心筋梗塞後の分光分析により測定したラットの扁桃体におけるカスパーゼ-3活性

Abstract

心筋梗塞（MI）は、生理学的および行動レベルでの劇的な中・長期的な影響を持っていますが、関与するメカニズムはまだ不明です。私たちの研究室では、損なわれた心機能、大脳辺縁系におけるニューロン喪失、認知障害とうつ病の行動の兆候が表示され、MI後症候群のラットモデルを開発しました。 MI後の3日目にピークに達し - ニューロンのレベルでは、カスパーゼ3活性化は、扁桃体などの異なる辺縁地域で心筋梗塞後のアポトーシスを仲介します。認知および行動障害は、MI後2-3週間表示され、これらは、カスパーゼ3活性の測定値と統計的に相関しています。ここで説明するプロトコルは、MIを誘導する扁桃組織を収集し、分光分析を用いてカスパーゼ-3活性を測定するために使用されます。 MIを誘導するために、下行冠状動脈を40分間閉塞されます。ラットを屠殺し、扁桃体は、RAPIを単離した：カスパーゼ-3活性化を評価するためのプロトコルは、3日後に開始するMI脳からDLY。サンプルは、すぐに液体窒素中で凍結させ、実際の分析まで-80℃で保存されています。カスパーゼ3活性化を評価するために実行される手法は、分光分析によって測定することができる蛍光性化合物を放出するカスパーゼ-3による基質（DEVD-AMC）の開裂に基づきます。方法は、定量的および再現可能であるが、必要な機器は高価であり、サンプルを定量するための手順は、時間がかかります。この技法は、心臓や腎臓のような他の組織に適用することができます。 DEVD-AMCは、他のカスパーゼの活性を測定するために、他の基板に置き換えることができます。

Introduction

カスパーゼまたはシステイン依存アスパラギン酸指向プロテアーゼは、さまざまなホメオスタシスprocessess ¹に関与している酵素のファミリーです。カスパーゼは広くアポトーシスまたは炎症における役割に応じて分類することができます。カスパーゼ-1、-4、-5およびアポトーシスに従事したものは、イニシエーターカスパーゼ（カスパーゼ-8および-9）と実行カスパーゼとしてサブ分類することができるのに対し、-12は、炎症に関与している（カスパーゼ-3、-6および-7 ）。

カスパーゼは、心筋梗塞（MI）または脳虚血後に観察されたように、主にアポトーシスが過剰であることができる疾患には、多くの病態において重要な役割を果たしています。

私たちの研究室で使用され、MI後症候群のラットモデルでは、カスパーゼ3が心筋²にも、気分や感情^3-6の制御に関与している大脳辺縁系だけでなく活性化されることが確立されています。それはまた、カスパーゼ-3は異なる領域で活性化されていることがわかります大脳辺縁系の、そのような扁桃体や海馬、および虚血発作⁴の3日後の周りのこの活性化ピークとして。興味深いことに、カスパーゼ3活性は、MI後の行動障害と相関し、薬理学的および栄養介入を通じて、減衰はカスパーゼ3および心筋梗塞後のうつ病^7-12の間の可能なリンクを示唆し、これらの傷害を軽減します。

カスパーゼ-3の活性化は様々な技術によって測定することができます。ウエスタンブロット法は、カスパーゼの酵素特性を把握し、活性酵素、ならびにそれらのプロ酵素の形態を検出することができます。ウェスタンブロッティングは、しかしながら、半定量的であり、小さな変動は、弱い信号対雑音比^{13を介して}失われることがあります。より良い手法は、蛍光性化合物を放出し、分光分析により測定することができるカスパーゼ-3による基質（DEVD-AMC）の開裂に基づきます。カスパーゼ-3の活性化は、アポトーシスの信頼できるマーカーです。アポトーシスCAの測定nは発生の時間ウィンドウが短いため、不安定であること、及び隣接セルのアポトーシス体または^セル 14 ^を貪食できました。アポトーシスは、さらに、例えば、Baxのようにアポトーシスのシグナル伝達カスケード^6、または抗アポトーシス/プロタンパク質の比から得られたDNA断片を検出するターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニック末端標識（TUNEL）アッセイ、/のような他の技術によって確認することができますBCL2 ^6。

Protocol

動物は動物ケアのカナダの協議会のガイドラインに従って、地元の動物ケア委員会の規制に準拠して処理される。ラットは、（21〜22ºCの温度と40〜50％の湿度）個別に一定の条件下で飼育されています08:00から始まる、12時間明暗サイクルを含みます。チョウペレットと水道水は、研究を通して自由に摂取されています。サプライヤーによる送達後3日間の馴化期間は、実験前に許可されています。 300〜800グラムの体重の雄性Sprague-Dawleyラットは、日常このプロトコルで使用されてきました。

1. MI手術

1. ケタミン60 mgの/ kgおよびキシラジン10mg / kgの腹腔内注射で麻酔を誘導します。足が挟まれているときに反射の欠如によって適切な麻酔を確認してください。
2. 手術部位を剃ります。 （16G 1.77インチ）をカテーテルと側臥位で動物を配置します。気管内チューブを挿管ラット。 37℃前後の温度を維持するために加熱パッドの上に動物を配置します。 2％イソフルランする気管内チューブを接続します。
3. グルコン酸クロルヘキシジン、イソプロピルアルコールで手術部位を準備します。手術中、滅菌手袋、滅菌機器を使用しています。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、両眼に眼軟膏を適用します。動物や動物の隣に別の滅菌フィールド上の機器に滅菌フィールドを置きます。
4. 手術用メスの刃＃10で皮膚を切開。止血クランプで筋肉組織をはがし。腹臥位の位置に動物を配置します。止血クランプ位置の胸の開創と胸壁を開きます。止血クランプで開く心膜。
5. 連続した心筋組織を通過し、下降冠状動脈の周りの冠動脈閉塞、ループ360ミリメートル長4-0絹縫合糸を製造することができます。 14G 1.25 cmの長さのプラスチックチューブに絹縫合糸の両端を挿入します。
6. 絹縫合糸と膿の両端を引いhは動脈に対するダウンチューブを40分間、それを閉塞します。止血クランプでプラスチックチューブをクランプすることによって閉塞を固定します。
7. 40分後、フレキシブルチューブ、絹縫合糸を除去した止血クランプを、解放することによって閉塞を解除します。
   注：シャム対照ラットには同じ外科的処置のマイナス冠状動脈の閉塞を受けます。
8. 胸壁を閉じる前に、気胸を防ぐために、5 mlのシリンジを用いて胸部から空気を描画するために胸腔を通して柔軟なカテーテル（18G 4.5センチ）を配置。
9. 2-0縫合糸で閉じる胸部空洞、4-0絹縫合糸と3-0絹縫合糸で皮膚と筋肉をステッチ。
10. 最後のスキンポイントを閉じる前に、再び胸部キャビティ内にあらかじめ配置されたカテーテルを通して5 mlのシリンジを用いて胸部から空気を引き出します。
11. 最後のスキンポイントを縫合。イソフルラン換気を停止します。
12. ラットの覚醒を監視します。それはregaineを有するまで無人の動物を放置しないでくださいD十分な意識は胸骨横臥位を維持します。
13. 鎮痛剤（ブプレノルフィン、0.05ミリグラム/ kg、腹腔内）で抗生物質（duplocillinの単回投与、0.2ミリグラム/ kg、腹腔内）でラットを24時間毎に8時間を扱います。
14. 手術後、家のラット個別に屠殺時まで、 すなわち 、3日後にMI。
15. 梗塞サイズ、主に壊死は、左心室の危険性のある領域における梗塞組織の割合として表されます。これは、トリフェニル着色^{11を用いて測定}することができます。

2.扁桃体の分離

1. その鼻は狭い端部の開口部の外に突出して、円錐形のバッグの中に最初の動物の頭を置きます。あらゆる動きを避けるために、ラットを固定します。はさみの刃の間に、ギロチンに適切にその頭を置きます。動物の首を切ります。
2. 皿にラットの頭部を置き、砕いた氷の上に保持。砕いた氷（4℃）で組織分離のためのすべての手順を実行します。
3. カットオープンSK慎重に引き上げと下の組織をmutilating回避することにより、骨鉗子で骨シースを切り離し、ハサミでULL。
4. 頭蓋骨の底部と脳の後部腹側表面との間にヘラの平らな刃を置き、慎重に脳をゆっくり外に持ち上げることができるようになるまで静かに頭蓋骨の底部に沿って前方に刃を押して、頭蓋骨から脳を切り離し頭蓋骨。頭蓋骨を捨てます。
5. その背側表面に脳を置きます。視床下部（小脳の前の構造）を特定し、その前端の、その後端の前後に冠状脳をカット。他の用途のために必要とされていない場合、脳の前方および後方部分を破棄します。
6. ちょうど次の視床下部に、左右対称に、側頭葉の下に小球としてamygdalasを視覚化。
7. 離れ実験者からの正面の端に脳フラットフリップ、背面。
8. 脳の左側または右側から開始します。ヘミを分離球体して、連続した扁桃体からの皮質。扁桃体の単離を可能にするために、この緩い皮質の方法8mm程度をカットします。メスで扁桃体を切り取ります。
9. それ横切る暗い縫合糸に沿って切断することにより、そのcentromedial部分から扁桃体の基底外側の部分を分離し、ほぼ半々。この構造は、常に容易に識別ではありません。
10. 個別の識別されたバイアル中に扁桃体のサブパーツを入れて、砕いた氷の上におきます。
11. 他の半球で解剖手順を繰り返します。
12. 1分間液体窒素中でバイアルを浸し。必要になるまで-80℃の冷凍庫にバイアルをしてください。

3.カスパーゼ-3活性

1. スクロースの0.32 Mで溶解緩衝液を調製し、1％トリトンX-100、トリス-HCl、pH8の10mMのエチレンジアミン四酢酸の5 mMのジチオスレイトール、2 mMの、フェニルメチルスルホニルフルオリド1mMの、ロイペプチン10μgの/μL 、ペプスタチンAの10μgの/μLおよびアプロチニン10μgの/μL。
2. 各サンプル（5〜10mgの）に溶解バッファー150μlのを追加します。氷の上に保管してください。最大強度（40 W）で5秒間、氷上で超音波処理し、各サンプル。 30分間氷上で溶解緩衝液中で組織をインキュベートします。 5分間、各サンプルをボルテックス。
3. 液体窒素および37℃に設定したサーモスタット制御加熱プレート上で交互にサンプルを配置することによって、3回の凍結/融解サイクルを行います。 13,000gで遠心組織（4 10分間°C）。注意深く上清を除去し、氷上でチューブに保ちます。
4. ウシ血清アルブミンを0と10μg/ mlの間で標準的なタンパク質濃度を準備します。緩衝液のみで空白を準備します。
5. 各規格にBradford試薬200μlのを追加します。 595 nmにおける標準読みます。タンパク質レベルでは、蒸留水795μlのブラッドフォード試薬の200μlにサンプル上清の5μlを添加します。 595nmで各サンプルを読み、標準曲線を有するタンパク質を定量化します。
6. 5mMのMgCl _2、50mMのトリス-HCl、pHが_7、<との反応緩衝液を調製します/サブ>、エチレングリコール四酢酸1mMの、3-cholamidopropylの0.1％）ジメチル] -1-プロパン及びジチオスレイトール1mMの。
7. 正と負の反応サンプルを得るために反応緩衝液およびカスパーゼ3基質に25μgのタンパク質を追加します。負のサンプルについて、25μgのタンパク質は、AC-DEVD-CHO 800μMの0.4μLとのAc-DEVD-AMCの10mMの0.8μlを、反応バッファーを追加します。正のサンプルでは、​​反応緩衝液に25μgのタンパク質とのAc-DEVD-AMCの10mMの0.8μlを添加します。三重ですべての負と正のサンプルを処理します。反応緩衝液を添加することによって、200μlのまで各試料の最終容量を完了します。
8. Ac-DEVD-CHO 800μMの0.5μL、0.8μLのAc-DEVD-AMCの10mM、溶解緩衝液の10μlに反応緩衝液の188.7μLを追加することで、ネガティブコントロールを生成します。陽性対照のために、反応緩衝液189.2μlのAC-DEVD-AMCの10mM、溶解緩衝液10μlを0.8μlを添加します。
9. サンプルをインキュベートし、37 ^O℃で3時間暗所でのコントロール
10. 各サンプルとコントロールに600μlのグリシン、0.4MのNaOHと0.4 M（pHが10）との反応を停止します。
11. 465ナノメートルの波長365nmおよび発光波長の励起波長で蛍光分光分析によって蛍光を定量化します。ガラスキュベット中の反応に2mlの蒸留水を追加します。各秒に1点で10秒間コントロールとサンプルをお読みください。
12. 各試料中の特定の活動を定量化：（陰性サンプルマイナス陽性サンプルの蛍光（蛍光）2.8ミリリットルの容量をX）（タンパク質25ミリグラムのインキュベーション3時間のX量の時間）で割りました。

Representative Results

扁桃体8偽（対照）および三日虚血/再灌流プロトコルの誘導後8 MIラットで単離しました。カスパーゼ3活性は、活性カスパーゼ3によって切断され、分光分析によって検出することができる蛍光色素を使用して、この組織で測定しました。正および負の測定値は（ステップ3.11、3.12と3.16を参照）は、各秒で1ポイントと、10秒の間に三連で実施し、測定しました。陽性対照および陰性対照の間の差を計算し、この実験中に行われたすべての偽の組織に対する差の平均を100％に設定しました。 MIラットからの結果は、この参照に従ってスケーリングされ、 図1は、最終的な結果を示しています。それは、偽（P <0.05）に比べてMIラットで有意に高い活性を示しています。

図1.カスパーゼ3MIラットの扁桃体の活動は、100％（1群あたり8匹）に設定され、偽のコントロールの平均活性のパーセンテージとして表しました。 *重要な群間差（p <0.05）を示します。データは平均±SEMとして表されます。

Discussion

過去10年間で、このプロトコルでの経験は重要な方法論的問題の同定につながりました。まず、砕氷上にペトリ皿の急速な脳の解剖は、準備の品質を維持することが重要です。第二に、組織の超音波処理は、心臓（10秒）のような組織、または腎臓の他のタイプ（20秒）に比べて脳の扁桃体のために短いことが実現されなければなりません。第三に、細心の注意を注意深くサンプルに追加する前に、基材を混合するために取られるべきです。混合順序が不十分であったときに我々は変数の信号を検出しました。サンプルを読み込むときに第四に、気泡は石英セル中に存在してはなりません。そうでなければ、信号を変更することができます。

1μL未満の容量を回避するために、基板のボリュームを増やす：私たちは、結果の再現性を高めるために、ここ数年の変化をしました。それでも、小さな変動は、連続アッセイ間で発生する可能性があり、少なくとも3対照試料に使用されるべきですバリエーションの制御。これらのコントロールの蛍光測定値を平均化し、平均値を100％に設定されています。実験試料中の蛍光測定値は、対照サンプルの割合に変換されます。

技術の他の限界は、組織の一部のみが使用されることがあり、したがって、カスパーゼ3活性を過小評価することができます。実際、アポトーシスの時間ウィンドウは、任意のセル内の短絡であり、それは^{1,4,15サンプリング}時に隣接する地域で発生しても見逃すことができました。その逆も可能です：アポ​​トーシスは、カスパーゼ3活性の過大評価、その結果、組織の部分に特に強烈である可能性があります。当社は、TUNELアッセイまたはバックス/ Bcl2の比（概要を参照してください）​​などの補完的な技術、の残りの組織（扁桃体）の使用をお勧めします。

蛍光分光分析は、ウエスタンブロット法に比べて少なくとも2つの利点があります。まず、直接定量的データを生成します。第二に、酵素Aを測定しますctivity自体ではなく、無関係であってもよく、それは、タンパク質の発現は、酵素活性の変化なしに増大させることができることが知られているタンパク質またはRNA発現。また、分光蛍光分析は、他の組織または異なる動物種を用いて実施することができ、安全な比較を行うことができるように、別の基質と、他のカスパーゼのサブタイプのために調整することができます。

結論として、このドキュメントでは、アポトーシスが3日、MI後大脳辺縁系のこの領域で発生することの証拠を提供し、扁桃体におけるカスパーゼ3活性を測定する分光分析の使用方法を示しています。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectroflurometer	Photon technology Instrument (now Horiba)	Ratiomaster M-40	with DeltaRAM  Random Access Monochromator
Respirator	Harvard apparatus	683	small animal ventilation
Glass cuvette	NSG precision cells	3G10	Optical Glass (340-2,500 nm) 10 mm path
Sonicator	Cole Parmer	4710  series
Spectrometer	Varian	Cary 50 Bio