强大的工具，快速和定量地评估tau蛋白播种活性。它只需要适度的细胞培养的经验和FRET的应用知识和流式细胞仪。其他播种测定法，如硫磺素T - 这表现出增强的荧光当结合β片层结构 - 是费力的，需要一个纯的，重组蛋白质底物。此外， 在体外播种测定法的tau仅半定量的并且通常不敏感种子材料23,24的亚纳摩尔水平。 FRET流式细胞仪，但提供了播种活动进行定量和非常敏感的措施无论从重组或生物样品。此外，适应的程序可以使学习的各种蛋白质聚集疾病非常有用。
虽然在此描述的方案的重点对tau播种，只有简单的修改需要吨O允许用户从备用类型proteopathic种子播种监控活动。这表现在Holmes和弗曼等人，建立一个单克隆细胞系的稳定表达α突触核蛋白窝藏疾病相关A53T突变标签要么CFP或YFP的启用灵敏检测播种活性从全长α突触核蛋白的重组原纤维16 。使用亨廷顿生物传感器细胞，这也有效地检测蛋白质聚集类似的实验已经完成。因此，仅仅通过修改蛋白质的生物传感器，FRET流式细胞仪是无数种源兼容。其它修改到测定，包括治疗范例和细胞模型，可被用来制造FRET流式细胞术，更适用于评估生理机制。在这个协议中，种子直接通过脂质体介导转导引入生物传感器的细胞，以此来提高灵敏度。
重要的是为nOTE，然而，这不是一个要求。 tau聚集来自重组或小鼠生物样品尚能在不存在脂质体的（图5）接种的生物传感器细胞。因此，实验室对研究生理传播和/或tau蛋白种子吸收机制可能仍然使用的检测。此外，FRET流式细胞仪是原发性神经元文化兼容。通过以电镀的时间感染细胞与CFP-YFP和编码慢病毒构建体，有效的FRET响应处获得以下用重组tau蛋白纤丝治疗纳摩尔浓度，甚至在不存在脂质体的（图5）。总之，这些数据表明，FRET流式细胞仪是研究播种生理机制用于各种蛋白质聚集体，并在多个细胞培养模型是有用的。
虽然FRET流式细胞仪系统是用户友好的，适应性强，某些关键步骤应该是接着，以确保兼容性，包括样品制备和合适的细胞汇合在治疗时间。大脑标本的高强度超声探头是播种活动的有效和最佳的隔离至关重要。在开发和优化，据观察，该方法是超过10倍，从P301S老鼠大脑相对其他常用技术， 如手持同质化隔离播种活动更有效。这可能是非常大的tau聚集具有相对低的播种倾向，并且探针超声处理是最有效的打破这些聚集成更小的，种子兼容片段。持续时间的超声处理的频率和可根据需要进行修改，虽然建议上述设置灵敏检测播种活性。
在处理时细胞汇合是最重要的也是，因为它影响灵敏度和细胞的健康。如果细胞再过于汇合，他们不容易占用磷脂和籽料，从而极大地降低敏感度。如果汇合太低，加成磷脂和晶种材料可能是有毒。经验测试表明，60-65％的生物传感器汇合是最佳的治疗和后续的响应性。
在协议中所指出的，补偿算法经常用来排除CFP溢出进入YFP FRET和通道，从而避免错误的信号和提高了灵敏度。播种活性的更快和定性评估，但是，这种步骤可事后利用流式细胞分析软件省略或执行。得到一个更清洁，更可靠的信号之后的补偿，然而，从而为最严格的定量分析，这一步是强烈建议。
该测定的一个限制是它不能对生化报告 组成该proteopathic种子。目前的检测措施直播活动中，种子的功能特性。的种子的生化和生物物理性质的测定需要耦合到传统的测定法诸如免疫沉淀，色谱，圆二色性，质谱法等。然而，该测定将证明在评价播种效力从无数的标本的端点是有用的。
该测定最近用于量化和表征播种和发展中相对于τ沉积的其他共同标志物，如组织学污渍P301S小鼠的时间过程。在这项研究中，tau蛋白播种活动之前的最早组织学标记（MC1）我们测试16是六个多星期显而易见。鉴于其提前出现，播种活动可能是一个重要的补充，甚至替代，结果测量评估治疗干预的效果，至少在初步研究。通过缩短疗程，研究年轻的动物，住房费用和实验周转时间将减少。可以想象的是，治疗剂可以被施用至P301S小鼠在4-6周和大脑2-4周后评价播种活性。另外，还可以在几天之内评估其阻断感应播种活动的生物传感器细胞，这表现在图5的能力进行反tau蛋白治疗的细胞的评价。
最后，FRET流式细胞播种测定法是一种简单而有效的方法来检测的tau播种来自重组或生物来源。其灵敏度在体外的tau播种测定由其他无双，并且它可以被用于检测在P301S tau蛋白病的小鼠的最早病理改变。此外，其在不同的处理条件，并与多个细胞培养模型下监测众多proteopathic种子灵活性，使得它可用于任何蛋白质聚集实验室兴趣迅速收集定量数据。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TBS | Sigma | T5912 | |
| cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-free) | Roche | 4693159001 | |
| Cryo-vials | Sarstedt | 72.694.006 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 105DU | |
| Weighing Boats | Fisher Scientific | 13-735-743 | |
| 15 ml conical tube | USA Scientific | 1475-0501 | |
| Omni Sonic Ruptor Ultrasonic Homogenizer | Omni International | 18-000-115 | |
| Micro-Tip for Ultrasonic Homogenizer | Omni International | OR-T-156 | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A451 | |
| Noise Cancelling Ear Muffs | Fisher Scientific | 19-145-412 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | S47299 | |
| 1.5 ml tubes | USA Scientific | 1615-5510 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 000.215 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-136 | |
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| 50 ml Conical Tubes | Phenix Research | SS-PH15 | |
| 25 ml reagent resevoirs | VWR | 41428-954 | |
| Multi channel pipet | Fisher Scientific | TI13-690-049 | |
| 96 well flat bottom plates | Corning | 3603 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| 96 well round bottom plates | Corning | 3788 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED2SS | |
| HBSS | Life Technologies | 14185-052 | |
| Sorvall ST 40 Centrifuge | Thermo Scientific | 75004509 | |
| BIOLiner Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientific | 75003796 | |
| Hemacytometer | VWR | 15170-172 | |
| MACSQuant VYB Flow Cytomter | Miltenyi Biotec | 130-096-116 | |
| Chill 96 Rack | Miltenyi Biotec | 130-094-459 | |
| Flow Jo analysis software | Flow Jo | ||
| 20 μl pipet tips | Rainin | GPS-L10 | |
| 200 μl pipet tips | Rainin | GPS-250 | |
| 1 ml pipet tips | Rainin | GPS-1000 | |
| 200 μl pipet tips | USA Scientific | 1111-1800 | |
| 5 ml serological pipett | Phenix Research | SPG-606180 | |
| 10 ml serological pipett | Phenix Research | SPG-607180 | |
| 25 ml Serological pipett | Phenix Research | SPG-760180 |
References
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