Introduction
Ansamlingen av intracellulära tau amyloider definierar tauopatier såsom Alzheimers sjukdom. I etapper tidiga sjukdoms är patologi i allmänhet lokaliserad till diskreta områden av hjärnan, men med sjukdomsprogression, sprider patologi alltid längs olika neurala nätverk 1-5. Ackumulera tyder transcellulär spridning av giftiga proteinaggregat ligger bakom denna patologi (översikt i 6-10). I denna modell är proteopathic frön (t.ex. tau) frigörs från givarceller och ange angränsande celler, omvandla nativt tau-protein i den felveckade form via mallade conformationaländring 11-15. Analysen som beskrivs här har utvecklats för att varsamt upptäcka en sådan sådd aktivitet. Den är kompatibel med rekombinant protein och biologiska prover och möjliggör kvantifiering av små nivåer av proteopathic sådd aktivitet 16.
HEK 293T-celler som stabilt uttrycker tau upprepa domain (RD) innehållande sjukdomsassocierade P301S mutation kondenserad till antingen GFP eller YFP (nedan kallat tau-RD-GFP / YFP-celler) används som en stabil biosensor av sådd-aktivitet. I frånvaro av proteopathic frön, cellerna bibehålla tau som en löslig monomer och har ingen märkbar bakgrund FRET. Spontan upptag eller liposom-förmedlad transduktion av tau frön in i celler, resulterar emellertid i RD-GFP och RD-YFP aggregering, som producerar en FRET-signal som mäts inom enskilda celler via flödescytometri.
Många komponenter i denna analys konstruerades för att öka känsligheten och minska variabilitet. En monoklonal cellinje med en 1: 1 RD-CFP / YFP uttryck förhållandet valdes, eftersom det ger en optimal signal: brus. För att öka känsligheten, är fosfolipider som används för att introducera frön direkt i celler (även för att studera biologiska mekanismer av upptag, kan detta utelämnas). Slutligen, flödescytometri monitorer FRET på populationsnivå och en enda cell nivå, till skillnad från andra protein aggregeringsanalyser. Det slutliga resultatet åtgärd, integrerad FRET-densitet, är i hög grad kvantitativ och svarar både för antalet celler med aggregering, och den grad i vilken aggregation har skett inom varje cell. Alla dessa optimerade parametrar öka känsligheten och säkerställa reproducerbarhet.
Detta system har nyligen anställd i en omfattande studie på transgena P301S tauopathy möss 17 som utvärderade tids uppkomsten och utvecklingen av tau sådd aktivitet i förhållande till andra vanligt förekommande tau patologiska markörer (t.ex. MC1, AT8, PG5 och ThioflavinS). Seedning aktivitet är den i särklass tidigaste och mest robusta markör för tau patologi utvärderas föregående histologiska detektion av minst 6 veckor. Seedning aktivitet verkar på 1,5 månader och ökar progressivt med åldern, vilket tyder på ett orsakssamband med proteopathic frön i början och / eller utvecklingen av neurodegeneration 16.
e_content "> Exakt kvantifiering av små nivåer av utsäde material från biologiska prover kan underlätta studier som övervakar tidiga sjukdomsprogression. Genom att förkorta rättegång varaktighet och möjliggör användning av yngre djur, kan detta öka effektiviteten och noggrannheten i prekliniska djurstudier. Till exempel i den P301S musen tidigare beskrivits, skulle blyföreningar levereras så tidigt som 4-6 veckor (omedelbart före eller vid inträde av sådd aktivitet), och övervakas för effekt 2-4 veckor senare. Analysen bör exakt kvantifiera eventuella minskningar i sådd aktivitet. FRET flödescytometri har kan testas in vitro screening tillämpningar. Till exempel, anti-tau reagens (t.ex. antikroppar, små molekyler, etc.) snabbt för deras förmåga att blockera sådd induktion direkt i kultur, med hjälp av antingen rekombinant tau aggregat eller hjärnhärledd lysat som frötäktsområde (Figur 5). Med den här inställningen när utsäde Materialet framställs, en före dettaexperimentera tar bara tre dagar att genomföra, inklusive dataanalys. Den snabba kvantifiering av proteopathic sådd aktivitet kan därmed underlätta många studier av neurodegeneration.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Detta protokoll understryker användningen av FRET flödescytometri för att detektera sådd aktivitet från mus biologiska prover. Det är också kompatibel med rekombinanta fibriller och humana biologiska prover. Mus dödshjälp och hjärnan skörd genomfördes i enlighet med lACUC-godkända förfaranden.
1. Hjärna Extraktion
- Efter djup anesthetization med isofluran (2%), BEGJUTA en mus med iskall PBS innehållande 0,03% heparin, och extrahera hjärnan följa anvisningarna i Gage et al. 18
- Placera utvinns vävnad i en Cryo-flaskan och knäppa frysa genom att placera i flytande kväve. Alternativt, fryst vävnad på torris. När frysta, överföra vävnad till -80 ° C och förvara under en längre tid, om det behövs.
OBS: Detta protokoll är kompatibelt med hela hjärnhomogenater eller mikro dissekeras hjärnregioner. Se Hagihara et al. För en detaljerad mikro dissektion protokoll 19. 2. Beredning av biologisk Seed Material - Förbered homogeniseringsbuffert genom att lösa proteashämmare (EDTA-fri) i 1x TBS (1 tablett per 10 ml). Vortex kraftfullt, och förvara på is. Proteashämmare måste vara EDTA-fri för att bevara biosensor cellviabilitet.
- Väg fryst hjärnvävnad i en engångs väga båt, och överför till en 5 ml koniskt rör. Lägg iskall homogeniseringsbuffert så att den slutliga lösningen är 10% vikt / volym. Tillfälligt lagra på is. Vävnadsmassa och efterföljande homogeniseringsbuffert volym kommer att variera beroende på den hjärnstorlek och / eller regioner användas. Här, är en vuxen mus hemibrain vägande 0,2 g suspenderades i 2 ml för en 10% vikt / vol lösning.
- Överför proverna till ett kallt rum och justera probsonikator till lämpliga inställningar. För ultraljudsbehandling med sond med en Omni Ruptor (bilden), ställa in kraften till 20%, vilket motsvarar cirka 75 W. Använd en pulsläget för att säkerställa proven inte over-uppvärmd under ultraljudsbehandling. Ställ impulsgivaren till 30%, vilket motsvarar cirka 500 msek.
- Rengör spets probsonikator genom sköljning med vatten, isopropanol och vatten igen genom att torka bort sonden mellan varje lösning. Var noga med att skölja och torka båda sidor och botten av sonden med lab-våtservetter.
- Arbeta med ett prov i taget, översvämmas sondspetsen i homogeniseringsbufferten, och starta ultraljuds. Med hjälp av kraften och PULSER inställningar som beskrivs ovan, ger 25 totalt pulser. Se till att vävnaden är helt i suspension. Var noga med att undvika skumning av provet under det här steget.
OBS: Prover är mottagliga för skumning om a) den totala volymen är låg eller b) homogenatet värms upp. Med detta specifika instrument, inte sonikera med volymer på mindre än 250 l. För att säkerställa prover bo kylda, kan rören förvaras på is under detta steg. - Rengör proben genom att torka bort kvarvarande lysat, sedan leverera 10 pulser i en bägare of rent vatten. Skölj sidorna och botten av proben med vatten, isopropanol och vatten igen (som i steg 2,4), torka torka mellan varje steg. För att undvika kontaminering, Skölj sonden mellan prover.
OBS: Med tau aggregat, vi har inte funnit att strängare rengöringsmetoder är nödvändiga för att förhindra prov till provkontaminering. Andra amyloider kan dock kräva ytterligare vård som har beskrivits utförligt i litteraturen 20,21. - Store homogen på is tills alla prover har behandlats.
- Spin homogenat vid 21,300 xg under 15 minuter vid 4 ° C.
- Överför supernatanten till ett rent rör, noga med att inte störa pelleten. Kassera pelleten. Alikvotera supernatanten och lagra lysat vid -80 ° C för vidare användning. Undvik frysning / upptinings-cykler av homogenaten, men eftersom detta minskar sådd effektivitet.
- I en steril miljö, aspirera odlingsmedium. Skölj celler med varm PBS och aspirera. Trypsinisera celler (3 ml trypsin-EDTA (0,05%)) för 3 minuter, släck med varmt odlingsmedium (9 ml DMEM, 10% FBS, 1% pen / strep, en% GlutaMax), och omedelbart överföra celler till en koniskt rör.
- Centrifugera cellerna vid 1000 xg under 5 min vid RT. Aspirera medium och återsuspendera cellpelleten i varmt odlingsmedium.
- Med användning av en hemocytometer, fastställa vilken celldensiteten för varje cellinje. Celldensiteten varierar beroende på konfluens vid tidpunkten för skörd och resuspension volym. Resuspendera cellerna som skördats från en 10 cm skål vid 90% konfluens i 10 ml medium, för celldensitet för att vara ungefär en miljon celler / ml.
- Göraen mästare blandning av celler + media så att varje brunn i en platta med 96 brunnar innehåller 35.000 celler i 130 pl media (t.ex. för att göra en Master Mix för 100 brunnar, resuspendera 3,5 miljoner celler i 13 ml medium). Ändra mobilnummer för att passa individuella experimentell design och tidslinjer. För cell behandling ~ 18 h efter plätering, lägga 35.000 celler till varje brunn i en 96-brunnsplatta.
- Med användning av en flerkanals pipett långsamt pipettera 130 | il av huvudblandning cellsuspensionen i varje brunn i en flatbottnad, vävnadsodlingsbehandlade 96-brunnars platta. Medan plätering, placera pipettspetsen i mitten av brunnen, ej i kontakt med botten av plattan.
OBS: Även om plätering formatet kan modifieras, vilket gör n = 4 brunnar för varje cellinjer 1-3 per platta rekommenderas. Resten av plattan (n = 84) är reserverade för cellinjen # 4 (biosensorceller). - Tillåta cellerna att sedimentera genom att plattan orörd i 10 min vid RT. Inkubera O / N vid 37 ° C, 5% CO2, och &# 8805; 80% relativ fuktighet.
- I ett rör, kombinera transfektion reagens, såsom Lipofectamine, med sänkt serum medier, såsom Opti-MEM, för att göra en Master Mix. Per väl, tillsätt 1,25 pl transfektionsreagens och 8,75 pl sänkt serum media. Flick röret försiktigt för att blanda, i korthet spinn ner, och inkubera under 5 min vid RT.
- I ett annat rör, kombinera ympmaterial (delmängd av lysat från steg 2,9) med reducerad serum media.
OBS: Volymen av ympmaterial varierar beroende på det enskilda experimentet. När du väljer utsädesmängden, ta hänsyn till: överflöd av frön i ett prov och potentiell toxicitet. Råhomogenat kan vara toxiska för celler. Som sådan, använd lägsta volymen möjligt att övervaka önskad effekt. Tidigare testats volymer lysat / brunn intervall frabout 1-5 | il, vilket motsvarar 5-20 | ig totalt protein. Se till att den totala volymen per brunn (frön + reducerad serum media) är 10 l. - Kombinera innehållet från de två rör som beskrivs i 4,1 och 4,2, flick försiktigt för att blanda, kortfattat spinn ner (1000 x g, 5 sek), och inkubera vid rumstemperatur under minst 20 min och upp till 2 timmar.
- Pipettera försiktigt 20 pl transduktion komplex på sidan av individuella biosensor brunnar. Använd tre tekniska replikat, om möjligt. Återgå behandlade cellerna till inkubatorn i 24-48 timmar. Inkubera under samma betingelser som beskrivits i steg 3.6.
OBS: Lämplig negativ kontroll förutsättning för denna inställning är biosensor celler behandlade med tomma liposomer (dvs liposomer reagens + reducerad serum media) eftersom tillämpningen av fosfolipider introducerar en liten förskjutning i fluorescensprofilen relativt Biosensors celler oexponerade till liposomer reagens. - Med användning av en flerkanals pipett aspirera alla cellmedium (150 | il). Trypsinisera (50 | il) celler för 5 min och avbryt reaktionen med 150 pl kylt odlingsmedium. Ta inte med en PBS skölj före trypsinering i detta steg, eftersom det kan orsaka cell lyft- och efterföljande cellförlust. Utesluta kontamine döda celler och skräp under flödescytometri via grind strategier.
- Omedelbart efter släckning, överföra celler till en 96 väl rund bottenplatta, och centrifugera vid 1000 xg under 5 min vid RT.
- Aspirera och kassera medium, var noga med att undvika att störa cellpelleten.
- Försiktigt, men grundligt, resuspendera cellpelleten i 50 | il 2% paraformaldehyd, och inkubera under 10 minuter. Alternativt, kör celler lever, även om fixering ger renare och mer konsekventa resultat.
- Centrifugera cellerna vid 1000 xg under 5 min vid RT. Aspirera och kassera paraformaldehyd, var noga med att undvika att störa cellpelleten.
- Försiktigt, men grundligt, resuspendera cellpelleten i 200 ^ kyld flödescytometri buffert (HBSS, 1% FBS, 1 mM EDTA) och kör plattan så snart som möjligt för att undvika cellklumpning.
- Gör en sidospridning-området (SSC-A) mot Forward Scatter-området (FSC-A) bivariat diagram, och med cellinje # 1 kör, justera SSC och FSC spänningar tills cell befolkningen är i den nedre vänstra kvadranten. Klicka på polygonverktyget, och definiera cellpopulationen (Gate P1). För alla grind parametrar se figur 2.
- Gör en FSC-H (höjd) vs FSC-A bivariat diagram och tillämpa Gate P1 med denna kurva genom att klicka på "live" över tomten och välja P1. Med cellinje # 1kör, klicka på polygonverktyget, och definiera enstaka celler (Gate P2).
- Gör 3 histogram tomter, en för vart och ett av filtren av intresse: GFP, YFP, och FRET. Applicera Gate P2 till alla dessa kurvor genom att klicka "live" ovanför kurvorna, och välja P2. Med cellinje # 1 löpning, justera spänningar så att mediancellpopulationen i den gemensamma fiskeripolitiken, YFP, och FRET histogram är alla mellan 0 och 1. För att mäta gemensamma fiskeripolitiken och FRET, hetsas celler med 405 nm laser, och fånga fluorescens med en 450/50 nm och 525/50 nm filter, respektive. För att mäta YFP, hetsas celler med en 488 nm laser och fånga fluorescens med en 525/50 nm filter. Laser och filterinställningar beskrivs vidare i tabell 2.
- Utför ersättning för den gemensamma fiskeripolitiken spillover i FRET och YFP kanaler.
OBS: Ersättning är processen av fluorescens spillover korrigering. Fluorescens spridningseffekter inträffar när fluorescensemissionen av en fluorokrom upptäcks i ett filter designed att mäta signal från en annan fluorokrom. Med skälig ersättning, kan den gemensamma fiskeripolitiken spillover fluorescens tas bort från FRET och YFP kanaler.
OBS: Ersättning kräver närvaro av både fluorescens -positiva och -negativa celler. Således, för att kompensera på GFP-positiva celler (cellinjen # 2), negativa celler (cellinjen # 1) måste sättas till provet före körningen.- Spike i 30 pl cellinje # 1 suspension från en enda väl till 200 pl cellinje # 2 fjädring omedelbart före kompensera.
- Klicka på ikonen, sedan "ersättning" fliken "Instrumentinställningar", och kontrollera "matris" att öppna kompensationstabellen.
- Gör en FRET-A mot GFP-A bivariat diagram, och tillämpa grind P2, såsom beskrivs i steg 6,3. Med cellinjer 1 + 2 körs, klickar du på "kvadranten" ikonen och dra kvadranter så att fluorescens -negativa och -positiva befolkningar skiljs åt av de nedre två kvadranter (Gates LL3 and LR3, respektive).
- Skapa en statistiktabell som visar medianfluorescensintensitet (MFI) i FRET för LL3 och LR3 grindar. Justera FRET parametern i kompensationsmatrisen tills MFI i FRET signalen är likvärdig mellan LL3 och LR3. Efter detta steg, är MFI av FRET-signalen lika mellan ofärgade celler och GFP-positiva celler, vilket antyder frånvaron av GFP spridningseffekterna på FRET-kanalen.
- Gör en YFP-A mot GFP-A bivariat diagram, och tillämpa grind P2, såsom beskrivs i steg 6,3. Rita kvadranter (LL4 och LR4) liknande den som görs i steg 6.4.3.
- Skapa en statistiktabell som visar MFI av YFP för LL4 och LR4. Justera YFP parametern i kompensationsmatrisen tills MFI i YFP signalen är likvärdig mellan LL4 och LR4. Efter detta steg, är MFI av en YFP-signal lika mellan ofärgade celler och GFP-positiva celler, vilket antyder frånvaron av GFP spillover in YFP kanalen.
- Follpå grund av gate installation och ersättning markerar brunnar av intresse och köra resten av plattan.
- Efter alla prover har körts, export datafiler genom att klicka på "file", sedan "kopia". Välj fliken "datafiler" markerar experimentet mappen och klicka på "kopia".
- Öppna FCS filer i flödescytometrianalys programmet.
- Baserat på spridningsegenskaper, använda en polygonal grind för att definiera cellpopulationen (SSC vs FSC) och sing befolkning (FSC-H vs FSC-A) från celler som behandlats med tomma liposomer, på liknande sätt som beskrivs i avsnitt 6.
- Om den gemensamma fiskeripolitiken ersättning utfördes under installationen, inte ytterligare anpassa den gemensamma fiskeripolitiken.
- Skapa en FRET vs YFP bivariat diagram. Använda cellinje # 3Definierar en falsk FRET grind genom att rita en polygonal grind som löper längs sluttningen av FRET-positiva cellpopulationen. Denna grind utesluter YFP single-positiva celler som avger en signal inom FRET filtret, och dragés liknande den som tidigare visats genom att förbjuda et al., 22
- Definiera en FRET grind genom att avsätta tomma liposom-behandlade GFP / YFP celler på en FRET vs GFP bivariat diagram. Introducera en polygonal grind längs sluttningen av befolkningen som sträcker sig uppåt och åt vänster bort från populationen. Denna port skulle utesluta de flesta celler (~ 99%), så att bakgrunden FRET är ≥1% av celler. Eventuella händelser som skiftar i denna grind betraktas FRET-positiv.
OBS: Varje enskild gate beskrivits ovan tillämpas på alla prover innan bygga efterföljande grindar. Efter analys, fyra individuella grindar definieras (Cell befolkningen, sing, falska FRET, FRET). - Spela analysparametrar av intresse, inklusive: procent FRET positivitet och MFIav FRET-positiva celler. Manuellt beräkna den integrerade FRET densiteten genom mätning av produkten från procent positivitet och MFI.
OBS: Om integrerad FRET densitet används som ett utfallsmått, ställa in bakgrunds FRET (enligt definitionen i steg 7,5) och MFI till större än eller lika med ett för att undvika beräkning av en produkt som är mindre än sina två individuella faktorer.
3. omstryka Biosensor Celler
NOTERA:Använd fyra cellinjer för denna analys: HEK 293T (cellinje # 1), RD-P301S-CFP (cellinje # 2), RD-P301S-YFP (cellinje 3 #), och RD-P301S-CFP / YFP ( cellinjen # 4). Hänvisa Tabell 1 för varje cellinje bidrag till analysen.
4. behandla celler
OBS: Följande dag, när tau biosensorceller är 60-65% sammanflytande, förbereda utsäde överföringskomplex enligt följande:
5. Skörd Celler för FRET flödescytometri
6. FRET flödescytometri
NOTERA: Använd en flödescytometer såsom MACSQuant VYB, som är utrustad med FRET-kompatibel laserlinjer och filteruppsättningar (Tabell 2). För varje steg i detta avsnitt, klicka brunnen av intresse med användning av programvaran 96 brunnar mall och klicka"Spela" för att börja provupptagning och flöde. Gör tomter eller statistiktabeller genom att klicka på "nya analysfönster ikonen. Ändra axelparametrarna på enskilda bivariata tomter genom att klicka på titeln på antingen X eller Y-axeln och välja lämpligt filter. Att flytta cellpopulationer eller fluorescens signaler, öka eller minska de spänningar som förknippas med lämpliga filter. Med detta instrument, kör <1.000 händelser / sek för att säkerställa korrekt encelliga övervakning.
7. Data Analysis
OBS: Byt axelparametrarna på enskilda bivariata tomter genom att klicka på titeln på antingen X eller Y-axeln och välja lämpligt filter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FRET flödescytometri möjliggör känslig, kvantitativ och snabb detektion av sådd aktivitet från rekombinanta eller biologiska prover. Assay setup är enkel: monoklonala härledda stabila cellinjer som uttrycker tau-RD-GFP / YFP transduceras med ympmaterial, inkuberades under 24 till 48 h, och utsattes för flödescytometri-analys (Figur 1A). I avsaknad av frön, biosensorceller upprätthålla tau i en löslig, monomer form (Figur 1B). I närvaro av frön dock biosensorceller omvandlar tau i ett aggregerat tillstånd (Figur 1C), som producerar en FRET-svar som detekteras på en per-cell-basis med flödescytometri. Kvantitativ bedömning visar att biosensorceller svarar på femtomolar koncentrationer av utsäde material och att sådd aktivitet kan effektivt mätas i tre storleksordningar (figur 1D).
Grind parametrar inrättas för att säkerställa detektering av en stue FRET signal, även vid låga koncentrationer utsäde. Först standardgrindmetoder användes för att isolera cellpopulationen (fig 2A) och enstaka celler (figur 2b). Falsk FRET signal kan uppstå direkt aktivering av YFP vid 405 nm laser. Sålunda är ett falskt FRET grind dras från en YFP enkel positiv cellpopulation för att utesluta kontaminerande signalen (fig 2C). Slutligen är FRET-grinden definieras ur unseeded GFP / YFP dubbla-positiva celler (figur 2D). En grind dras nära lutningen av befolkningen som sträcker sig uppåt och åt vänster bort från den. Ostimulerade celler bör ha en bakgrund FRET värdet satt till ca 1%, och FRET-positiva celler kommer att flytta in i denna grind i ett dosberoende sätt (jämför figur 2E och 2F). Flera parametrar beaktas med FRET-flödescytometri, inklusive: procent positivitet (dvs., antalet FRET-positiva celler per totala cell) Och medianfluorescensintensitet (dvs den grad i vilken en FRET svar produceras i en FRET-positiv cell). Integrerad FRET densitet är den föredragna effektmåttet, eftersom det är produkten av dessa två variabler och helt representerar graden av ympning aktivitet inducerad av ett givet prov.
FRET-flödescytometri är kompatibel med P301S tauopathy mushärledda hjärn lysat, även vid unga år, såsom visas i fig 3. Efter mikrodissektion av fyra olika områden i hjärnan, FRET flödescytometri användes för att mäta sådd aktivitet från hjärnstammen (figur 3A), neocortex (Figur 3B), frontalloben (Figur 3C), och hippocampus (figur 3D) i P301S möss över en rad olika åldrar. I varje region, ökad sådd aktivitet med stigande ålder och verkade på bara 1,5 månader. Men tau knockout-möss ("KO")> 12 mos visas aldrig sådd aktivitet. Jämfört med histological analyser utförs inom samma djur, detta är sex veckor tidigare än utseendet på någon annan markör för tau nedfall (figur 3E), inklusive markörer för konforma-avvikande tau (MC1), hyperfosforylerade tau (AT8 och PG5), och amyloid konforma (ThioflavinS). Från en mekanistisk syn, föreslår proximala detektering av tau sådd aktivitet frön som ett orsaks förmedlare av tauopathy debut och / eller progression. Från en experimentell uppfattning tyder detta på att analys av sådd aktivitet kan vara ett idealiskt komplement till standardutfallsmått av tau nedfall, med tanke på dess tidiga och robust utseende.
Förutom transgena möss, FRET flödescytometri är kompatibel med mänskliga hjärnan lysat och kan lätt upptäcka tau aggregat isolerade från Alzheimers sjukdom patienter (Figur 4). När fryst human hjärnvävnad homogeniseras på samma sätt som beskrivits här för P301S hjärn lysat, sådd aktivitetär robust detekteras från alla prover från AD ämnen. Däremot är sådd aktivitet aldrig detekteras från lysat av åldersmatchade eller Huntingtons sjukdomsbekämpning ämnen. Detta understryker analysens specificitet för tau aggregat.
Medan fokus i denna artikel är känslig detektion av tau sådd aktivitet med hjälp liposommedierad leverans av aggregat i HEK 293T biosensorceller, kan mer fysiologiska cellodlings paradigm också utföras med FRET flödescytometri att bedöma grundläggande cellulära upptagningsmekanismer. Till exempel kan primära neuronala kulturer vara infekterade med lentivirus uttrycker tau-RD-gemensamma fiskeripolitiken och tau-RD-YFP konstruktioner vid tidpunkten för plätering. Vid DIV4 är aggregering frånvarande i obehandlade celler (figur 5A), men detekterbar i neuroner behandlade med frö-innehållande materialet (figur 5B). Viktigt är fosfolipider uteslutna i dessa experiment, vilket möjliggör undersökning av fysiologiska och klappa hophysiological seedning mekanismer. Sålunda leder applicering av tau fibriller till neuronal HSPG-medierat upptag och stimulerar aggregation i ett dosberoende sätt som kan kvantifieras med FRET-flödescytometri (figur 5C). Dessutom kan analysen användas för terapeutisk utvärdering av tau upptag och sådd blockad in vitro med användning HEK 293T tau biosensorceller. Även i avsaknad av fosfolipider, både rekombinanta fibriller (figur 5D) och P301S hjärnan lysat (Figur 5E) framkalla tau aggregation. Förinkubation dessa tau frön med heparin (tidigare visat sig vara en potent hämmare av HSPG-medierad tau upptag), men eliminerar deras sådd kapacitet. Denna experimentuppställning skulle kunna tillämpas på vilket som helst läkemedel (t.ex., antikroppar, små molekyler, etc.) och skulle möjliggöra snabb utvärdering av upptag och / eller utsädes-modifierande terapeutika.
figuren 1 "src =" / filer / ftp_upload / 53205 / 53205fig1.jpg "/>
Figur 1. FRET-flödescytometri känsligt detekterar tau sådd aktivitet 16. Monoklonal HEK 293T-celler som uttrycker tau-RD-GFP / YFP transducerades med rekombinanta eller biologiska prover, inkuberades under 24 till 48 h, och analyserades på en enda cellbasis med användning av flödescytometri (A). Ostimulerade celler bibehålla tau-RD ett monomert tillstånd (B), medan celler som behandlas med utsädesinnehållande materialet display prominenta inneslutningar (C). Kvantitativ bedömning (medelvärde ± SEM) av sådd aktivitet visar att FRET flödescytometri är känslig för femtomolar koncentrationer (monomer ekvivalent) rekombinant ympmaterial och detektion sträcker sig över tre storleksordningar (D). Monomer motsvarande representerar den totala mängden protein som finns i fibrillization reaktionen och inte korrigera för den ofullständiga &# 160; inkorporering av monomerer i aggregerat material. Således måste koncentrationen av faktiska aggregat (frön) vara mindre än eller lika med dess "monomer likvärdigt". * Modifierad från Holmes och Furman et al. 16 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. gating strategi för FRET-flödescytometri. Cellpopulation (A) och singlett / dublett (B) grindar är ritade med standard flödescytometri metodik. En falsk FRET-grind (C) dras från YFP enkel positiva celler för att eliminera YFP bleedthrough in FRET filtret. En FRET-grind (D) är konstruerad av tomma liposom-behandlade celler, till exempelden bakgrunden FRET är ≥1%. En flyttningsrörelsen i FRET porten visas efter behandling med utsäde-positiva material (E) och övergången blir alltmer framträdande med större mängder utsäde material (F). Slut avläsningar omfatta. Procent FRET positivitet, medianfluorescensintensitet (MFI) i FRET-positiva händelser, och det integrerade FRET tätheten (Integrated FRET Densitet = Procent positiva celler * MFI) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Progression av tau sådd aktivitet i P301S möss 16. Seedning aktivitet (medelvärde ± SEM) från hjärnhomogenater av P301S möss framgår på 1,5 månader i hjärnstammen (A), Neocortex (B), frontalloben (C), och hippocampus (D). Dock sådd aktivitet aldrig observerats i tau knockoutmöss (> 12 månader). Seedning aktivitet ökar med åldern och föregår uppkomsten av andra vanliga histologiska markörer, däribland MC1, AT8, och PG5 (E). * Återges med tillstånd från Holmes och Furman et al. 16 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. förenlighet FRET flödescytometri med humana biologiska prover 16. När tau-RD-CFP / YFP biosensorceller transduceras med 20 mikrogram mänskliga hjärnan lysat, robust seedning (medelvärde ± SEM) förekommer i alla testade Alzheimers diseaSE hjärnor, medan åldersmatchade och Huntingtons sjukdomsbekämpning lysat saknar sådd aktivitet. * Modifierad från Holmes och Furman et al. 16 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Alternativa tillämpningar för FRET flödescytometri 16. Primära neuroner omvandlade med lentivirus kodning tau-GFP och tau-YFP konstruktioner. I avsaknad av exogena frön finns det ingen uppenbar aggregation (A), men det finns i närvaro av frön (B). Neuronala biosensorer reagerar dosberoende till rekombinanta tau frön, även i frånvaro av fosfolipid-förmedlad leverans (C). Förinkubation av rekombinant (D) eller bimiologiska (E) frötäktsområden med heparin, en hämmare av HSPG-medierad tau utsäde upptag, utarmar FRET lyhördhet HEK 293T biosensorceller. Kvantitativa visar bedömnings (medelvärde ± SEM). * Modifierad från Holmes och Furman et al. 16 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bord 1: Cellinjer som används med FRET flödescytometri. HEK 293T-celler används för flödescytometri installationen. GFP enkel positiva celler används för kompensering (*). YFP enkel positiva celler används för att eliminera falska FRET signal på grund av direkt aktivering av YFP vid 405 nm excitation. GFP / YFP dubbla-positiva celler är FRET-kompatibla och tjänar sombiosensorcellerna. Klicka här för att se en större version av denna tabell.
Tabell 2:. Flödescytometer laser och filterinställningar Klicka här för att se en större version av denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FRET flödescytometri system som beskrivs här är ett kraftfullt verktyg för att snabbt och kvantitativt bedöma tau sådd aktivitet. Det kräver endast måttlig cellodlings erfarenhet och praktiska kunskaper om FRET och flödescytometri. Andra sådd analyser, såsom Thioflavin T - som uppvisar förbättrad fluorescens när de är bundna till beta-arkstruktur - är arbetskrävande och kräver en ren, rekombinant proteinsubstrat. Dessutom, in vitro sådd analyser för tau är endast semi-kvantitativ och allmänt okänslig för subnanomolära nivåer groddmaterial 23,24. FRET flödescytometri tillhandahåller emellertid en kvantitativ och utsökt känsligt mått på sådd aktivitet från antingen rekombinanta eller biologiska prov. Dessutom kan anpassningar av förfarandet gör det lämpligt att studera en mängd olika proteinaggregation störningar.
Medan det protokoll som beskrivs häri fokuserar på tau sådd, är bara enkla ändringar som krävs to göra det möjligt för en användare att övervaka sådd aktivitet från alternativa typer av proteopathic frön. Såsom visas i Holmes och Furman et al., Skapande av en monoklonal cellinje som stabilt uttrycker α-synuklein härbärgerande sjukdomsassocierade A53T mutation taggade till antingen GFP eller YFP aktiverat känslig detektering av sådd aktivitet från fullängds a-synuklein rekombinanta fibriller 16 . Liknande experiment har utförts med hjälp av huntingtin biosensorceller, som också effektivt upptäcka proteinaggregation. Således, genom att helt enkelt modifiera protein biosensor, FRET flödescytometri är kompatibel med ett stort antal källor utsäde. Andra ändringar i analysen, inklusive behandling paradigm och cellmodell, kan användas för att göra FRET flödescytometri mer tillämplig för att bedöma fysiologiska mekanismer. I detta protokoll har frön direkt infördes i biosensorceller via liposomförmedlad transduktion som ett sätt att öka känsligheten.
Det är viktigt att not, dock att detta inte är ett krav. Tau aggregat från rekombinanta eller mus biologiska prover fortfarande kan sådd biosensorceller i frånvaro av liposomer (Figur 5). Således, labb intresserade av att studera fysiologiska förökning och / eller upptagningsmekanismer av tau frön kan fortfarande utnyttja analysen. Dessutom FRET flödescytometri är kompatibel med primära neuronala kulturer. Genom att infektera celler med CFP- och YFP-kodade lentivirala konstruktionerna vid plätering, är effektiv FRET svars uppnås vid nanomolära koncentrationer efter behandling med rekombinanta tau fibriller, även i frånvaro av liposomer (fig 5). Sammantaget indikerar dessa data att FRET flödescytometri är användbart för att studera fysiologiska mekanismer för ympning för en mängd olika proteinaggregat och i multipla cellodlingsmodeller.
Medan FRET flödescytometri systemet är användarvänligt och anpassningsbara, bör vissa viktiga steg varaföljas för att säkerställa kompatibilitet, inklusive provberedning och korrekt cell confluency vid behandlingstillfället. Hög intensitet ultraljudsbehandling med sond av hjärnprover är avgörande för en effektiv och optimal isolering av sådd aktivitet. Under utveckling och optimering, konstaterades att att denna metod är över 10 gånger mer effektiva på att isolera sådd aktivitet från P301S mushjärnor i förhållande till andra vanliga metoder, t ex hand homogenisering. Det är möjligt att mycket stora tau aggregat har en relativt låg sådd benägenhet, och att ultraljudsbehandling med sond är mest effektiv för att bryta dessa aggregat i mindre, utsädeskompatibla fragment. Varaktighet och frekvens av ultraljudsbehandling kan ändras vid behov, även om de inställningar som beskrivs ovan rekommenderas för känslig detektion av sådd aktivitet.
Cell konfluens vid tidpunkten för behandling är också av yttersta vikt, eftersom det påverkar både känslighet och cell hälsa. Om celler enre alltför sammanflytande, gör de inte med lätthet ta upp fosfolipider och frömaterial och därmed dramatiskt minskar känsligheten. Om confluency är för låg, kan tillsats av fosfolipider och frömaterial vara giftiga. Empirisk testning visar att en biosensor confluency på 60-65% är optimalt för behandling och efterföljande lyhördhet.
Som påpekas i protokollet, är kompensations algoritmer används regelbundet för att utesluta GFP spridningseffekter i YFP och FRET kanaler, och därmed eliminera falska signaler och öka känsligheten. För en snabbare och kvalitativ bedömning av sådd aktivitet, men detta steg kan utelämnas eller utföras i efterhand med hjälp av flödescytometri analysprogram. En renare och mer robust signal erhålles följande ersättning, dock, och därmed också för den mest rigorösa och kvantitativ analys detta steg rekommenderas starkt.
En begränsning av analysen är dess oförmåga att rapportera om biokemiska sammansättningde proteopathic frön. Den aktuella analysen mäter sådd aktivitet, en funktionell egenskap av frön. Fastställande av den biokemiska och biofysiska karaktär fröna kommer att kräva koppling till traditionella analyser såsom immunfällning, kromatografi, cirkulär dikroism, masspektrometri, etc. Inte desto mindre kommer denna analys vara till nytta för att utvärdera sådd potens som en slutpunkt från otaliga prover.
Denna analys nyligen använts för att kvantifiera och karakterisera tidsförloppet för sådd utveckling och progression i P301S möss i förhållande till andra gemensamma markörer för tau nedfall, såsom histologiska fläckar. I denna studie, tau sådd aktivitet var uppenbar under sex veckor före den tidigaste histologiska markör (MC1) som vi testade 16. Med tanke på dess tidiga utseende, kan sådd aktivitet utgör en viktig kompletterande, eller till och med alternativ, resultatmått för att utvärdera effekten av terapeutiska ingrepp, åtminstone för förstudier.Genom att förkorta behandlingskur och studera yngre djur, boendekostnader och experimentell handläggningstid kommer att minska. Det är tänkbart att läkemedel kan administreras till P301S möss vid 4-6 veckor och hjärnor utvärderades för sådd aktivitet 2-4 veckor senare. Alternativt kan utvärdering av anti-tau läkemedel i celler utföras inom några dagar genom att bedöma deras förmåga att blockera induktion av sådd aktivitet i biosensorceller, såsom visas i Figur 5.
Sammanfattningsvis FRET flödescytometri sådd analys är ett enkelt och effektivt sätt att upptäcka tau sådd från rekombinanta eller biologiskt ursprung. Dess känslighet är oöverträffade av andra in vitro-tau sådd analyser, och den kan användas för att detektera den tidigaste patologiska förändringen i P301S tauopathy möss. Dessutom dess flexibilitet i övervakningen många proteopathic frön under olika behandlingsförhållanden, och med flera cellodlingsmodeller, gör den användbar förnågon proteinaggregering laboratorium intresserade snabbt samla in kvantitativa data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TBS | Sigma | T5912 | |
| cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-free) | Roche | 4693159001 | |
| Cryo-vials | Sarstedt | 72.694.006 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 105DU | |
| Weighing Boats | Fisher Scientific | 13-735-743 | |
| 15 ml conical tube | USA Scientific | 1475-0501 | |
| Omni Sonic Ruptor Ultrasonic Homogenizer | Omni International | 18-000-115 | |
| Micro-Tip for Ultrasonic Homogenizer | Omni International | OR-T-156 | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A451 | |
| Noise Cancelling Ear Muffs | Fisher Scientific | 19-145-412 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | S47299 | |
| 1.5 ml tubes | USA Scientific | 1615-5510 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 000.215 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-136 | |
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| 50 ml Conical Tubes | Phenix Research | SS-PH15 | |
| 25 ml reagent resevoirs | VWR | 41428-954 | |
| Multi channel pipet | Fisher Scientific | TI13-690-049 | |
| 96 well flat bottom plates | Corning | 3603 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| 96 well round bottom plates | Corning | 3788 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED2SS | |
| HBSS | Life Technologies | 14185-052 | |
| Sorvall ST 40 Centrifuge | Thermo Scientific | 75004509 | |
| BIOLiner Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientific | 75003796 | |
| Hemacytometer | VWR | 15170-172 | |
| MACSQuant VYB Flow Cytomter | Miltenyi Biotec | 130-096-116 | |
| Chill 96 Rack | Miltenyi Biotec | 130-094-459 | |
| Flow Jo analysis software | Flow Jo | ||
| 20 μl pipet tips | Rainin | GPS-L10 | |
| 200 μl pipet tips | Rainin | GPS-250 | |
| 1 ml pipet tips | Rainin | GPS-1000 | |
| 200 μl pipet tips | USA Scientific | 1111-1800 | |
| 5 ml serological pipett | Phenix Research | SPG-606180 | |
| 10 ml serological pipett | Phenix Research | SPG-607180 | |
| 25 ml Serological pipett | Phenix Research | SPG-760180 |
References
- Seeley, W. W., Crawford, R. K., Zhou, J., Miller, B. L., Greicius, M. D. Neurodegenerative diseases target large-scale human brain networks. Neuron. 62 (1), 42-52 (2009).
- Zhou, J., Gennatas, E. D., Efstathios, D., Kramer, J. H., Miller, B. L., Seeley, W. W. Predicting Regional Neurodegeneration from the Healthy Brain Functional Connectome. Neuron. 73 (6), 1216-1227 (2012).
- Raj, A., Kuceyeski, A., Weiner, M. A Network Diffusion Model of Disease Progression in Dementia. Neuron. 73 (6), 1204-1215 (2012).
- Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).
- Braak, H., Braak, E. Staging of Alzheimer's disease-related neurofibrillary changes. Neurobiol Aging. 16 (3), 271-278 (1995).
- Frost, B., Diamond, M. I. Prion-like mechanisms in neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 11 (3), 155-159 (2009).
- Holmes, B. B., Diamond, M. I. Cellular mechanisms of protein aggregate propagation. Current Opinion in Neurology. 25 (6), 721-726 (2012).
- Kaufman, S. K., Diamond, M. I. Prion-like propagation of protein aggregation and related therapeutic strategies. Neurotherapeutics. 10 (3), 371-382 (2013).
- Holmes, B. B., Diamond, M. I. Prion-like properties of Tau protein: the importance of extracellular Tau as a therapeutic target. J Biol Chem. 289 (29), 19855-19861 (2014).
- Guo, J. L., Lee, V. M. Cell-to-cell transmission of pathogenic proteins in neurodegenerative diseases. Nat Med. 20 (2), 130-138 (2014).
- Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell. J Biol Chem. 284 (19), 12845-12852 (2009).
- Guo, J. L., Lee, V. M. Y. Seeding of normal tau by pathological tau conformers drives pathogenesis of Alzheimer-like tangles. Journal of Biological Chemistry. , (2011).
- Holmes, B. B., et al. Heparan sulfate proteoglycans mediate internalization and propagation of specific proteopathic seeds. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), E3138-E3147 (2013).
- de Calignon, A., et al. Propagation of Tau Pathology in a Model of Early Alzheimer's Disease. Neuron. 73 (4), 685-697 (2012).
- Liu, L., et al. Trans-Synaptic Spread of Tau Pathology In Vivo. PLoS One. 7 (2), e31302 (2012).
- Holmes, B. B., et al. Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), E4376-E4385 Forthcoming.
- Yoshiyama, Y., et al. Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model. Neuron. 53 (3), 337-351 (2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. 65 (65), (2012).
- Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse. J Vis Exp. (33), (2009).
- Yan, Z. X., Stitz, L., Heeg, P., Pfaff, E., Roth, K. Infectivity of prion protein bound to stainless steel wires: a model for testing decontamination procedures for transmissible spongiform encephalopathies. Infect Control Hosp Epidemiol. 25 (4), 280-283 (2004).
- McDonnell, G., et al. Cleaning, disinfection and sterilization of surface prion contamination. J Hosp Infect. 85 (4), 268-273 (2013).
- Banning, C., et al. A flow cytometry-based FRET assay to identify and analyse protein-protein interactions in living cells. PLoS One. 5 (2), e9344 (2010).
- Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. Conformational Features of Tau Fibrils from Alzheimer's Disease Brain Are Faithfully Propagated by Unmodified Recombinant Protein. Biochemistry. , (2013).
- Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein. J Vis Exp. (95), e51537 (2015).
