Introduction
La acumulación intracelular de tau amiloides define tauopatías tales como enfermedad de Alzheimer. En las etapas iniciales de la enfermedad, la patología es generalmente localizada en regiones discretas del cerebro, pero con progresión de la enfermedad, la patología se extiende invariablemente a lo largo de distintas redes neuronales 1-5. La evidencia acumulada sugiere propagación transcelular de agregados de proteínas tóxicas subyace en esta patología (revisado en 6-10). En este modelo, las semillas proteopathic (por ejemplo, tau) se liberan de las células del donante y entran en las células vecinas, la transformación de la proteína tau nativa en la forma mal plegada a través cambio conformacional con plantilla 11-15. El ensayo descrito aquí fue desarrollado para detectar con sensibilidad tal actividad siembra. Es compatible con la proteína recombinante y muestras biológicas y permite la cuantificación de los niveles de minutos de actividad siembra proteopathic 16.
Células HEK 293T que expresan de forma estable tau d repeticiónOmain (RD) que contiene la mutación P301S asociado a la enfermedad ya sea fusionado a PPC o YFP (denominado en lo sucesivo como células tau-RD-CFP / YFP) servir como un biosensor estable de la actividad de la siembra. En ausencia de semillas proteopathic, las células mantener tau como un monómero soluble, y no tienen ningún fondo apreciable FRET. Absorción espontánea o transducción mediada por liposomas de las semillas de tau en las células, sin embargo, los resultados en RD-CFP y agregación RD-YFP, que produce una señal de FRET que se mide dentro de las células individuales a través de citometría de flujo.
Numerosos componentes de este ensayo fueron diseñados para mejorar la sensibilidad y reducir la variabilidad. Fue seleccionado expresión ratio 1 RD-PPC / YFP, ya que proporciona óptima de la señal: Una línea celular monoclonal con un 1 ruido. Para aumentar la sensibilidad, los fosfolípidos se utilizan para introducir semillas directamente en las células (aunque para estudiar los mecanismos biológicos de la absorción, esto puede ser omitido). Por último, citometría de flujo monitores FRET a nivel de población y de una sola célula nivel, a diferencia de otros ensayos de agregación de proteínas. La medida de resultado final, la densidad de FRET integrado, es altamente cuantitativo y representa tanto por el número de células con la agregación, y el grado en que se ha producido la agregación dentro de cada célula. Todos estos parámetros optimizados aumentar la sensibilidad y asegurar la reproducibilidad.
Este sistema fue empleado recientemente en un estudio integral en ratones transgénicos tauopatía P301S 17 que evaluó la aparición temporal y la progresión de la actividad de siembra de tau en relación con otros marcadores patológicos tau uso común (por ejemplo, MC1, AT8, PG5 y tioflavinas). Actividad siembra es, con mucho, el marcador más temprana y más robusta de la patología tau evaluado, precediendo a la detección histológica por al menos 6 semanas. Siembra actividad aparece en 1,5 meses y aumenta progresivamente con la edad, lo que sugiere un papel causal de las semillas proteopathic en la aparición y / o progresión de la neurodegeneración 16.
e_content "> cuantificación precisa de los niveles de diminutas de material de semilla a partir de muestras biológicas puede facilitar los estudios que monitorean progresión de la enfermedad temprana. Al acortar la duración del ensayo y permitiendo el uso de los animales más jóvenes, esto podría aumentar la eficiencia y la exactitud de los ensayos preclínicos con animales. Por ejemplo, en el ratón P301S se ha descrito anteriormente, los compuestos de plomo se podrían entregar tan pronto como 4-6 semanas (inmediatamente antes de, o al inicio de la actividad de la siembra), y controlado para la eficacia de 2-4 semanas más tarde. El ensayo debe cuantificar con precisión cualquier reducción de la siembra actividad. FRET citometría de flujo ha in vitro aplicaciones de cribado también. Por ejemplo, los reactivos anti-tau (por ejemplo, anticuerpos, moléculas pequeñas, etc.) se puede probar rápidamente por su capacidad para bloquear la inducción de la siembra directamente en cultivo, utilizando ya sea tau recombinante agregados o lisados derivados del cerebro como una fuente de semilla (Figura 5). Con esta configuración, una vez que se prepara material de siembra, un experimento toma sólo tres días para completar, incluyendo el análisis de datos. La rápida cuantificación de la actividad de siembra proteopathic tanto, puede facilitar muchos estudios de la neurodegeneración.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Este protocolo hace hincapié en el uso de FRET citometría de flujo para detectar la actividad de siembra de muestras biológicas de ratón. También es compatible con fibrillas recombinantes y muestras biológicas humanas. Ratón de la eutanasia y el cerebro recolección se realizó de acuerdo con los procedimientos aprobados por la IACUC.
1. Cerebro Extracción
- Siguiendo profunda anestesia con isoflurano (2%), perfundir un ratón con PBS enfriado con hielo que contenía 0,03% de heparina, y extraer el cerebro siguiendo las instrucciones descritas en Gage et al. 18
- Coloque el tejido extraído en un crio-vial, y encaje congelación colocando en nitrógeno líquido. Alternativamente, congelar el tejido en hielo seco. Una vez congelado, transferencia de tejido a -80 ° C y almacenar durante un período prolongado de tiempo, si es necesario.
NOTA: Este protocolo es compatible con homogeneizados de cerebro enteros o regiones microdiseccionadas cerebrales. Ver Hagihara et al. Para un detallado protocolo de micro-disección 19. 2. Preparación de Material Biológico de Semillas - Preparar tampón de homogeneización mediante la disolución de inhibidores de la proteasa (EDTA libre) en TBS 1x (1 tableta por cada 10 ml). Vortex vigorosamente, y almacenar en hielo. Inhibidores de la proteasa debe ser libre de EDTA a fin de preservar la viabilidad celular biosensor.
- Pesar tejido cerebral congelado en un desechable sopesar barco, y transferir a un tubo cónico de 5 ml. Añadir tampón de homogeneización enfriado con hielo tal que la solución final es 10% peso / volumen. Temporalmente almacenar en hielo. La masa de tejido y el volumen de tampón de homogeneización posterior variarán dependiendo del tamaño y / o regiones del cerebro utilizado. Aquí, un hemibrain ratón adulto que pesa 0,2 g se suspende en 2 ml de una solución al 10% w / vol.
- Muestras de transferencia en una habitación fría, y ajustar un aparato de ultrasonidos sonda para la configuración adecuada. Para sonicación con sonda con un Ruptor Omni (en la imagen), ajuste la potencia al 20%, lo que corresponde a aproximadamente 75 W. Utilice un modo de pulso para asegurar muestras no se OVer-calentado durante el tratamiento con ultrasonidos. Ajuste el generador de impulsos al 30%, correspondiente a aproximadamente 500 mseg.
- Limpiar la punta de la sonda de ultrasonidos por aclarado con agua, isopropanol, y agua de nuevo, limpiar la sonda entre cada solución. Asegúrese de enjuagar y limpiar tanto los lados y el fondo de la sonda con laboratorio-toallitas.
- Trabajar con una muestra a la vez, sumergir la punta de la sonda en el tampón de homogeneización, e iniciar el aparato de ultrasonidos. El uso de la configuración de energía y generador de impulsos descritos anteriormente, entregar 25 pulsos totales. Asegúrese de que el tejido está completamente en suspensión. Tenga cuidado para evitar la formación de espuma de la muestra durante este paso.
NOTA: Las muestras son susceptibles a la formación de espuma si: a) el volumen total es baja o b) el homogeneizado se calienta. Con este instrumento específico, no sonicar con un volumen de menos de 250 l. Para asegurarse de muestras se mantienen refrigeradas, tubos pueden ser almacenados en hielo durante este paso. - Limpie la sonda por enjugándose lisado residual, luego entregar 10 pulsos en un vaso de precipitados oagua limpia f. Enjuague los lados y el fondo de la sonda con agua, isopropanol, y agua de nuevo (como en el paso 2.4), la limpieza en seco entre cada paso. Para evitar la contaminación, enjuague bien la sonda de entre las muestras.
NOTA: Con los agregados de tau, no hemos encontrado que los métodos de limpieza más estrictas son necesarias para evitar la contaminación de muestra a muestra. Otros amiloides, sin embargo, pueden requerir atención adicional que ha sido descrito ampliamente en la literatura 20,21. - Tienda homogeneizados en hielo hasta que se han procesado todas las muestras.
- Haga girar homogeneizados a 21.300 xg durante 15 min a 4 ° C.
- Transferir el sobrenadante a un tubo limpio, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento. Deseche la pastilla. Alícuota el sobrenadante, y almacenar los lisados a -80 ° C para su uso posterior. Evite los ciclos de congelación / descongelación de los homogeneizados, sin embargo, ya que esto reduce la eficiencia de la siembra.
- En un entorno estéril, medio de cultivo de aspirado. Enjuague las células con PBS caliente, y aspirar. Trypsinize células (3 ml de tripsina-EDTA (0,05%)) para 3 min, saciar con medio de cultivo caliente (9 ml de DMEM, FBS al 10%, 1% penicilina / estreptomicina, 1% Glutamax), y transferir inmediatamente las células a un tubo cónico.
- Células Centrifugar a 1000 xg durante 5 min a TA. Medio Aspirar y sedimento celular se resuspende en medio de cultivo caliente.
- Utilizando un hemocitómetro, determinar la densidad celular para cada línea celular. La densidad celular variará dependiendo de confluencia en el momento de la cosecha y el volumen de resuspensión. Resuspender las células cosechadas a partir de un plato de 10 cm a 90% de confluencia en 10 ml de medio, por la densidad de células a ser aproximadamente 1 millón de células / ml.
- Haceruna mezcla maestra de las células + medios de comunicación de tal manera que cada pocillo de una placa de 96 pocillos contendrá 35.000 células en 130 l de medios (por ejemplo, para hacer una mezcla maestra para 100 pozos, resuspender 3,5 millones de células en 13 ml de medio). Modificar el número de células para adaptarse a diseños y plazos experimentales individuales. Para el tratamiento de células ~ 18 hr después de la siembra, añadir 35.000 células a cada pocillo de una placa de 96 pocillos.
- Usando una pipeta multicanal, una pipeta lentamente 130 l de suspensión celular mezcla maestra en cada pocillo de un fondo plano, el tejido de cultivo tratado-placa de 96 pocillos. Mientras chapado, coloque la punta de la pipeta en el centro del pozo, sin tocar el fondo de la placa.
NOTA: Aunque formato de chapado puede ser modificado, se recomienda hacer n = 4 pocillos para cada una de las líneas celulares 1-3 por placa. El resto de la placa (n = 84) está reservado para la línea celular # 4 (células de biosensores). - Permitir que las células se asienten dejando la placa en reposo durante 10 min a TA. Incubar O / N a 37 ° C, 5% de CO 2, y y# 8805; humedad relativa 80%.
- En un tubo, se combinan reactivo de transfección, como Lipofectamina, con los medios de comunicación reducido suero, tales como Opti-MEM, para hacer una mezcla maestra. Por así, añadir 1,25 reactivo de transfección ly 8,75 l de medios de comunicación reducida de suero. Flick tubo suavemente para mezclar, brevemente girar hacia abajo, y se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- En otro tubo, combinar material de siembra (alícuota de lisado de la etapa 2.9) con los medios de comunicación reducida de suero.
NOTA: Volumen del material de semilla variará de acuerdo con el experimento individual. Al elegir el volumen de semillas, tener en cuenta: la abundancia de semillas en una muestra y la toxicidad potencial. Homogeneizados brutos pueden ser tóxicos para las células. Como tal, utilice el volumen más bajo posible para controlar su efecto deseado. Anteriormente volúmenes probados de lisado / pocillo fr gamaom 05.01 l, correspondiente a la proteína total 5.20 mg. Asegúrese de que el volumen total por pocillo (semillas + medios reducido suero) es de 10 l. - Combine el contenido de los dos tubos que se describen en 4.1 y 4.2, flick suavemente para mezclar, brevemente girar hacia abajo (1.000 xg, 5 seg), e incubar a temperatura ambiente durante al menos 20 min y hasta 2 hr.
- Pipetear suavemente 20 l de complejo de transducción en el lado de los pozos de biosensores individuales. Utilice tres repeticiones técnica, si es posible. Volver células tratadas a la incubadora durante 24-48 h. Incubar en las mismas condiciones como se describe en el paso 3.6.
NOTA: La condición de control negativo apropiado para esta configuración es biosensores células tratadas con liposomas vacíos (es decir, el reactivo de liposomas + medios de comunicación reducida de suero) porque la aplicación de fosfolípidos introduce un ligero cambio en el perfil de fluorescencia relativa a las células no expuestas al biosensor reactivo de liposomas. - Usando una pipeta multicanal, aspirar todo medio celular (150 l). Células de 5 min trypsinize (50 l), y se inactiva con 150 l de medio de cultivo frío. No incluya un enjuague de PBS antes de la tripsinización en este paso, ya que puede causar elevación celular y pérdida celular subsiguiente. Excluir los contaminantes células muertas y los desechos durante la citometría de flujo a través de las estrategias de compuerta.
- Inmediatamente después del temple, las células de transferencia a una placa de fondo redondo de 96 pocillos, y se centrifuga a 1000 xg durante 5 min a RT.
- Aspirar y desechar medio, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento celular.
- Suavemente, pero a fondo, resuspender el botón celular en 50 l 2% de paraformaldehído, y se incuba durante 10 min. Alternativamente, las células dirigidas viven, aunque la fijación proporciona resultados más limpios y más consistentes.
- Células Centrifugar a 1000 xg durante 5 min a TA. Aspirar y desechar paraformaldehído, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento celular.
- Suavemente, pero a fondo, resuspender el botón celular en 200 l de tampón de citometría de flujo frío (HBSS, 1% de FBS, EDTA 1 mM) y ejecutar la placa tan pronto como sea posible para evitar la aglutinación de células.
- Hacer una dispersión-Side Area (SSC-A) vs Forward Scatter-Área (FSC-A) trama bivariada, y con la línea celular # 1 en funcionamiento, ajustar los voltajes SSC y FSC hasta que la población de células es en el cuadrante inferior izquierdo. Haga clic en la herramienta polígono, y definir la población de células (Puerta P1). Para todos los parámetros de compuerta véase la Figura 2.
- Haga una FSC-H (altura) vs FSC Un bivariado trama, y aplicar Puerta P1 a esta parcela haciendo clic en "vivo" por encima de la trama, y la selección de P1. Con la línea celular # 1corriendo, haga clic en la herramienta polígono, y definir las células individuales (Puerta P2).
- Haga 3 parcelas de histograma, una para cada uno de los filtros de interés: PPC, YFP y FRET. Aplicar Puerta P2 a todas estas parcelas haciendo clic en "vivo" por encima de las parcelas, y la selección de P2. Con la línea celular # 1 en funcionamiento, ajustar los voltajes de tal manera que la población de células mediana en la PPC, YFP, y FRET histogramas son todos entre 0 y 1. Para medir PPC y FRET, excitar las células con el láser de 405 nm, y la captura de fluorescencia con una 450/50 nm y 525/50 nm filtro, respectivamente. Para medir YFP, excitar las células con un 488 nm láser y captura de fluorescencia con un 525/50 nm filtro. Ajustes del láser y el filtro se describen adicionalmente en la Tabla 2.
- Realice una indemnización por PPC desbordamiento en los canales de FRET y YFP.
NOTA: La compensación es el proceso de corrección de derrame de fluorescencia. Desbordamiento de fluorescencia se produce cada vez que se detecta la emisión de fluorescencia de un solo fluorocromo dentro de un filtro desiseñados para medir señal de otro fluorocromo. Con una indemnización adecuada, el desbordamiento de fluorescencia PPC puede ser retirado de los canales de FRET y YFP.
NOTA: La compensación requiere la presencia de ambas células positivas y negativos de fluorescencia. Por lo tanto, para compensar en las células de la PPC-positivos (célula de la línea # 2), las células negativas (célula de la línea # 1) debe ser añadido a la muestra antes de la carrera.- Spike en 30 l de línea celular # 1 suspensión de un solo pozo en 200 l de línea celular # 2 suspensión inmediatamente antes de la compensación.
- Haga clic en el icono de "Configuración del instrumento", a continuación, la pestaña 'compensación', y comprobar "matriz" para abrir la tabla de compensación.
- Haga una FRET-A vs PPC-Una parcela bivariado, y aplicar P2 puerta, como se describe en el paso 6.3. Con líneas celulares 1 + 2 en ejecución, haga clic en el icono de "cuadrante" y dibujar cuadrantes de manera que las poblaciones de fluorescencia-negativos y -positivas están separadas por los dos cuadrantes inferiores (Puertas LL3 unnd LR3, respectivamente).
- Crear una tabla de estadísticas que muestra la intensidad media de fluorescencia (MFI) de FRET para el LL3 y puertas LR3. Ajustar el parámetro de FRET en la matriz de compensación hasta que el MFI de la señal de FRET es equivalente entre LL3 y LR3. Después de este paso, la IMF de la señal de FRET es igual entre las células no teñidas y células CFP-positivos, lo que sugiere la ausencia de desbordamiento de la PPC en el canal de FRET.
- Hacer un YFP-A vs PPC-Una parcela bivariado, y aplicar P2 puerta, como se describe en el paso 6.3. Dibuja cuadrantes (LL4 y LR4) similar a la realizada en el paso 6.4.3.
- Crear una tabla de estadísticas que muestra el MFI de YFP para LL4 y LR4. Ajuste el parámetro de YFP en la matriz de compensación hasta que el MFI de la señal de YFP es equivalente entre LL4 y LR4. Después de este paso, la IMF de una señal de YFP es igual entre las células no teñidas y células CFP-positivos, lo que sugiere la ausencia de desbordamiento de la PPC en el canal de YFP.
- Folldebido configuración puerta y compensación, resalte pozos de interés y ejecutar el resto de la placa.
- Después de todas las muestras se han ejecutado, archivos de datos de exportación haciendo clic en 'archivo', luego 'copia'. Seleccione la pestaña "archivos de datos ', seleccione la carpeta experimento, y haga clic en« copia ».
- Archivos FCS abiertas en la citometría de flujo programa de análisis.
- Basado en las propiedades de dispersión, utilice una puerta poligonal para definir la población de células (SSC vs FSC) y la población singlete (FSC-H vs FSC-A) de las células tratadas con liposomas vacíos, de manera similar a la descrita en la Sección 6.
- Si se realizó una compensación PPC durante la instalación, no ajuste más PPC.
- Crear un FRET vs YFP bivariado trama. Utilizando la línea celular # 3, Definir una puerta falsa FRET mediante la elaboración de una puerta poligonal que se ejecuta a lo largo de la pendiente de la población de células FRET-positivo. Esta puerta excluye las células de un solo positivo YFP que emiten una señal de FRET dentro del filtro, y se extrae similar a la mostrada anteriormente mediante la prohibición et al. 22
- Definir una puerta FRET trazando celdas vacías de liposomas tratados PPC / YFP en un FRET vs PPC bivariado trama. Introducir una puerta poligonal a lo largo de la pendiente de la población que se extiende hacia arriba y hacia la izquierda lejos de la población. Esta puerta debe excluir la mayoría de las células (~ 99%), de tal manera que el fondo FRET es ≥1% de las células. Cualquier evento que cambian en esta puerta se consideran FRET-positivo.
Nota: Cada una de las puertas se ha descrito anteriormente se aplica a todas las muestras antes de construir puertas posteriores. Tras el análisis, cuatro puertas individuales se definen (población celular; singlete; falsa FRET; FRET). - Parámetros de análisis de registro de interés, entre ellos: ciento positividad FRET y MFIde las células FRET-positivo. Calcular manualmente la densidad de FRET integrado midiendo el producto del porcentaje de positividad y la IMF.
NOTA: Si la densidad de FRET integrado se utiliza como una medida de resultado, establezca FRET de fondo (tal como se define en el paso 7.5) y MFI a mayor que o igual a 1 con el fin de evitar el cálculo de un producto que es menos de sus dos factores individuales.
3. Las células replating Biosensor
NOTA:Utilice cuatro líneas celulares para este ensayo: HEK 293T (célula de la línea # 1), RD-P301S-PPC (célula de la línea # 2), RD-P301S-YFP (célula de la línea # 3), y RD-P301S-PPC / YFP ( línea celular # 4). Por favor, consulte la Tabla 1 para la contribución de cada línea celular para el ensayo.
4. Las células Tratamiento
NOTA: El siguiente día, cuando las células de biosensores tau son 60-65% confluentes, preparar complejos de transducción de semillas de la siguiente manera:
5. Las células Cosecha de FRET Citometría de Flujo
6. FRET Citometría de Flujo
NOTA: Utilice un citómetro de flujo tal como el MACSQuant VYB, que está equipado con FRET-compatible líneas de láser y conjuntos de filtros (Tabla 2). Para cada paso dentro de esta sección, haga clic en el bien de interés utilizando la plantilla 96 y del software, y haga clic en"Jugar" para iniciar la captación de la muestra y el flujo. Hacer parcelas o tablas estadísticas haciendo clic en el icono "nueva ventana de análisis '. Cambiar parámetros de eje en parcelas de dos variables individuales haciendo clic en el título ya sea en el eje X o Y y seleccionar el filtro adecuado. Para desplazar poblaciones celulares o señales de fluorescencia, aumentar o disminuir las tensiones asociadas con los filtros adecuados. Con este instrumento, ejecute <1.000 eventos / seg para garantizar el seguimiento de una sola célula exacta.
Análisis 7. Datos
NOTA: parámetros de eje Cambio en parcelas de dos variables individuales haciendo clic en el título ya sea en el eje X o Y y seleccionar el filtro adecuado.
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Representative Results
FRET citometría de flujo permite sensible, cuantitativa, y la detección rápida de la actividad de la siembra a partir de muestras biológicas o recombinantes. Ensayo de configuración es fácil: líneas celulares estables que expresan monoclonales derivados de tau-RD-CFP / YFP son transducidas con material de siembra, se incubaron durante 24-48 horas, y se sometieron a análisis de citometría de flujo (Figura 1A). En ausencia de semillas, las células mantienen biosensores tau en una forma monomérica soluble (Figura 1B). En la presencia de semillas, sin embargo, las células de biosensores convierten tau en un estado agregado (figura 1C), produciendo una respuesta de FRET que se detecta en una base por-celular con citometría de flujo. La evaluación cuantitativa muestra que las células de biosensores responden a concentraciones femtomolares de material de siembra y que la actividad de siembra pueden medirse eficazmente a través de tres órdenes de magnitud (Figura 1D).
Se establecieron parámetros de compuerta para asegurar la detección de un true FRET señal, incluso a bajas concentraciones de semillas. En primer lugar, los métodos de compuerta estándar se utilizan para aislar la población de células (Figura 2A) y células individuales (Figura 2B). Falso señal de FRET puede surgir de la activación directa de YFP por el láser 405 nm. Por lo tanto, una puerta de FRET False se extrae de una población de células de un solo positivo YFP para excluir la contaminación de la señal (Figura 2C). Por último, la puerta de FRET se define a partir de células de doble positivo PPC / YFP no cabezas de serie (Figura 2D). Una puerta se dibuja cerca de la pendiente de la población que se extiende hacia arriba y hacia la izquierda lejos de ella. Las células no deben tener un fondo FRET valor establecido en aproximadamente el 1%, y las células FRET-positivas cambiarán en esta puerta en una forma dependiente de la dosis (comparar Figura 2E y 2F). Múltiples parámetros se tienen en cuenta con FRET citometría de flujo, incluyendo: porcentaje de positividad (es decir, el número de células positivas por FRET-recuento total de células) Y la intensidad de fluorescencia media (es decir, el grado en que se produce una respuesta de FRET en una celda de FRET-positivo). Densidad Integrated FRET es la medida de resultado preferida, ya que es el producto de estas dos variables y totalmente representa el grado de actividad de siembra inducida por cualquier muestra dada.
FRET citometría de flujo es compatible con P301S lisados cerebrales derivadas de ratón tauopatía, incluso a edades más jóvenes, como se muestra en la Figura 3. Después de microdisección de cuatro regiones cerebrales diferentes, traste de flujo fue utilizado citometría para medir la actividad de siembra de tronco cerebral (Figura 3A), neocórtex (Figura 3B), lóbulo frontal (Figura 3C), y el hipocampo (Figura 3D) en ratones P301S en un rango de edades. En cada región, la actividad de siembra aumentó con la edad y apareció en sólo 1,5 meses. Sin embargo, los ratones knockout tau ("KO")> 12 meses no muestran actividad de siembra. En comparación con hLos análisis de istological lleva a cabo dentro de los mismos animales, esto es seis semanas antes de lo que la aparición de cualquier otro marcador de tau deposición (Figura 3E), incluyendo marcadores de tau conformacionalmente-aberrante (MC1), tau hiperfosforilada (AT8 y PG5), y amiloide conformación (tioflavinas). Desde un punto de vista mecanicista, la detección proximal de la actividad de siembra tau sugiere semillas como un mediador causal de la aparición y / o progresión tauopatía. Desde un punto de vista experimental, esto sugiere que el análisis de la actividad de siembra puede ser un complemento ideal para las medidas de resultado estándar de deposición tau, dada su aparición temprana y robusto.
Además de ratones transgénicos, traste citometría de flujo es compatible con lisados de cerebro humano y puede detectar fácilmente agregados de tau aislados de pacientes con enfermedad de Alzheimer (Figura 4). Cuando el tejido cerebral humano congelado se homogeneizó de la misma manera como se describe aquí para obtener lisados cerebrales P301S, la actividad de la siembraestá robustamente detectada a partir de todas las muestras derivadas de sujetos con AD. En contraste, la actividad de la siembra no se detecta a partir de lisados de sujetos de control de enfermedades de la misma edad o de Huntington. Esto pone de relieve la especificidad del ensayo para los agregados de tau.
Aunque el foco de este artículo es la detección sensible de la actividad de siembra tau utilizando administración mediada por liposomas de agregados en células HEK 293T biosensores, los paradigmas de cultivo de células más fisiológica también se pueden realizar con FRET citometría de flujo para evaluar los mecanismos básicos de captación celular. Por ejemplo, cultivos neuronales primarias pueden ser infectados con lentivirus que expresa la tau-RD-PPC y tau-RD-YFP construye en el momento de la siembra. En DIV4, la agregación está ausente en las células no tratadas (Figura 5A) pero detectable en las neuronas tratadas con material que contiene la semilla (Figura 5B). Es importante destacar que los fosfolípidos están excluidos en estos experimentos, lo que permite la investigación de fisiológica y pat mecanismos de siembra hophysiological. Por lo tanto, la aplicación de las fibrillas de tau conduce a la captación neuronal mediada por HSPG y estimula la agregación de una manera dependiente de la dosis que se puede cuantificar con citometría de flujo de FRET (Figura 5C). Además, el ensayo se puede emplear para la evaluación terapéutica de la captación de tau y la siembra de bloqueo in vitro utilizando células HEK 293T biosensores tau. Incluso en ausencia de fosfolípidos, ambos fibrillas recombinantes (Figura 5d) y P301S lisados cerebrales (Figura 5E) inducen la agregación de tau. Pre-incubación de estas semillas tau con heparina (previamente demostrado ser un potente inhibidor de la absorción de tau mediada por HSPG), sin embargo, elimina su capacidad de siembra. Esta configuración experimental podría aplicarse a cualquier fármaco (por ejemplo, anticuerpos, moléculas pequeñas, etc.) y permitiría una rápida evaluación de la captación y / o terapéutica de semillas modificadores.
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Figura 1. FRET citometría de flujo sensible detecta tau actividad siembra 16. 293T células monoclonales HEK que expresan tau-RD-PPC / YFP fueron transducidas con muestras recombinantes o biológicos, se incubaron durante 24 a 48 horas, y se analizaron en una sola base de células mediante citometría de flujo (A). Células no estimuladas mantienen tau-RD en un estado monomérico (B), mientras que las células tratadas con visualización de material inclusiones prominentes que contiene semillas (C). Evaluación cuantitativa (media ± SEM) de la actividad de siembra espectáculos que FRET citometría de flujo es sensible a concentraciones femtomolares (monómero equivalentes) de material de siembra recombinante y la detección se extiende por tres órdenes de magnitud (D). Equivalente monómero representa la cantidad total de proteína contenida en la reacción fibrillization y no corrige la incompleta y# 160; incorporación de monómero en el material agregado. Por lo tanto, la concentración de agregados reales (semillas) debe ser menor que o igual a su 'equivalente monómero'. * Modificado de Holmes y Furman et al. 16 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. La estrategia de apertura de puerta para FRET citometría de flujo. Población celular (A) y singlete / doblete (B) puertas se dibujan con citometría de flujo estándar metodología. Una puerta de FRET falsa (C) se extrae de las células de un solo positivos YFP para eliminar YFP bleedthrough en el filtro de FRET. Una puerta de FRET (D) se construye a partir de células tratados con liposomas vacíos, talesque FRET de fondo es ≥1%. Un cambio de la población en la puerta FRET aparece después del tratamiento con material de siembra de positivo (E) y el cambio se vuelve cada vez más prominente con cantidades más altas de material de siembra (F). Lecturas finales incluyen:. Ciento FRET positividad, la intensidad de fluorescencia media (IMF) de los acontecimientos FRET-positivos, y la densidad de FRET integrado (células positivas Integrado FRET Densidad = Porcentaje * IMF) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. La progresión de la actividad de siembra tau en ratones P301S 16. La actividad de siembra (media ± SEM) de homogeneizados de cerebro de ratones P301S es evidente en 1.5 meses en el tronco cerebral (A), Neocórtex (B), lóbulo frontal (C), y el hipocampo (D). Sin embargo, la actividad de la siembra no se observa en los ratones knockout tau (> 12 meses). Siembra actividad aumenta con la edad y precede a la aparición de otros marcadores histológicos comunes, incluyendo MC1, AT8, y PG5 (E). * Reproducido con permiso del Holmes y Furman et al. 16 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Compatibilidad de FRET citometría de flujo con muestras biológicas humanas 16. Cuando las células biosensores tau-RD-PPC / YFP son transducidas con 20 g lisado cerebro humano, robusto siembra (media ± SEM) se produce en todo probado diseà de Alzheimercerebros se, mientras que los lisados de control de enfermedades en edad emparejado y Huntington carecen de actividad de siembra. * Modificado de Holmes y Furman et al. 16 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. aplicaciones alternativas para FRET citometría de flujo 16. Neuronas primarias transducidas con lentivirus codificación tau-tau y PPC-YFP construye. En ausencia de semillas exógenos no hay agregación aparente (A), pero no en presencia de semillas (B). Biosensores neuronales responden a las semillas de tau recombinantes de forma dependiente de la dosis, incluso en ausencia de la entrega de fosfolípidos mediada por (C). Pre-incubación de recombinante (D) o bifuentes de semillas meto- (E) con la heparina, un inhibidor de la mediada por HSPG captación de semilla de tau, agota FRET capacidad de respuesta de las células HEK 293T biosensores. Pantallas de evaluación cuantitativos (media ± SEM). * Modificado de Holmes y Furman et al. 16 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Mesa 1: Las líneas celulares utilizadas con FRET citometría de flujo. Células HEK 293T se usan para citometría de flujo de configuración. Células de un solo positivos de la PPC se utilizan para la compensación (*). Las células de un solo positivos YFP se utilizan para eliminar la señal de FRET falsa debido a la activación directa de YFP por 405 nm de excitación. Células de doble positivas PPC / YFP son compatibles con FRET y sirven comolas células de biosensores. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.
Tabla 2:. Citómetro de flujo ajustes del láser y del filtro Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.
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La citometría de flujo del sistema FRET descrito aquí es una poderosa herramienta para evaluar de forma rápida y cuantitativamente la actividad de siembra tau. Sólo se requiere la experiencia de cultivo de células moderado y un conocimiento práctico de FRET y citometría de flujo. Otros ensayos de siembra, como tioflavina T - que exhibe fluorescencia aumentada cuando se une a la estructura de lámina beta - son laboriosos y requieren un sustrato de proteína pura, recombinante. Además, los ensayos in vitro de siembra en para tau sólo son semi-cuantitativa y generalmente insensible a niveles subnanomolares de material de siembra 23,24. Fret citometría de flujo, sin embargo, proporciona una medida cuantitativa y exquisitamente sensible de la actividad de siembra de las muestras, ya sea recombinante o biológicos. Además, adaptaciones al procedimiento puede hacer que sea útil para estudiar una variedad de trastornos de agregación de proteínas.
Mientras que el protocolo descrito en el presente documento se centra en la siembra tau, sólo se requieren modificaciones simples to permitir a un usuario para monitorizar la actividad de siembra de tipos alternativos de semillas proteopathic. Como se demuestra en Holmes y Furman et al., La creación de una línea celular monoclonal que expresa de forma estable α-sinucleína portadoras de la mutación A53T enfermedad asociada etiquetado ya sea PPC o YFP activar la detección sensible de la actividad de siembra de larga duración fibrillas recombinante alfa-sinucleína 16 . Experimentos similares se han realizado utilizando células biosensores Huntingtin, que también detectan efectivamente la agregación de proteínas. Así, con sólo modificar el biosensor de proteínas, traste citometría de flujo es compatible con numerosas fuentes de semillas. Otras modificaciones en el ensayo, incluyendo paradigma de tratamiento y el modelo celular, pueden ser utilizados para hacer FRET citometría de flujo más aplicable a la evaluación de los mecanismos fisiológicos. En este protocolo, las semillas se introducen directamente en las células de biosensores a través de la transducción mediada por liposomas como una manera de aumentar la sensibilidad.
Es importante nota, sin embargo, que esto no es un requisito. Tau agregados a partir de muestras biológicas o de ratón recombinantes son todavía capaces de siembra de células de biosensores en ausencia de liposomas (Figura 5). Por lo tanto, los laboratorios interesados en estudiar la propagación fisiológica y / o mecanismos de captación de semillas tau todavía puede emplear el ensayo. Además, FRET citometría de flujo es compatible con cultivos primarios de neuronas. Al infectar células con PPC-y construcciones lentivirales codificados-YFP en el momento de la siembra, la capacidad de respuesta de FRET eficiente se alcanza a concentraciones nanomolares después del tratamiento con fibrillas de tau recombinantes, incluso en ausencia de liposomas (Figura 5). Tomados en conjunto, estos datos indican que la citometría de flujo de FRET es útil para estudiar los mecanismos fisiológicos de siembra para una variedad de agregados de proteínas y en múltiples modelos de cultivo celular.
Mientras que la FRET citometría de flujo del sistema es fácil de usar y adaptable, ciertos pasos clave deben serseguido para asegurar la compatibilidad, incluyendo la preparación de la muestra y de confluencia celular apropiado al momento del tratamiento. Alta intensidad sonda de sonicación de especímenes de cerebro es crítico para el aislamiento eficaz y óptima de la actividad de la siembra. Durante el desarrollo y la optimización, se observó que que este método es más de 10 veces más eficaz en el aislamiento de la actividad de la siembra a partir de cerebros de ratón P301S en relación con otras técnicas comunes, por ejemplo, homogeneización de mano. Es posible que muy grandes agregados de tau tienen una propensión relativamente baja de la siembra, y que sonicación con sonda es más eficaz para romper estos agregados en fragmentos más pequeños, compatible con semillas. Duración y frecuencia de la sonicación se pueden modificar si es necesario, a pesar de los ajustes descritos anteriormente se recomiendan para la detección sensible de la actividad de la siembra.
Confluencia de la célula en el momento del tratamiento es también de suma importancia, ya que afecta a la sensibilidad y la salud de las células. Si las células unare demasiado confluentes, que no aceptan fácilmente a fosfolípidos y material de siembra, lo que disminuye drásticamente la sensibilidad. Si confluencia es demasiado baja, la adición de fosfolípidos y material de siembra puede ser tóxico. Las pruebas empíricas muestran que un biosensor de confluencia de 60-65% es óptimo para el tratamiento y la posterior capacidad de respuesta.
Como se señala en el protocolo, algoritmos de compensación se utilizan regularmente para excluir PPC desbordamiento en el YFP FRET y canales, eliminando así las señales falsas y aumentar la sensibilidad. Para una evaluación más rápida y cualitativa de la actividad de la siembra, sin embargo, este paso se puede omitir o realizar post hoc usando citometría de flujo de software de análisis. Se obtiene una señal más limpia y más robusto compensación siguiente, sin embargo, y por lo tanto para el análisis más riguroso y cuantitativa es muy recomendable este paso.
Una limitación del ensayo es su incapacidad para informar sobre la bioquímica composición delas semillas proteopathic. La actividad de siembra actual ensayo mide, una propiedad funcional de semillas. Determinación de la naturaleza bioquímicas y biofísicas de las semillas requerirá acoplamiento a ensayos tradicionales, tales como inmunoprecipitación, cromatografía, dicroísmo circular, espectrometría de masas, etc. Sin embargo, este ensayo será útil en la evaluación de la potencia de la siembra como criterio de valoración a partir de muestras innumerables.
Este ensayo fue utilizado recientemente para cuantificar y caracterizar la timecourse de siembra desarrollo y la progresión en ratones P301S en relación con otros marcadores comunes de deposición tau, tales como tinciones histológicas. En este estudio, la actividad de siembra tau era aparente de más de seis semanas antes de la marcador histológico más temprana (MC1) que hemos probado 16. Dada su aparición temprana, la actividad de la siembra puede representar un importante suplementario, o incluso alternativa, medida de resultado para evaluar la eficacia de las intervenciones terapéuticas, por lo menos para los estudios preliminares.Al acortar curso de tratamiento y el estudio de pequeños animales, los gastos de vivienda y el tiempo de respuesta experimental disminuirá. Es concebible que la terapéutica podrían ser administrados a ratones P301S a las 4-6 semanas y cerebros evaluados para la actividad de siembra de 2-4 semanas más tarde. Alternativamente, la evaluación de la terapéutica anti-tau en las células se puede realizar dentro de días mediante la evaluación de su capacidad para bloquear la inducción de la actividad de la siembra en las células de biosensores, como se demuestra en la Figura 5.
En conclusión, la FRET citometría de flujo siembra ensayo es una manera fácil y eficaz para detectar la siembra tau de fuentes recombinantes o biológicos. Su sensibilidad es inigualable por otros en ensayos de siembra tau vitro, y puede ser empleado para detectar el cambio patológico más temprana en ratones tauopatía P301S. Además, su flexibilidad en el seguimiento de numerosas semillas proteopathic bajo diferentes condiciones de tratamiento, y con múltiples modelos de cultivo celular, lo hace útil paracualquier laboratorio de la agregación de proteínas interesado en reunir rápidamente los datos cuantitativos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TBS | Sigma | T5912 | |
| cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-free) | Roche | 4693159001 | |
| Cryo-vials | Sarstedt | 72.694.006 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 105DU | |
| Weighing Boats | Fisher Scientific | 13-735-743 | |
| 15 ml conical tube | USA Scientific | 1475-0501 | |
| Omni Sonic Ruptor Ultrasonic Homogenizer | Omni International | 18-000-115 | |
| Micro-Tip for Ultrasonic Homogenizer | Omni International | OR-T-156 | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A451 | |
| Noise Cancelling Ear Muffs | Fisher Scientific | 19-145-412 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | S47299 | |
| 1.5 ml tubes | USA Scientific | 1615-5510 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 000.215 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-136 | |
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| 50 ml Conical Tubes | Phenix Research | SS-PH15 | |
| 25 ml reagent resevoirs | VWR | 41428-954 | |
| Multi channel pipet | Fisher Scientific | TI13-690-049 | |
| 96 well flat bottom plates | Corning | 3603 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| 96 well round bottom plates | Corning | 3788 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED2SS | |
| HBSS | Life Technologies | 14185-052 | |
| Sorvall ST 40 Centrifuge | Thermo Scientific | 75004509 | |
| BIOLiner Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientific | 75003796 | |
| Hemacytometer | VWR | 15170-172 | |
| MACSQuant VYB Flow Cytomter | Miltenyi Biotec | 130-096-116 | |
| Chill 96 Rack | Miltenyi Biotec | 130-094-459 | |
| Flow Jo analysis software | Flow Jo | ||
| 20 μl pipet tips | Rainin | GPS-L10 | |
| 200 μl pipet tips | Rainin | GPS-250 | |
| 1 ml pipet tips | Rainin | GPS-1000 | |
| 200 μl pipet tips | USA Scientific | 1111-1800 | |
| 5 ml serological pipett | Phenix Research | SPG-606180 | |
| 10 ml serological pipett | Phenix Research | SPG-607180 | |
| 25 ml Serological pipett | Phenix Research | SPG-760180 |
References
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