Introduction
Накопление внутриклеточного тау амилоидами определяет тауопатий, таких как болезнь Альцгеймера. В стадии ранней болезни, патологии, как правило, локализованы в отдельных участках головного мозга, но с прогрессированием заболевания, патологии неизменно распространяется по различным нейронных сетей 1-5. Накопленные данные свидетельствует о распространении трансцеллюлярного токсичных белковых агрегатов лежит в основе этой патологии (обзор в 6-10). В этой модели, proteopathic семена (например, тау) освобождаются от донорских клеток и введите соседние клетки, превращая нативного белка тау в виде неправильно свернутых через шаблонный конформационного изменения 11-15. Анализ, описанный здесь был разработан, чтобы чутко обнаружить такую деятельность посева. Он совместим с рекомбинантного белка и биологических образцов и позволяет количественно оценить минуту уровней proteopathic посева деятельности 16.
НЕК 293Т клеток, которые стабильно экспрессируют тау повтора Domain (РД), содержащий, ассоциированных с заболеваниями P301S мутацию, слитый либо CFP YFP или (в дальнейшем упоминается как тау-RD-КФП / YFP клеток) служат стабильной биосенсора посева активности. При отсутствии proteopathic семян, клетки поддерживать тау в виде растворимого мономера, и не имеют никакого заметного фона ладу. Спонтанное поглощение или опосредованную липосомами трансдукции семян тау в клетки, однако, приводит к RD-CFP и агрегации РД-YFP, который производит сигнал FRET, который измеряется в отдельные клетки с помощью проточной цитометрии.
Многочисленные компоненты этого анализа были разработаны для повышения чувствительности и снижения изменчивости. Моноклональное клеточную линию с соотношением 1: экспрессии РД-КФП / YFP 1 была выбрана, поскольку она обеспечивает оптимальную сигнал: шум. Для повышения чувствительности, фосфолипиды использованы для введения семена непосредственно в клетках (хотя для изучения биологических механизмов захвата, это может быть опущен). Наконец, проточной цитометрии мониторы FRET на уровне популяции и одной клетки Уровень, в отличие от других агрегации белков анализов. Окончательный результат мера, интегральная плотность ладу весьма количественный и счета и по количеству клеток с агрегацией, и степень, в которой произошло объединение в каждой ячейке. Все эти оптимизированными параметрами повышения чувствительности и обеспечения воспроизводимости.
Эта система была недавно занятых в комплексном исследовании в трансгенных мышей P301S tauopathy 17, которые оценивали временной возникновение и прогрессирование тау посев деятельности по отношению к другим, обычно используется тау патологических маркеров (например, МС1, AT8, PG5 и ThioflavinS). Посев активность на сегодняшний день является ранним и самым надежным маркером тау патологии оценивается, предшествующего гистологического обнаружения, по крайней мере 6 недель. Посев активность появляется в 1,5 месяцев и увеличивается постепенно с возрастом, предполагая причинную роль proteopathic семян в начале и / или прогрессирования нейродегенерации 16.
e_content "> Точная количественный мельчайших уровнях семенного материала из биологических образцов могут облегчить учебу, которые контролируют развитие на ранней стадии болезни. Сократив продолжительность проб и позволяет использовать более молодых животных, это может повысить эффективность и точность доклинических испытаний на животных. Например, в P301S мыши описано ранее, соединения свинца могут быть доставлены уже в 4-6 недель (непосредственно перед или в момент начала посева деятельности), и контролироваться на предмет эффективности через 2-4 недели. Анализ должен точно количественно-либо сокращений в посеве деятельность. FRET проточной цитометрии была в пробирке отбора заявок, а также. Например, анти-тау реактивы (например, антитела, малые молекулы, и т.д.) могут быть быстро проверены на их способность блокировать посев индукции непосредственно в культуре, используя либо рекомбинантный тау агрегаты или мозга, полученных лизаты в качестве источника семян (рис 5). С этой установкой, когда семенной материал готов, бывшийперимента занимает всего три дня, чтобы закончить, в том числе анализа данных. Быстрое количественное определение proteopathic посева деятельности может способствовать, таким образом, множество исследований нейродегенерации.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол подчеркивает использование FRET проточной цитометрии для обнаружения посева деятельность из биологических образцов мыши. Он также совместим с рекомбинантными фибрилл и биологических образцов человека. Мышь эвтаназии и мозг сбор был проведен в соответствии с IACUC утвержденных процедур.
1. Мозг Добыча
- После глубокого обезболивания с изофлуран (2%), заливать мышь ледяной PBS, содержащий 0,03% гепарина, и извлекать мозг следующую деталей, описанных в Gage и соавт. 18
- Поместите извлеченный ткани в крио-флакон, и оснастки замораживание путем размещения в жидком азоте. В качестве альтернативы, заморозить ткани на сухом льду. После заморожены, передавать ткани -80 ° C и хранят в течение длительного периода времени, если это необходимо.
Примечание: Этот протокол совместим с целыми гомогенатах мозга или микро-рассеченные областях головного мозга. См Hagihara др. Для детального протокола микро-рассечение 19. 2. Подготовка семенного материала биологическом - Подготовьте буфере для гомогенизации путем растворения ингибиторов протеазы (ЭДТА) в свободное 1x TBS (1 таблетка на 10 мл). Вихрь энергично, и хранить на льду. Ингибиторы протеазы должны быть свободными ЭДТА, чтобы сохранить жизнеспособность клеток биосенсора.
- Взвесьте замороженные ткани головного мозга в одноразовом взвешивании лодки, и передать в 5 мл коническую трубку. Добавить ледяной буфере для гомогенизации таким образом, что конечный раствор 10% вес / объем. Временно хранить на льду. Масса тканей и объем буфера последующее усреднение будет варьироваться в зависимости от размера мозга и / или регионах используются. Здесь An hemibrain взрослой мыши весом 0,2 г суспендируют в 2 мл на 10% вес / объем.
- Образцы передачи в холодной комнате, и настроить зонд ультразвукового к соответствующим настройкам. Для зонда ультразвуком с Omni Ruptor (как показано здесь), установить власть на 20%, что соответствует примерно 75 В. использовать режим импульса, чтобы обеспечить образцы не О.В.э нагревают в течение ультразвуком. Установите генератор импульсов на 30%, что соответствует приблизительно 500 мс.
- Очистите кончик зонда ультразвуком путем промывки водой, изопропанол, и воды снова, вытирая зонд между каждого решения. Будьте уверены, чтобы промыть и протереть обе стенки и дно зонда с LAB-салфеток.
- Работа с одного образца, в то время, погрузите наконечник щупа в буфер гомогенизации, и начать ультразвукового. Использование питания и генератор импульсов параметры, описанные выше, обеспечивают 25 Всего импульсы. Убедитесь, что ткань полностью в суспензии. Будьте осторожны, чтобы избежать пенообразования образца во время этого шага.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы подвержены пеной, если а) общий объем низкий или б) гомогенат нагреется. С этого конкретного документа, не разрушать ультразвуком с объемами меньше, чем 250 мкл. Чтобы обеспечить образцы остаются охлажденные, трубки могут храниться на льду во время этого этапа. - Очистите датчик по вытирая остаточного лизата, затем доставить 10 импульсов в стакане Oе чистая вода. Промыть стенки и дно зонда с водой, изопропанол, и воды снова (как в шаге 2.4), вытирая сухой после каждого шага. Чтобы избежать загрязнения, тщательно промыть датчик в между образцами.
ПРИМЕЧАНИЕ: тау агрегатов, мы не нашли, что более строгие методы очистки необходимы для предотвращения загрязнения образца к образцу. Другие амилоиды, однако, может потребоваться дополнительный уход, который был широко описаны в литературе 20,21. - Магазин гомогенатах на льду, пока все образцы не были обработаны.
- Спин гомогенаты на 21,300 мкг в течение 15 мин при 4 ° С.
- Перенести супернатант в чистую пробирку, стараясь не потревожить осадок. Откажитесь от гранул. Алиготе супернатант и хранить лизатов при -80 ° C для дальнейшего использования. Избегать замораживания / оттаивания циклов гомогенатах, однако, так как это снижает эффективность посева.
- В стерильных условиях, аспирация культуральную среду. Промыть теплой клетки PBS, и аспирата. Trypsinize клетки (3 мл трипсина-ЭДТА (0,05%)) в течение 3 мин, гасили теплой культуральной средой (9 мл DMEM, 10% FBS, 1% ручка / стрептококк, 1% GlutaMAX), и сразу же передавать ячейки в коническую трубку.
- Центрифуга клетки при 1000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Аспирируйте среднего, и ресуспендируют осадок клеток в теплой питательной среде.
- С помощью гемоцитометра, определить плотность клеток для каждой клеточной линии. Плотность клеток будет меняться в зависимости от сплошности во время уборки и объема ресуспендирования. Ресуспендируют клетки, полученные из 10-см чашку на 90% слияния в 10 мл среды для плотности клеток, чтобы быть около 1 млн клеток / мл.
- Делатьмастер микс клеток + носители, такие, что каждую лунку 96-луночного планшета будет содержать 35000 клеток в 130 мкл среды (например, сделать мастер смеси на 100 скважин, ресуспендируйте 3,5 миллионов клеток в 13 мл среды). Измените количество клеток с учетом индивидуальных экспериментальных конструкций и сроки. Для лечения клеточного ~ 18 ч после посева, добавить 35000 клеток в каждую лунку 96-луночного планшета.
- Использование пипетки многоканальный, медленно пипетки 130 мкл суспензии клеток Master Mix в каждую лунку плоским дном, тканевой культуры обработанных 96-луночный планшет. В то время как покрытие, поместить кончик пипетки в центре скважины, не касаясь дна пластинки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя покрытие формат может быть изменен, делая N = 4 лунки для каждой из клеточных линий 1-3 за тарелку рекомендуется. Остальная часть пластины (п = 84) зарезервировано для клеточной линии # 4 (биосенсор клеток). - Разрешить клетки урегулировать оставляя пластины нетронутой в течение 10 мин при комнатной температуре. Инкубируйте o / n при 37 ° С, 5% СО 2, и &# 8805; 80% относительной влажности.
- В одну пробирку, объединить реагента для трансфекции, например, Липофектамина, с пониженным содержанием сывороточных средах, таких как Opti-MEM, чтобы сделать мастер смеси. За хорошо, добавить 1,25 мкл реагента для трансфекции и 8,75 мкл сниженной сыворотке СМИ. Флик трубку осторожно перемешать, кратко спином вниз, и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
- В другую пробирку, объединить семенного материала (аликвоты лизата из стадии 2.9) с уменьшенной в сыворотке СМИ.
Примечание: Объем посевного материала будет варьироваться в зависимости от индивидуального эксперимента. При выборе объема семян, принимать во внимание: обилие семян в образце и потенциальной токсичности. Сырая гомогенаты могут быть токсичными для клеток. Таким образом, использовать минимально возможную громкость, чтобы контролировать желаемого эффекта. Ранее проверенные объемы лизата / лунку диапазоне фрOM 1-5 мкл, что соответствует 5-20 мкг общего белка. Убедитесь, что общий объем на лунку (семена + уменьшается в сыворотке СМИ) 10 мкл. - Комбинат содержимое из двух трубок, описанных в 4.1 и 4.2, фильм нежно перемешать, кратко спином вниз (1000 XG, 5 сек), и инкубировать при комнатной температуре в течение, по крайней мере 20 мин и до 2 часов.
- Аккуратно пипетки 20 мкл трансдукции комплекса на стороне отдельных скважин биосенсора. Используйте три технических повторов, если это возможно. Возврат обработанных клеток в инкубатор на 24-48 часа. Инкубируют при тех же условиях, как описано в шаге 3.6.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующий состояние отрицательного управления для этой установки является биосенсорные клетки, обработанные с пустыми липосомами (т.е. липосом реагента + уменьшается в сыворотке СМИ), потому что применение фосфолипидов вводит небольшое смещение в профиле флуоресценции по отношению к биосенсора клетки неэкспонированных в липосомы реагента. - Использование пипетки многоканальный, аспирации всех клеточных среду (150 мкл). Trypsinize (50 мкл) клетки в течение 5 мин, и гасят 150 мкл охлажденного культуральной среде. Не включать полоскание PBS до трипсинизации на этом этапе, так как это может привести к клеточной подъема и последующего потерю клеток. Исключить любые загрязняющие мертвые клетки и мусор во время проточной цитометрии через стратегии селекции.
- Сразу после закалки, передачи клеток в 96-луночных круглодонных пластины и центрифуги при 1000 мкг в течение 5 мильп при комнатной температуре.
- Аспирируйте и отбросить среду, заботясь, чтобы не потревожить осадок клеток.
- Осторожно, но тщательно, ресуспендируют осадок клеток в 50 мкл 2% параформальдегида и инкубировали в течение 10 мин. Кроме того, работают клетки живут, хотя фиксация обеспечивает более чистых и последовательные результаты.
- Центрифуга клетки при 1000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Аспирируйте и отбросить параформальдегида, заботясь, чтобы не потревожить осадок клеток.
- Осторожно, но тщательно, ресуспендируют осадок клеток в 200 мкл охлажденного буфера проточной цитометрии (HBSS, 1% FBS, 1 мМ ЭДТА) и запустить пластину как можно скорее, чтобы избежать образования комков клеток.
- Сделать бокового рассеяния-уголок (SSC-А) против рассеяния вперед-зоны (FSC-A) двумерного участка, и клеточной линии # 1 подряд, отрегулируйте напряжение SSC и FSC, пока популяция клеток не находится в нижнем левом квадранте. Выберите инструмент многоугольник, и определить популяцию клеток (Ворота P1). Для всех параметров стробирующих рисунок 2.
- Сделайте FSC-H (высота) против FSC-двумерный участок, и применить ворота Р1 этом участке, нажав "живой" над сюжетом, и выбрав P1. С клеточной линии # 1работает, выберите инструмент многоугольник, и определять отдельные клетки (Ворота P2).
- Сделайте 3 гистограммы участки, один для каждого из фильтров, представляющих интерес: CFP YFP, и ладу. Применить ворота P2 для всех этих участков, нажав "живой" над участков и выбора P2. С клеточной линии # 1 подряд настроить напряжения таким образом, что средний клеточной популяции в CFP, YFP, и FRET гистограммы все между 0 и 1. Для измерения CFP и FRET, возбуждают клетки 405 нм лазера, и захват флуоресценции с 450/50 525/50 нм и нм фильтра, соответственно. Для измерения YFP, возбуждают клетки с 488 нм лазера и захвата флуоресценции с 525/50 нм фильтра. Лазерные и фильтр параметров дополнительно описаны в таблице 2.
- Выполните компенсацию за CFP перелива в каналах FRET и YFP.
ПРИМЕЧАНИЕ: Компенсация процесс коррекции флуоресценции перелива. Флуоресценции перелив происходит всякий раз, когда флуоресцентное излучение одной флуорохромом обнаружении в течение фильтр ДезиGNED для измерения сигнала от другого флуорохромом. При правильном компенсации флуоресценции CFP перелива может быть удален из каналов FRET и YFP.
ПРИМЕЧАНИЕ: Компенсация требует присутствия обоих флуоресценции положительные и -отрицательные клеток. Таким образом, чтобы компенсировать на CFP-позитивных клеток (клеточная линия # 2), отрицательные клетки (линию клеток # 1), должны быть добавлены к пробе до начала запуска.- Спайк в 30 мкл клеточной линии # 1 подвески из одной скважины в 200 мкл клеточной линии # 2 подвески непосредственно перед компенсацией.
- Нажмите на иконку "Настройки прибора", то вкладка "компенсации", и проверьте '' матрицу, чтобы открыть таблицу компенсации.
- Сделайте FRET-A против CFP-A двумерной участка, и применить ворота P2, как описано в шаге 6.3. С клеточных линий 1 + 2 подряд, щелкните значок "Квадрант" и привлечь квадранта, так что население флуоресценции -отрицательные и -позитивных разделены нижних двух квадрантов (Гейтс LL3й LR3, соответственно).
- Создайте таблицу статистики, которая отображает средний интенсивности флуоресценции (MFI) в FRET для LL3 и LR3 ворот. Отрегулируйте параметр FRET в компенсации матрицы до МФО сигнала FRET не эквивалентны между LL3 и LR3. После этого шага, ИТР сигнала FRET равна между неокрашенных клеток и CFP-положительных клеток, что свидетельствует об отсутствии CFP перелива в канал FRET.
- Сделайте YFP-A против CFP-A двумерной участка, и применить ворота P2, как описано в шаге 6.3. Нарисуйте квадранта (LL4 и LR4), аналогичные сделано в шаге 6.4.3.
- Создайте таблицу статистики, который отображает ИТР YFP для LL4 и LR4. Отрегулируйте параметр YFP в компенсации матрицы до МФО сигнала YFP не эквивалентны между LL4 и LR4. После этого шага, ИТР сигнала YFP равна между неокрашенных клеток и CFP-положительных клеток, что свидетельствует об отсутствии CFP перелива в канал YFP.
- Фоллявследствие установки ворот и компенсации, выделите скважин интересов и запустить оставшуюся часть пластины.
- После того как все образцы были бежать, файлы экспорта данных, нажав "Файл", затем "копию". Выберите вкладку "Файлы данных", выделите папку эксперимент, и нажмите кнопку «Копировать».
- Открытые файлы FCS в проточной цитометрии программы анализа.
- На основании свойств рассеяния, использовать многоугольный ворота, чтобы определить популяции клеток (SSC против ЛПС) и синглетный население (FSC-H против FSC-A) из клеток, обработанных липосомами пустых, аналогично тому, как описано в разделе 6.
- Если компенсация СФП была выполнена во время установки, в дальнейшем не отрегулировать CFP.
- Создать FRET против YFP двумерной участка. Использование клеточной линии # 3, Определить ложное FRET ворота, опираясь многоугольной ворота, идущей вдоль склона FRET-положительных клеточной популяции. Эти ворота исключает YFP отдельные позитивные клетки-что излучают сигнал в течение лада фильтра, и обращается похож на ранее показано Запрет др. 22
- Определить FRET ворота, откладывая пустые липосомы обрабатывали КФП / YFP клетки на FRET против CFP двумерной участка. Представьте многоугольную ворота по склону населения, которая простирается вверх и влево от населения. Эти ворота должны исключать большинство клеток (~ 99%), так что фон FRET является ≥1% клеток. Любые события, которые изменяют в эти ворота считаются FRET-положительным.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый ворота, описанный выше, применяется для всех образцов до построения последующих ворота. После анализа, четыре индивидуальных ворота определен (клеточной популяции; синглет; ложь FRET; FRET). - Параметры анализа Запись интересов, в том числе: процентов FRET положительности и МФОиз FRET-позитивных клеток. Вручную расчета интегральной плотности FRET путем измерения продукта процентного позитива и МФО.
Примечание: Если интегрированы плотности FRET используется в качестве критерия оценки, установленного фонового FRET (как определено в пункте 7.5) и MFI больше или равна 1, чтобы избежать вычисления произведения, которое меньше двух отдельных факторов.
3. Replating биосенсора Клетки
ЗАМЕТКА:Использование четырех клеточных линий для этого анализа: НЕК 293T (клеточная линия # 1), РД-P301S-CFP (клеточная линия # 2), РД-P301S-YFP (клеточная линия # 3), и РД-P301S-КФП / YFP ( клеточная линия № 4). Пожалуйста, ссылки Таблицу 1 за вклад каждой клеточной линии к анализа.
4. Лечение Клетки
ПРИМЕЧАНИЕ: На следующий день, когда тау биосенсорные клетки 60-65% сливной, подготовить семена трансдукции комплексы следующим образом:
5. Сбор Клетки для FRET проточной цитометрии
6. FRET проточной цитометрии
Примечание: С помощью проточного цитометра такие как MACSQuant VYB, который оснащен FRET-совместимый лазерные линии и наборы фильтров (таблица 2). Для каждого шага в этом разделе, нажмите хорошо интереса, используя шаблон 96 также программного обеспечения, и нажмите"Играть", чтобы начать захват образца и поток. Сделать участков или статистики таблицы, нажав значок 'новом окне анализа ». Изменить параметры оси, на отдельных участках двумерных нажав название либо на Х или Y оси и выбрав соответствующий фильтр. Для переключения клеточных популяций или сигналов флуоресценции, увеличить или уменьшить напряжение, связанные с соответствующими фильтрами. С этим инструментом, запустите <1000 событий / сек, чтобы обеспечить точный контроль одноклеточных.
Анализ данных 7.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изменить оси на отдельных участках двумерных нажав название либо на Х или Y оси и выбрав соответствующий фильтр.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FRET проточной цитометрии позволяет чувствительной, количественные, и быстрое обнаружение посева деятельности от рекомбинантных или биологических образцов. Установка Анализ поверхностное: моноклональные полученных устойчивых клеточные линии, экспрессирующие тау-RD-CFP / YFP которые трансдуцированных семенного материала, инкубировали в течение 24-48 ч и подвергали проточной цитометрии (фиг.1А). При отсутствии семян, биосенсор клетки поддерживают тау в растворимой форме, мономерного (Фиг.1В). В присутствии семян, однако, биосенсор клетки превращают тау в агрегированном состоянии (Рис 1С), производя реакцию FRET, который обнаруживается на клетке-за основе с помощью проточной цитометрии. Количественная оценка показывает, что биосенсоры клетки реагируют на фемтомолярных концентрации семенного материала и что посев деятельность может быть эффективно измеряется по трем порядков (рис 1D).
Параметры стробирования были созданы, чтобы обеспечить обнаружение TRUE сигнал FRET, даже при низких концентрациях семян. Во-первых, стандартные методы стробирования используются, чтобы изолировать популяции клеток (рис 2А) и отдельные клетки (рис 2б). Ложные сигнал FRET может возникнуть из прямой активации YFP по 405 нм лазера. Таким образом, ложной FRET ворота обращается с YFP одного положительного клеточной популяции, чтобы исключить загрязняющих сигнал (рис 2С). Последнее, лада ворота определяется из Unseeded КФП / YFP двойной-позитивных клеток (Рис 2D). Ворота обращается около склоне населения, которая простирается вверх и влево от него. Нестимулированные клетки должны иметь фон FRET установлен на приблизительно 1% стоимости, и FRET-позитивные клетки будут переходить в эти ворота в зависимости от дозы (сравните рис 2Е и 2F). Несколько параметров учитываются с FRET проточной цитометрии, в том числе: процентов положительности (т.е., количество FRET-позитивных клеток в общего числа клеток) И медиана интенсивности флуоресценции (т.е. степень, до которой ответ FRET получают в FRET-позитивных клеток). Плотность Интегрированный FRET является предпочтительным критерием оценки, как это произведение этих двух переменных и полностью отражает степень посева активности, вызванное любым данного образца.
FRET проточной цитометрии совместим с P301S tauopathy мыши, полученные лизаты мозга, даже в раннем возрасте, как показано на рисунке 3. После микродиссекции четырех различных областей головного мозга, FRET проточной цитометрии был использован для измерения посева активность из мозга (Фиг.3А), кора головного мозга (3В), лобной доли (3С), и гиппокамп (рис 3D) в P301S мышей более разных возрастов. В каждом регионе, посев деятельность увеличивается с возрастом и, казалось, всего в 1,5 месяцев. Тем не менее, тау нокаут мышей ("КО")> 12 мес не отображается посева деятельность. По сравнению с чistological анализ выполняется в тех же животных, это шесть недель раньше, чем появление любой другой маркер осаждения тау (рис 3Е), в том числе маркеров конформационно-аномальным тау (МС1), гиперфосфорилированного тау (AT8 и PG5), и амилоид конформации (ThioflavinS). С механистической точки зрения, ближний обнаружение тау посева семян деятельности предполагает как причинного медиатора tauopathy начала и / или прогрессирования. С экспериментальной точки зрения, это говорит о том, что анализ посева деятельности может быть идеальным дополнением к стандартным результатов мер осаждения тау, учитывая его рано и надежный внешний вид.
В дополнение к трансгенных мышей, лада проточной цитометрии совместим с лизатов головного мозга человека и может легко обнаружить тау агрегатов, выделенных из субъектов с болезнью Альцгеймера (рис 4). При замороженном человеческий мозг Ткань гомогенизируют в том же образом, как описано здесь P301S лизатов мозга, посева активностьв энергично обнаружено из всех образцов, полученных из субъектов AD. В отличие от этого, посев деятельность никогда не обнаруживается из лизатов соответствующего возраста или Хантингтона субъектов борьбы с болезнью. Это подчеркивает специфичность анализа для тау агрегатов.
В то время как в центре внимания данной статьи является чувствительным обнаружение тау посева деятельности с использованием липосом-опосредованной доставки агрегатов в НЕК 293T биосенсоров клеток, более физиологические клеточных культур парадигмы также может быть выполнена с FRET проточной цитометрии для оценки основных механизмов клеточного поглощения. Например, первичные нейроны культуры могут быть заражены лентивирус выражения тау-RD-CFP и тау-RD-YFP строит во время посева. В div4, агрегация отсутствует в необработанных клетках (рис 5А), но обнаруживаются в нейронах, обработанных семян, содержащих материал (рис 5B). Важно отметить, что фосфолипиды исключены в этих экспериментах, позволяя расследование физиологические и погладить hophysiological механизмы посева. Таким образом, применение тау фибрилл приводит к нейрональной HSPG-опосредованное поглощение и стимулирует агрегацию в зависимости от дозы, что может быть количественно с FRET проточной цитометрии (5С). Кроме того, анализ может быть использован для терапевтического оценки поглощения тау и посева блокаду в пробирке с помощью НЕК 293Т тау биосенсора клетки. Даже при отсутствии фосфолипидов, как рекомбинантные фибриллы (рис 5D) и P301S мозга лизаты (рис 5E) индуцируют агрегацию тау. Предварительная инкубация этих семян тау с гепарином (ранее было показано, является сильным ингибитором HSPG-опосредованное поглощение тау), однако, исключает их посева емкость. Это экспериментальная установка может быть применена к любому препарату (например, антитела, небольшие молекулы и т.д.) и позволит быстро оценить поглощения и / или семенных модифицирующие терапии.
фигура 1 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 53205 / 53205fig1.jpg "/>
Рисунок 1. FRET проточной цитометрии чутко обнаруживает тау посева активность 16. Моноклональные НЕК 293T-клетки, экспрессирующие тау-RD-CFP / YFP трансдуцировали рекомбинантных или биологических образцов, инкубировали в течение 24-48 ч и анализировали на одном основании клеток с использованием проточной цитометрии (А). Нестимулированные клетки поддерживают тау-й в мономерной государственной (В), в то время как клетки, обработанные семян материал, содержащий отображение известных включений (С). Количественная оценка (средний ± SEM) высева деятельности показывает, что ладу проточной цитометрии чувствителен к фемтомолярных концентрации мономера (эквивалентных) рекомбинантного семенного материала и выявление охватывает три порядка (D). Мономер эквивалентно представляет собой общее количество белка, содержащееся в реакции fibrillization и не скорректировать неполное &# 160; включение мономера в агрегированном материала. Таким образом, концентрация фактических агрегаты (семян) должно быть меньше или равно его '' мономера эквивалента. * Измененный Холмса и Фурман и др. 16 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Память стратегия FRET проточной цитометрии. Клеточной популяции (а) и синглетного / дублета (B) ворот нарисованы со стандартным методом проточной цитометрии методологии. Ложное FRET ворота (С) обращается с YFP одного-позитивных клеток, чтобы устранить YFP bleedthrough в ладу фильтра. Лобзиком ворот (D) изготовлен из пустых липосом клетках, обработанных, напримерчто фон FRET является ≥1%. Сдвиг населения в ладу ворот появляется после лечения с семян положительного материала (E) и сдвиг становится все более заметным с больших количеств семенного материала (F). Окончательные показания включают в себя:. Процентов FRET положительность, средний интенсивность флуоресценции (МФО) в лобзики позитивных событий, и интегрированный плотность FRET (Интегрированная FRET Плотность = Процент положительных клеток * MFI) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Прогрессирование тау посева деятельности в P301S мышей 16. Посев деятельность (средний ± SEM) от головного мозга гомогенатах P301S мышей очевидно в 1,5 месяцев в стволе головного мозга (A), Кора головного мозга (Б), лобной доли (C), и гиппокамп (D). Однако, посев деятельность никогда не наблюдается в тау-нокаутных мышей (> 12 месяцев). Посев активность увеличивается с возрастом и предшествует появлению других общих гистологических маркеров, в том числе МС1, АТ8 и PG5 (E). * Печатается с разрешения Холмса и Фурман и др. 16 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Совместимость FRET проточной цитометрии с биологических образцах человека 16. Когда тау-РД-КФП / YFP биосенсорные клетки трансдуцировали 20 мкг человеческого мозга лизата, надежный посев (среднее ± SEM) имеет место во всех протестированных disea Альцгеймерамозги SE, в то время как соответствующего возраста и Хантингтона лизаты контроля заболеваний не имеют посева деятельности. * Измененный Холмса и Фурман и др. 16 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. Альтернативные приложения для FRET проточной цитометрии 16. Основные нейроны трансдуцированную лентивирус кодирования тау-CFP и тау-YFP строит. В отсутствие экзогенных семян нет очевидной агрегации (А), но есть в присутствии семян (B). Нейронные биосенсоры реагировать в зависимости от дозы к рекомбинантным семян тау, даже в отсутствие фосфолипидного-опосредованной доставки (С). Предварительная инкубация рекомбинанта (D) или бигические (Е) источники семян с гепарином, ингибитором HSPG-опосредованное поглощение тау семян, истощает FRET отклика биосенсора НЕК 293Т клеток. Количественные оценки дисплеи (средний ± SEM). * Измененный Холмса и Фурман и др. 16 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Таблица 1: Клеточные линии, используемые с FRET проточной цитометрии. НЕК клетки 293Т используются для проточной цитометрии установки. CFP одного-позитивные клетки используются для компенсации (*). YFP одного-позитивные клетки используются для устранения ложных сигналов FRET-за прямой активации YFP возбуждением 405 нм. КФП / YFP двойные-положительные клетки FRET-совместимым и служитьбиосенсора клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой таблице.
Таблица 2:. Поток цитометр лазерных и фильтров настроек Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой таблице.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Проточной цитометрии система FRET описано здесь является мощным инструментом для быстрого и количественно оценить тау посева деятельность. Это требует только умеренного опыт культивирования клеток и практические знания рвать и проточной цитометрии. Другие анализы посева, такие как тиофлавина T - который обладает повышенной флуоресценции при связывании с бета-листовой структуры - являются трудоемкими и требуют чистой, рекомбинантный субстрат белка. Кроме того, в пробирке анализы для посева тау только полуколичественный и вообще нечувствительны к субнаномолярных уровнях семенного материала 23,24. FRET проточной цитометрии, однако, обеспечивает количественное и чрезвычайно чувствительны меру активности посева либо из рекомбинантных или биологических образцов. Кроме того, адаптация к процедуре может сделать его полезным для изучения различных заболеваний агрегации белка.
В то время как протокол, описанный в данном документе основное внимание уделяется тау посева, только простые изменения необходимы тО позволить пользователю контролировать посева деятельность с альтернативными видами proteopathic семян. Как показано в Holmes и Furman и др., Создание моноклональных клеточной линии, стабильно экспрессирующие альфа-синуклеина, несущих мутации A53T заболевания, связанные с тегами либо CFP или YFP включен чувствительного обнаружения посева активности от полной длины альфа-синуклеина рекомбинантных фибрилл 16 , Аналогичные эксперименты были проведены с использованием биосенсора Huntingtin клетки, которые также эффективно обнаруживать агрегацию белка. Таким образом, путем простого изменения белка биосенсора, FRET проточной цитометрии совместим с многочисленными источниками семян. Другие модификации анализа, в том числе лечение парадигмы и модели клеточной могут быть использованы, чтобы сделать FRET проточной цитометрии более применимо к оценке физиологических механизмов. В этом протоколе, семена непосредственно введены в клетки с помощью биосенсора опосредованную липосомами трансдукции как способ для повышения чувствительности.
Важно пОТЕ, однако, что это не является обязательным требованием. Тау агрегатов от рекомбинантные или мыши биологические образцы все еще способны посева биосенсора клетки в отсутствие липосом (рисунок 5). Таким образом, лаборатории заинтересованы в изучении физиологического распространение и / или поглощения механизмы семян тау-прежнему может использовать для анализа. Кроме того, FRET проточной цитометрии совместим с первичными нейрональных культур. По инфицировать клетки с CFP- и YFP-кодированных лентивирусов конструкций во время посева, эффективность FRET отклика достигается при наномолярных концентрациях после обработки рекомбинантных тау фибрилл, даже в отсутствие липосом (рисунок 5). Взятые вместе, эти данные показывают, что FRET проточной цитометрии полезен для изучения физиологических механизмов посева на различных белковых агрегатов, а в нескольких моделях клеточных культур.
В то время как лада проточной цитометрии системы удобно и адаптации, некоторые ключевые шаги должны бытьвыполнять для обеспечения совместимости, в том числе подготовка образцов и правильного слияния клеток в момент обработки. Высокая интенсивность зонд ультразвуком образцов мозга имеет решающее значение для эффективного и оптимального выделения посева деятельности. При разработке и оптимизации, было отмечено, что, что этот метод в 10 раз более эффективны в изоляции посева активность от P301S мозга мыши относительно других обычных способов, например, карманного гомогенизации. Вполне возможно, что очень большие агрегаты тау имеют относительно низкую склонность посева, и что зонд ультразвуком является наиболее эффективным для разрушения этих агрегатов на более мелкие, семян, совместимый фрагментов. Продолжительность и частота ультразвука может быть изменен, если это необходимо, хотя описанные выше параметры рекомендуются для чувствительного обнаружения посева деятельности.
Сотовый конфлюентности в момент обработки также имеет первостепенное значение, так как он влияет как чувствительность и здоровье клеток. Если клеткамRe слишком сливающийся, они не легко взять фосфолипиды и семенной материал, тем самым резко уменьшая чувствительность. Если конфлюентности является слишком низкой, добавление фосфолипидов и затравочного материала может быть токсичным. Эмпирические тестирование показывает, что биосенсор конфлюентности 60-65% является оптимальным для лечения и последующего реагирования.
Как отмечено в протоколе, алгоритмы компенсации регулярно используется для исключения перелива CFP в YFP FRET и каналов, тем самым устраняя ложные сигналы и увеличения чувствительности. Для более быстрого и качественного оценки посева деятельности, однако, этот шаг может быть пропущен или выполнены с помощью постфактум проточной цитометрии программного обеспечения для анализа. Очиститель и более надежный сигнал получается следующее компенсации, однако, и, таким образом, для наиболее строгого и количественного анализа этот шаг рекомендуется.
Ограничение анализа является его неспособность сообщить о биохимический Составв proteopathic семена. В настоящее время меры анализа посева активности, функциональное свойство семян. Определение биохимических и биофизических природы семян потребует связывание с традиционными анализов, таких как иммунопреципитация, хроматографии, кругового дихроизма, масс-спектрометрии и т.д. Тем не менее, этот анализ будет полезен в оценке посева потенции в качестве конечной точки из бесчисленных образцов.
Этот анализ был недавно использован для количественного и характеризуют timecourse высева развитие и прогрессирование в P301S мышей по сравнению с другими общими маркеров осаждения тау, таких как гистологических пятен. В этом исследовании, тау посев активность была очевидной в течение шести недель до первой гистологического маркера (МС1), что мы тестировали 16. Учитывая раннее появление, посев деятельность может представлять собой важную дополнительную, или даже альтернативы, результат измерения для оценки эффективности терапевтических вмешательств, по крайней мере для предварительных исследований.Сократив курс лечения и изучения молодых животных, расходы на жилье и экспериментальные межремонтный будет уменьшаться. Вполне возможно, что терапевтические может быть введен мышам в P301S 4-6 недель и оценивали мозга для посева активности через 2-4 недели. Кроме того, оценка анти-тау терапии в клетках может быть выполнена в течение нескольких дней путем оценки их способности блокировать индуцирование активности посева в биосенсора клеток, как показано на рисунке 5.
В заключение, лада проточной цитометрии анализа посева является простым и эффективным способом обнаружения тау посев из рекомбинантных или биологических источников. Чувствительность не имеет аналогов по друга в пробирке тау высева анализов, и он может быть использован для обнаружения ранней патологическое изменение P301S tauopathy мышей. Кроме того, ее гибкость в мониторинге многочисленные proteopathic семена при различных условиях лечения, а с несколькими моделями культуры клеток, делает его полезным длялюбой агрегации белков лаборатория заинтересованы в сборе быстро количественные данные.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TBS | Sigma | T5912 | |
| cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-free) | Roche | 4693159001 | |
| Cryo-vials | Sarstedt | 72.694.006 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 105DU | |
| Weighing Boats | Fisher Scientific | 13-735-743 | |
| 15 ml conical tube | USA Scientific | 1475-0501 | |
| Omni Sonic Ruptor Ultrasonic Homogenizer | Omni International | 18-000-115 | |
| Micro-Tip for Ultrasonic Homogenizer | Omni International | OR-T-156 | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A451 | |
| Noise Cancelling Ear Muffs | Fisher Scientific | 19-145-412 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | S47299 | |
| 1.5 ml tubes | USA Scientific | 1615-5510 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 000.215 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-136 | |
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| 50 ml Conical Tubes | Phenix Research | SS-PH15 | |
| 25 ml reagent resevoirs | VWR | 41428-954 | |
| Multi channel pipet | Fisher Scientific | TI13-690-049 | |
| 96 well flat bottom plates | Corning | 3603 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| 96 well round bottom plates | Corning | 3788 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED2SS | |
| HBSS | Life Technologies | 14185-052 | |
| Sorvall ST 40 Centrifuge | Thermo Scientific | 75004509 | |
| BIOLiner Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientific | 75003796 | |
| Hemacytometer | VWR | 15170-172 | |
| MACSQuant VYB Flow Cytomter | Miltenyi Biotec | 130-096-116 | |
| Chill 96 Rack | Miltenyi Biotec | 130-094-459 | |
| Flow Jo analysis software | Flow Jo | ||
| 20 μl pipet tips | Rainin | GPS-L10 | |
| 200 μl pipet tips | Rainin | GPS-250 | |
| 1 ml pipet tips | Rainin | GPS-1000 | |
| 200 μl pipet tips | USA Scientific | 1111-1800 | |
| 5 ml serological pipett | Phenix Research | SPG-606180 | |
| 10 ml serological pipett | Phenix Research | SPG-607180 | |
| 25 ml Serological pipett | Phenix Research | SPG-760180 |
References
- Seeley, W. W., Crawford, R. K., Zhou, J., Miller, B. L., Greicius, M. D. Neurodegenerative diseases target large-scale human brain networks. Neuron. 62 (1), 42-52 (2009).
- Zhou, J., Gennatas, E. D., Efstathios, D., Kramer, J. H., Miller, B. L., Seeley, W. W. Predicting Regional Neurodegeneration from the Healthy Brain Functional Connectome. Neuron. 73 (6), 1216-1227 (2012).
- Raj, A., Kuceyeski, A., Weiner, M. A Network Diffusion Model of Disease Progression in Dementia. Neuron. 73 (6), 1204-1215 (2012).
- Braak, H., Braak, E.
- Braak, H., Braak, E. Staging of Alzheimer's disease-related neurofibrillary changes. Neurobiol Aging. 16 (3), 271-278 (1995).
- Frost, B., Diamond, M. I.
- Holmes, B. B., Diamond, M. I.
- Kaufman, S. K., Diamond, M. I. Prion-like propagation of protein aggregation and related therapeutic strategies. Neurotherapeutics. 10 (3), 371-382 (2013).
- Holmes, B. B., Diamond, M. I. Prion-like properties of Tau protein: the importance of extracellular Tau as a therapeutic target. J Biol Chem. 289 (29), 19855-19861 (2014).
- Guo, J. L., Lee, V. M. Cell-to-cell transmission of pathogenic proteins in neurodegenerative diseases. Nat Med. 20 (2), 130-138 (2014).
- Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell. J Biol Chem. 284 (19), 12845-12852 (2009).
- Guo, J. L., Lee, V. M. Y. Seeding of normal tau by pathological tau conformers drives pathogenesis of Alzheimer-like tangles. Journal of Biological Chemistry. , (2011).
- Holmes, B. B., et al. Heparan sulfate proteoglycans mediate internalization and propagation of specific proteopathic seeds. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), E3138-E3147 (2013).
- de Calignon, A., et al. Propagation of Tau Pathology in a Model of Early Alzheimer's Disease. Neuron. 73 (4), 685-697 (2012).
- Liu, L., et al. Trans-Synaptic Spread of Tau Pathology In Vivo. PLoS One. 7 (2), e31302 (2012).
- Holmes, B. B., et al. Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), E4376-E4385 Forthcoming.
- Yoshiyama, Y., et al. Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model. Neuron. 53 (3), 337-351 (2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. 65 (65), (2012).
- Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse. J Vis Exp. (33), (2009).
- Yan, Z. X., Stitz, L., Heeg, P., Pfaff, E., Roth, K. Infectivity of prion protein bound to stainless steel wires: a model for testing decontamination procedures for transmissible spongiform encephalopathies. Infect Control Hosp Epidemiol. 25 (4), 280-283 (2004).
- McDonnell, G., et al. Cleaning, disinfection and sterilization of surface prion contamination. J Hosp Infect. 85 (4), 268-273 (2013).
- Banning, C., et al. A flow cytometry-based FRET assay to identify and analyse protein-protein interactions in living cells. PLoS One. 5 (2), e9344 (2010).
- Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. Conformational Features of Tau Fibrils from Alzheimer's Disease Brain Are Faithfully Propagated by Unmodified Recombinant Protein. Biochemistry. , (2013).
- Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein. J Vis Exp. (95), e51537 (2015).
