Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.
Infarto del miocardio (MI) ha drammatiche a medio e lungo termine conseguenze a livello fisiologici e comportamentali, ma i meccanismi coinvolti sono ancora poco chiari. Il nostro laboratorio ha sviluppato un modello murino di sindrome post-MI che visualizza ridotta funzionalità cardiaca, perdita neuronale nel sistema limbico, deficit cognitivi e segni comportamentali di depressione. A livello neuronale, caspasi-3 attivazione media post-MI apoptosi in diverse regioni limbiche, come l'amigdala – picco di 3 giorni post-MI. Disturbi cognitivi e comportamentali compaiono 2-3 settimane post-MI e questi correlazione statisticamente con misure di caspasi-3 attività. Il protocollo qui descritto è usato per indurre MI, raccogliere tessuti dell'amigdala e misurare caspasi-3 attività utilizzando spettrofluorimetria. Per indurre MI, la coronaria discendente è occlusa per 40 min. Il protocollo per la valutazione della caspasi-3 attivazione inizia 3 giorni dopo MI: i ratti vengono sacrificati e l'amigdala isolato RAPIDLY dal cervello. I campioni vengono congelati rapidamente in azoto liquido e conservati a -80 ° C fino all'analisi attuale. La tecnica eseguita per valutare l'attivazione della caspasi-3 è basato sulla scissione di un substrato (DEVD-AMC) di caspasi-3, che rilascia un composto fluorogenica che può essere misurata mediante spettrofluorimetria. La metodologia è quantitativa e riproducibile ma l'attrezzatura necessaria è costosa e la procedura per quantificare i campioni richiede tempo. Questa tecnica può essere applicata ad altri tessuti, quali il cuore e reni. DEVD-AMC può essere sostituito da altri substrati per misurare l'attività di altre caspasi.
Caspasi o proteasi aspartato-diretto cisteina-dipendenti sono una famiglia di enzimi che sono coinvolti in vari omeostasi processess 1. Caspasi possono essere classificati in base ai loro ruoli in apoptosi o infiammazione. Caspase-1, -4, -5 e -12 sono coinvolte nel processo infiammatorio, mentre coloro che sono impegnati in apoptosi può essere sotto-classificate come caspasi iniziatrici (caspasi-8 e -9) e caspasi boia (caspasi-3, -6 e -7 ).
Caspasi svolgono ruoli significativi in molte patologie, soprattutto nei disordini in cui l'apoptosi può essere eccessivo, come osservato dopo infarto miocardico (IM) o ischemia cerebrale.
Nel modello murino di sindrome post-MI utilizzata nel nostro laboratorio, è accertato che si attiva caspasi-3, non solo nel miocardio 2, ma anche nel sistema limbico, che è implicato nel controllo dell'umore e le emozioni 3-6. Si è anche visto che è attivato caspasi-3 in diverse regionidel sistema limbic, come l'amigdala e ippocampo, e questa attivazione picchi intorno 3 giorni dopo insulto ischemico 4. È interessante notare che, caspasi-3 attività si correla con i danni comportamentali post-MI, e la sua attenuazione attraverso interventi farmacologici e nutrizionali riduce queste lesioni, suggerendo un possibile legame tra caspasi-3 e post-MI depressione 7-12.
Caspasi-3 attivazione può essere misurata mediante varie tecniche. Western blotting accerta le proprietà enzimatiche delle caspasi e può rilevare enzimi attivi e le loro forme pro-enzima. Western blotting, tuttavia, è semi-quantitativo, e piccole variazioni può essere perso attraverso rapporti deboli segnale-rumore 13. Una tecnica migliore è basato sulla scissione di un substrato (DEVD-AMC) di caspasi-3 che rilascia un composto fluorogenica e può essere misurata mediante spettrofluorimetria. Caspasi-3 attivazione è un indicatore affidabile di apoptosi. Misura di apoptosi can instabile perché la finestra di tempo di occorrenza è breve, e le cellule confinanti possono fagocitare corpi apoptotici o celle 14. L'apoptosi può essere ulteriormente confermata da altre tecniche, come Terminal deossinucleotidil transferasi etichettatura fine dUTP nick (TUNEL) test, che rileva la frammentazione del DNA risultante da cascate apoptotici segnalazione 6, o il rapporto di proteine pro / anti-apoptotico, come Bax / Bcl2 6.
La nostra esperienza con questo protocollo nel corso degli ultimi 10 anni ha portato all'identificazione di questioni metodologiche critiche. Innanzitutto, rapida dissezione cervello in piastre di Petri su ghiaccio tritato è importante per mantenere la qualità di preparazione. In secondo luogo, si deve tener presente che il tessuto è più breve sonicazione per l'amigdala cerebrale rispetto ad altri tipi di tessuti, quali il cuore (10 sec) o reni (20 sec). In terzo luogo, grande attenzione deve prestare attenzione a miscelare con cura il substrato prima di aggiungerlo ai campioni. Abbiamo incontrato i segnali variabili quando la sequenza di miscelazione è stata inadeguata. Quarto, nessun bolle devono essere presenti nella cella di quarzo durante la lettura dei campioni. Altrimenti, il segnale potrebbe essere alterata.
Abbiamo fatto un cambiamento negli ultimi anni per aumentare la riproducibilità dei risultati: crescente volume del substrato per evitare volume inferiore 1 ml. Ancora, possono verificarsi piccole variazioni tra dosaggi successivi, e almeno 3 campioni di controllo devono essere utilizzati perControllo per le variazioni. Misure di fluorescenza di questi controlli viene calcolata la media e la media è fissato a 100%. Misure di fluorescenza in campioni sperimentali sono trasformati in percentuale dei campioni di controllo.
Un'altra limitazione della tecnica è che viene utilizzata solo una parte di tessuto e, quindi, della caspasi-3 attività potrebbe essere sottostimato. Infatti, la finestra temporale di apoptosi è breve in qualsiasi data cellula e potrebbe mancare anche se si verifica nelle zone limitrofe al momento del campionamento 1,4,15. L'inverso è anche possibile: apoptosi potrebbe essere particolarmente intensa in porzioni di tessuto, con conseguente sovrastima della caspasi-3 attività. Si consiglia l'uso di tessuti rimanenti (amigdala) per le tecniche complementari, come test TUNEL o il rapporto Bax / Bcl2 (vedi introduzione).
Spettrofluorimetria ha almeno due vantaggi rispetto Western blotting. Innanzitutto, esso genera direttamente dati quantitativi. In secondo luogo, una misura enzimaticactivity se piuttosto che proteine o RNA espressione, che può essere correlato, ed è noto che l'espressione della proteina può essere aumentata senza alcun cambiamento di attività enzimatica. Inoltre, spettrofluorimetria può essere eseguita su altri tessuti o con differenti specie animali e può essere regolato per altri sottotipi caspasi, con differenti substrati, tale che i confronti sicurezza può essere fatto.
In conclusione, questo documento illustra l'utilizzo di spettrofluorimetria per misurare caspasi-3 attività dell'amigdala, fornendo prove che l'apoptosi si verifica in questa regione del sistema limbic 3 giorni dopo MI.
The authors have nothing to disclose.
. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da parte scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada Kim Gilbert tiene una borsa di studio da Fonds de la recherche du Québec – Santé.
Spectroflurometer | Photon technology Instrument (now Horiba) | Ratiomaster M-40 | with DeltaRAM Random Access Monochromator |
Respirator | Harvard apparatus | 683 | small animal ventilation |
Glass cuvette | NSG precision cells | 3G10 | Optical Glass (340-2,500nm) 10 mm path |
Sonicator | Cole Parmer | 4710 series | |
Spectrometer | Varian | Cary 50 Bio |