Abstract
심근 경색 (MI)는 생리적 및 행동 수준에서 극적인 중장기 결과를 초래하지만, 관련된 메카니즘은 여전히 불명확하다. 우리 연구소는 장애 심장 기능, 변연계의 신경 세포 손실,인지 결핍과 우울증의 행동 징후를 표시 MI 후 증후군의 쥐 모델을 개발했다. MI 후 삼일에 뾰족 - 신경 세포 수준에서 카스파 제 -3 활성화는 편도와 같은 다른 변연 지역에서 포스트 MI의 세포 사멸을 매개. 인지 및 행동 장애는 2-3주에게 포스트 MI를 표시하고 이러한 카스파 제 -3 활성의 조치를 통계적으로 상관 관계. 여기에 설명 된 프로토콜은 MI를 유도 편도 조직을 수집하고 spectrofluorometry를 사용 카스파 제 -3 활성을 측정하기 위해 사용된다. MI를 유도하기 위해, 하행 관상 동맥을 40 분간 폐색된다. 래트를 희생하고 편도선은 RAPI 격리 : 카스파 제 -3 활성의 평가를위한 프로토콜 3 일 후에 시작 MI뇌에서 DLY. 샘플은 신속하게 액체 질소에 냉동과 실제 분석 할 때까지 -80 ℃에서 보관됩니다. 카스파 제 -3 활성을 평가하기 위해 수행 spectrofluorometry 기법에 의해 측정 될 수있는 형광 화합물을 방출하여 카스파 제 -3 기질 (DEVD-AMC)의 절단에 기초한다. 방법론은 정량적 재현성하지만 필수 장비는 고가이고 샘플을 정량화하기위한 절차는 시간을 소모한다. 이 기술은 심장, 신장 같은 다른 조직에 적용될 수있다. DEVD-AMC 다른 카스파 제의 활성을 측정하기 위하여 다른 기판으로 대체 될 수있다.
Introduction
카스파 또는 시스테인 의존 아스 파르 테이트 지시 단백질 분해 효소는 다양한 항상성 processess 1에 관여하는 효소의 가족입니다. 카스파는 크게 아폽토시스 또는 염증의 역할에 따라 분류 될 수있다. 카스파-1, -4, -5 -12가 세포 사멸에 종사하는 사람들이있을 수있는 반면 염증에 관여하는 하위 분류 기자 카스파로 (카스파 제 8 -9)와 사형 집행 인의 카스파 (카스파 제 -3, -6 및 -7 ).
심근 경색 (MI) 또는 뇌허혈 후 관찰 카스파는 주로 세포 사멸이 과도 할 수있다 질환에 많은 병리에 중요한 역할을한다.
우리의 실험에 사용 된 후 MI 증후군의 쥐 모델에서, 카스파 제 -3은 심근 2뿐만 아니라 분위기 3-6과 감정의 제어에 연루되는 변연계에서뿐만 아니라 활성화되어 있음을 수립한다. 또한, 카스파 제 -3은 상이한 영역에서 활성화되는 것을 알 수있다변연계의 같은 편도체와 해마, 허혈성 모욕 4 후 3 일 주변이 활성화 피크로. 흥미롭게도, 카스파 제 -3 활성은 MI 후 행동 장애와 상관 관계 및 약리 및 영양 개입을 통해 감쇠는 카스파 제 -3 및 사후 MI 우울증 7-12 사이의 가능한 링크를 제안,이 부상을 줄일 수 있습니다.
카스파 제 -3 활성은 다양한 기법에 의해 측정 될 수있다. 웨스턴 블 롯팅은 카스파의 특성을 파악한 후 효소 활성 효소뿐만 아니라 프로 효소 형태를 검출 할 수있다. 웨스턴 블 롯팅은, 그러나, 반 정량적이고, 작은 변화는 약한 신호 - 대 - 잡음 비율 (13)을 통해 손실 될 수있다. 더 나은 기술이 형광 화합물을 해제하고 spectrofluorometry 의해 측정 될 수 카스파 제 (3)에 의한 기판 (DEVD-AMC)의 절단에 기초한다. 카스파 제 -3 활성화는 세포 사멸의 신뢰할 수있는 마커입니다. 세포 사멸의 CA의 측정N의 발생 시간 윈도우가 짧기 때문에 불안정하고, 인접 셀은 세포 자멸 소체 세포 또는 14 phagocytize 있었다. 아폽토시스는 또한 이러한 백스 / 같이 사멸 시그널링 캐스케이드 (6), 또는 항 - 세포 사멸 / 프로 단백질의 비율에 의한 DNA 단편화를 검출하는 그러한 터미널 데 옥시 뉴 클레오 타이 딜 트랜스퍼 dUTP 닉 엔드 (nick end) 표지화 (TUNEL) 분석과 같은 다른 기술들에 의해 확인 될 수있다 BCL2 6.
Protocol
동물은 동물 관리에 캐나다위원회의 가이드 라인에 따라, 지역 동물 관리위원회의 규정을 준수하여 처리됩니다. 쥐 (21 ~ 22 ºC의 온도 40-50 %에 습도) 개별적으로 일정 조건 하에서 보관되어 08:00에 시작, 12 시간 어두운 조명주기를 포함. 차우 펠릿 및 수돗물은 연구 전반에 걸쳐 사용할 수 임의로 있습니다. 공급자의 납품 후 3 일의 적응 기간은 실험 전에 허용됩니다. 300-800g 사이의 무게 수컷 흰쥐 일상적 프로토콜이 사용되어왔다.
1. MI 수술
- 케타민 60 ㎎ / ㎏과 자일 라진 (10) ㎎ / ㎏의 복강 내 주사와 마취를 유도한다. 발을 슬쩍 할 때 반사의 부재로 적절한 마취를 확인합니다.
- 수술 부위를 면도. (16G 1.77 인치) 카테터 및 측와위에서 동물을 배치 : 기관 내 튜브와 쥐를 삽관. 온도를 약 37 ℃를 유지하기 위해 가열 패드에 동물을 놓습니다. 2 % 이소 플루 란 할 수있는 기관 내 튜브를 연결합니다.
- 클로르헥시딘 글루 콘 이소 프로필 알코올로 수술 부위를 준비합니다. 수술하는 동안, 멸균 장갑 멸균 악기를 사용합니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 두 눈에 안과 연고를 적용합니다. 동물과 동물 옆에 또 다른 무균 필드에 악기 멸균 필드를 넣습니다.
- 메스 블레이드 # 10 피부를 절개. 지혈 클램프와 근육 조직을 벗겨. 복부 욕창 위치에있는 동물을 놓습니다. 지혈 클램프와 위치 가슴 트랙터 오픈 흉부 벽. 지혈 클램프 열기 심낭.
- 연속 된 심근 조직을 통과, 관상 동맥 폐색, 루프에게 하행 관상 동맥 주위에 360mm 길이의 4-0 실크 봉합사를 생산합니다. 14G, 1.25 cm 긴 플라스틱 관에 실크 봉합사의 양쪽 끝을 삽입합니다.
- 실크 봉합사와 고름의 양쪽 끝을 잡아 당겨시간은 아래 동맥에 튜브는 40 분 동안을 폐색한다. 지혈 클램프 플라스틱 튜브를 체결하여 안전 폐색.
- 40 분 후,가요 성 배관 및 실크 봉합사를 제거하여 지혈 클램프를 해제함으로써 폐색을 해제.
주 : 샴 대조군은 동일한 수술 마이너스 관상 동맥 폐색을 겪는다. - 흉부 벽을 닫기 전에, 기흉을 방지하기 위해 5 ML의 주사기와 흉부의 공기를 그릴 흉강을 통해 유연한 카테터 (18G, 4.5 CM)를 배치합니다.
- 닫기 흉부 공동은 2-0 봉합사로, 4-0 실크 봉합사로 근육과 3-0 실크 봉합사로 피부 만들기.
- 마지막으로 피부 지점을 닫기 전에 다시 흉부 캐비티 이전에 배치 카테터를 통해 5 ML의 주사기와 흉부의 공기를 그립니다.
- 마지막으로 피부에 포인트를 봉합. 이소 플루 란 환기를 중지합니다.
- 쥐의 각성을 모니터링합니다. 이 regaine을 가질 때까지 무인 동물을 방치하지 마십시오D 충분한 의식은 흉골 드러 누움을 유지합니다.
- 항생제와 진통제 (부 프레 노르 핀, 0.05 ㎎ / ㎏ IP)과 24 시간 (duplocillin의 단일 용량, 0.2 ㎎ / ㎏ IP)에 대한 쥐에게 매일 8 시간을 취급합니다.
- 수술 후, 집 쥐 개별적으로 즉 희생의 시간까지 3 일 후 MI.
- 경색 크기 주로 괴사는 좌심실의 위험 지역에서 경색 된 조직의 비율로서 표현된다. 이는 트리 페닐 착색 (11)를 이용하여 측정 할 수 있습니다.
2. 편도 격리
- 코가 좁은 끝 구멍 밖으로 돌출, 원뿔 모양의 가방에 먼저 동물 머리를 놓습니다. 보안 쥐 움직임을 방지 할 수 있습니다. 가위 블레이드 사이에, 단두대에 적절하게 머리를 놓습니다. 동물의 목을 벨.
- 접시에 쥐 장소 머리가 짓 눌린 얼음에 보관. 얼음 조각 (4 ℃로)에 조직 분리를위한 모든 절차를 수행합니다.
- 잘라 열린 SKULL 가위로 조심스럽게 잡아 당겨과 아래 조직을 토막 피함으로써 뼈 rongeurs과 뼈 덮개를 분리합니다.
- 두개골의 바닥과 뇌의 후방 복부 표면 사이의 주걱의 플랫 블레이드를 놓고 조심스럽게 뇌가 천천히 올라 해제 될 때까지 부드럽게 두개골의 바닥을 따라 앞으로 블레이드를 밀어 두개골에서 뇌를 분리 두개골. 두개골을 폐기하십시오.
- 는 등의 표면에 두뇌를 놓습니다. 시상 하부 (소뇌의 앞에 구조)를 확인하고 그 앞쪽 끝과 후방 끝 뒤에 앞에 coronally 뇌를 잘라; 다른 용도로 필요하지 않은 경우 뇌의 앞쪽과 뒤쪽 부분을 폐기합니다.
- 바로 옆에있는 시상 하부에, 좌우, 측두엽 아래에 작은 구체로 amygdalas을 시각화.
- 멀리 실험에서, 그 정면 끝 등의 표면을 뇌 플랫 플립.
- 뇌의 왼쪽 또는 오른쪽으로 시작합니다. 헤미을 분리다음 분야와 인접 편도체의 피질. 편도의 분리를 허용하려면이 느슨한 피질의 방법에 대한 8mm를 잘라. 메스와 편도체를 버려야.
- 그것을 통해 실행하는 어두운 봉합, 거의 절반의 절반을 따라 절단하여 centromedial 부분에서 편도의 기저 부분을 분리합니다. 이 구조는 항상 쉽게 식별 아니다.
- 별도의 확인 된 유리 병에 편도체의 하위 부분을 넣고 짓 눌린 된 얼음에 보관하십시오.
- 다른 반구와 반복 해부 절차.
- 1 분 동안 액체 질소에 튜브를 담근다. 필요할 때까지 -80 ° C의 냉동고에 병을 보관하십시오.
3. 카스파 제 3 활동
- 수크로오스 0.32 M, 1 % 트리톤 X-100, 트리스 -HCl, pH가 8, 에틸렌 디아민 테트라 아세트산의 5 mm의 디티 오 트레이 톨의 2 mm의 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드로부터 1mm, 류 펩틴 10 μg의 μL / 10 mm의 용해 완충액을 제조 , 펩 스타틴 A의 10 μg의 / μL과 아프로 티닌의 10 μg의 / μL.
- 각 샘플 (5-10 mg)을에 용해 버퍼 150 μl를 추가합니다. 얼음에 보관하십시오. 최대 강도 (40 W)에서 5 초 동안 얼음에 각각의 샘플을 초음파 처리. 30 분 동안 얼음에서 용해 완충액에서 조직을 배양한다. 와류에서 5 분 동안 각각의 샘플.
- 교대 액체 질소에서 37 ° C로 설정 자동 온도 제어 가열판에 샘플을 놓고 3 냉동 / 해동 사이클을 수행한다. 13,000g에서 원심 분리기 조직 (4 10 분 동안 ° C). 조심스럽게 상층 액을 제거하고 얼음에 튜브를 유지.
- 소 혈청 알부민으로 0 및 10 ㎍ / ml이다 표준 단백질 농도를 준비한다. 전용 버퍼 공백을 준비합니다.
- 각 표준에 브래드 포드 시약 200 μl를 추가합니다. 595 nm에서 표준 읽기. 단백질 수준, 증류수 795 μL 및 브래드 포드 시약 200 μL를 샘플의 상등액 5 μL를 추가한다. 595 nm에서 각각의 샘플을 읽고 표준 곡선과 단백질을 정량화.
- 5 밀리미터의 MgCl 2에 50 mM Tris-HCl, pH 7, <와 반응 완충액을 제조/ 서브>, 에틸렌 글리콜 디아민 테트라 아세트산의 1 mm의 3 0.1 % cholamidopropyl) dimethylammonio] -1- 프로판 디티 오 트레이 톨 및 1 mm이다.
- 양성 및 음성 반응 샘플들을 획득하기 위해 반응 완충액 및 카스파 제 -3 기질에 25 μg의 단백질을 추가한다. 음의 샘플은, 단백질 25 μg의, AC-DEVD 초 800 μm의 0.4 μL와 AC-DEVD-AMC 10 mm의 0.8 μL, 반응 버퍼를 추가합니다. 긍정적 인 샘플의 경우, 반응 버퍼에 단백질 25 μg의와 AC-DEVD-AMC 10 mm의 0.8 μl를 추가합니다. 세중의 모든 부정과 긍정적 인 샘플을 처리합니다. 반응 버퍼를 추가하여 200 μL까지 각 샘플의 최종 부피를 완료합니다.
- AC-DEVD-CHO 800 μM, 0.5 μL, 0.8 μL AC-DEVD-AMC 10 mM 내지 용해 완충액 10 μL에 반응 완충액 중 188.7 μl를 첨가함으로써 네거티브 컨트롤을 생성한다. 양성 대조군의 경우, 반응 버퍼의 189.2 μL, AC-DEVD-AMC 10 mm의 0.8 μL 및 용해 버퍼의 10 μl를 추가합니다.
- 샘플을 품어37 O ℃에서 3 시간 동안 어둠 속에서 컨트롤
- 각 샘플 및 제어에 600 μL 글리신 0.4 M NaOH를 0.4 M (PH 10)과의 반응을 중지합니다.
- 465 내지 365 nm이고, 발광 파장의 여기 파장에 의해 형광 spectrofluorometry 정량화. 유리 큐벳의 반응에 증류수 2 ㎖를 추가합니다. 각 초에 1 포인트 10 초 동안 제어 및 샘플을 참조하십시오.
- 각 샘플의 특정 활동을 정량화 : ((음 샘플 마이너스 긍정적 인 샘플의 형광) 2.8 ml를 X 볼륨의 형광) (단백질 25 mg을 배양 3 시간의 X 양의 시간)으로 나눈 값입니다.
Representative Results
편도 8 가짜 (제어) 및 삼일 허혈 / 재관류 프로토콜의 유도 후 8 MI 쥐에서 분리 하였다. 카스파 제 -3 활성은 활성 카스파 제 -3에 의해 절단하고 spectrofluorometry 의해 검출 될 수있는 형광 색소를 사용하여이 조직을 측정 하였다. 긍정과 부정 측정 (단계 3.11, 3.12 및 3.16 참조) 각 초에서 1 점으로, 10 초 동안 세중 수행하고 측정 하였다. 양성 및 음성 대조군의 차이를 산출하고,이 실험을 수행하는 동안 모든 조직에 대한 모의 차이의 평균을 100 %로 설정 하였다. MI 쥐의 결과는이 기준에 따라 조정하고, 그림 1은 최종 결과를 보여 그것은 가짜 (P <0.05)에 비해 심근 경색 쥐에서 상당히 높은 활성을 나타냅니다.
도 1 카스파 제 -3MI 쥐의 편도체의 활동은, 100 % (그룹 당 8 쥐)로 설정, 가짜 컨트롤의 평균 활동의 백분율로 표시. * 상당한 집단 간 차이 (P <0.05)를 나타냅니다. 데이터는 SEM ± 평균으로 표현된다.
Discussion
지난 10 년 동안이 프로토콜을 사용하여 우리의 경험은 중요한 방법 론적 문제의 식별되었다. 첫째, 짓 눌린 된 얼음에 페트리 접시에 빠른 뇌 해부 준비 품질을 유지하는 것이 중요하다. 둘째, 조직은 초음파 등의 심장 (10 초)과 같은 조직의 유형, 또는 신장 (20 초)에 비해 뇌에 대한 편도체 짧다고 실현되어야한다. 셋째, 큰 관심을 신중 샘플에 추가하기 전에, 기판을 혼합주의해야한다. 혼합 순서가 불충분 한 때 우리는 변수 신호가 발생했습니다. 샘플을 판독 할 때 제, 기포는 석영 셀에 존재할 수 없어야한다. 그렇지 않으면, 신호가 변경 될 수있다.
1 μL 미만의 체적을 피하기 위해 기판 부피가 증가 : 우리는 결과의 재현성을 높이기 위해 지난 몇 년 동안 변화했다. 여전히 작은 변화는 연속 분석법 사이에서 발생할 수 있고, 적어도 3 개의 시료를 제어하는 데 사용되어야변화를 제어 할 수 있습니다. 이러한 컨트롤 형광 측정 평균화하고, 평균 100 %로 설정된다. 실험 샘플의 형광 측정은 대조 시료의 퍼센트로 변환된다.
기술의 또 다른 한계는 따라서, 카스파 제 -3 활성을 과소 평가 될 수있는 조직의 일부만이 사용되도록하고. 실제로, 아폽토시스의 시간 윈도우는 임의의 주어진 셀 짧게 중이며 1,4,15 샘플링시의 인접 지역에서 발생하더라도 누락 될 수있다. 반대의 경우도 가능하다 : 세포 사멸은 카스파 제 -3 활동의 과대 평가 결과, 조직의 부분에서 특히 강렬한 될 수 있습니다. 우리는 TUNEL 분석 또는 Bax의 /에서 Bcl2 비율 (소개를 참조하십시오)와 같은 보완적인 기술에 대한 잔여 조직 (편도)의 사용을 권장합니다.
Spectrofluorometry 웨스턴 블로 팅을 통해 적어도 두 가지 장점이 있습니다. 첫째, 직접 정량 데이터를 생성한다. 둘째, 효소를 측정ctivity 자체보다는 무관 할 수 있으며,이 단백질의 발현은 효소 활성의 변화없이 증가 할 수 있음을 공지 된 단백질 또는 RNA 발현. 또한, spectrofluorometry는 다른 조직 또는 다른 동물 종으로 수행 될 수 있고, 다른 기판에, 다른 카스파 아형에 대해 조절 될 수 있으므로, 그 비교는 안전 할 수있다.
결론적으로,이 문서는 세포 사멸 3 일 심근 경색 후 변연계의이 지역에서 발생하는 증거를 제공하는 편도체에서 카스파 제 -3 활성을 측정하는 spectrofluorometry을 사용하는 방법을 보여줍니다.
Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
. 상테 -이 작품은 자연 과학 및 캐나다 김 길버트 공학 연구위원회에서 보조금에 의해 지원되었다 퐁 드 라 공들인 뒤 퀘벡에서 재학를 보유하고있다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spectroflurometer | Photon technology Instrument (now Horiba) | Ratiomaster M-40 | with DeltaRAM Random Access Monochromator |
| Respirator | Harvard apparatus | 683 | small animal ventilation |
| Glass cuvette | NSG precision cells | 3G10 | Optical Glass (340-2,500 nm) 10 mm path |
| Sonicator | Cole Parmer | 4710 series | |
| Spectrometer | Varian | Cary 50 Bio |
References
- Denault, J. B., Salvesen, G. S. Caspases: keys in the ignition of cell death. Chemical Reviews. 102, 4489-4500 (2002).
- Boucher, M., et al. Post-ischemic cardioprotection by A2A adenosine receptors: dependent of phosphatidylinositol 3-kinase pathway. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 43, 416-422 (2004).
- Kaloustian, S., et al. Celecoxib after the onset of reperfusion reduces apoptosis in the amygdala. Apoptosis. 12, 1945-1951 (2007).
- Kaloustian, S., et al. Apoptosis time course in the limbic system after myocardial infarction in the rat. Brain Research. 1216, 87-91 (2008).
- Rousseau, G., Bah, T. M., Godbout, R. Chapter 19, Post-Myocardial Infarction Depression. Novel Strategies in Ischemic Heart Disease . Lakshmanadoss, U. , 333-362 (2012).
- Wann, B. P., et al. Apoptosis detected in the amygdala following myocardial infarction in the rat. Biological Psychiatry. 59, 430-433 (2006).
- Arseneault-Breard, J., et al. Combination of Lactobacillus helveticus R0052 and Bifidobacterium longum R0175 reduces post-myocardial infarction depression symptoms and restores intestinal permeability in a rat model. British Journal of Nutrition. 107, 1793-1799 (2012).
- Bah, T. M., et al. Escitalopram reduces circulating pro-inflammatory cytokines and improves depressive behavior without affecting sleep in a rat model of post-cardiac infarct depression. Behavioural Brain Research. 225, 243-251 (2011).
- Bah, T. M., Kaloustian, S., Rousseau, G., Godbout, R. Pretreatment with pentoxifylline has antidepressant-like effects in a rat model of acute myocardial infarction. Behavioural Pharmacology. 22, 779-784 (2011).
- Gilbert, K., et al. Attenuation of post-myocardial infarction depression in rats by n-3 fatty acids or probiotics starting after the onset of reperfusion. British Journal of Nutrition. 109, 50-56 (2013).
- Gilbert, K., Bernier, J., Godbout, R., Rousseau, G. Resolvin D1, a metabolite of omega-3 polyunsaturated fatty acid, decreases post-myocardial infarct depression. Marine Drugs. 12, 5396-5407 (2014).
- Wann, B. P., et al. Behavioural signs of depression and apoptosis in the limbic system following myocardial infarction: effects of sertraline. Journal of Psychopharmacology. 23, Oxford, England. 451-459 (2009).
- Gorr, T. A., Vogel, J. Western blotting re-visited: critical perusal of under-appreciated technical issues. Proteomics: Clinical Applications. , (2015).
- McKernan, D. P., Dinan, T. G., Cryan, J. F. 'Killing the blues': a role for cellular suicide (apoptosis) in depression and the antidepressant response. Progress in Neurobiology. 88, 246-263 (2009).
- Green, D. R. Apoptotic pathways: paper wraps stone blunts scissors. Cell. 102, 1-4 (2000).
