Activité caspase-3 dans l'amygdale Rat mesurée par spectrofluorimétrie après infarctus du myocarde

Abstract

L'infarctus du myocarde (MI) a moyen et long terme des conséquences dramatiques aux niveaux physiologiques et comportementaux, mais les mécanismes impliqués sont encore peu claires. Notre laboratoire a développé un modèle de rat de syndrome post-MI qui affiche les fonctions cardiaques douteux, la perte neuronale dans le système limbique, des déficits cognitifs et comportementaux de dépression signes. Au niveau neuronal, la caspase-3 activation médiateur post-MI apoptose dans différentes régions limbiques, comme l'amygdale - culminant à 3 jours post-IM. Troubles cognitifs et comportementaux apparaissent 2-3 semaines post-IM et ceux-ci sont corrélés statistiquement avec des mesures d'activité caspase-3. Le protocole décrit ici est utilisé pour induire MI, prélever des tissus de l'amygdale et mesurer activité caspase-3 utilisant spectrofluorométrie. Pour induire MI, l'artère coronaire est obstruée décroissant pendant 40 min. Le protocole d'évaluation de la caspase-3 activation commence après 3 jours MI: les rats sont sacrifiés et l'amygdale rapi isolédLY du cerveau. Les échantillons sont rapidement congelés dans de l'azote liquide et conservés à -80 ° C jusqu'à l'analyse proprement dite. La technique réalisées pour évaluer l'activation de la caspase-3 est basé sur le clivage d'un substrat (DEVD-AMC) par la caspase-3, ce qui libère un composé fluorogène qui peut être mesurée par spectrofluorimétrie. La méthode est quantitative et reproductible mais l'équipement nécessaire est coûteux et la procédure de quantification des échantillons prend beaucoup de temps. Cette technique peut être appliquée à d'autres tissus, tels que le cœur et les reins. DEVD-AMC peut être remplacé par d'autres substrats pour mesurer l'activité d'autres caspases.

Introduction

Caspases ou protéases aspartate-dirigé cystéine dépendante sont une famille d'enzymes qui sont impliqués dans divers homéostasie processess ^1. Caspases peuvent être classés en fonction de leurs rôles dans l'apoptose ou une inflammation. Caspase-1, -4, -5 et -12 sont impliqués dans l'inflammation alors que ceux qui sont engagés dans l'apoptose peut être classé en tant que sous-caspases initiatrices (caspase-8 et -9) et les caspases effectrices (caspase-3, -6 et -7 ).

Caspases jouent un rôle important dans de nombreuses pathologies, principalement dans les troubles où l'apoptose peut être excessive, comme observé après un infarctus du myocarde (IM) ou l'ischémie cérébrale.

Dans le modèle de rat de syndrome post-MI utilisé dans notre laboratoire, il est établi que la caspase-3 est activé non seulement dans le myocarde, mais aussi ^deux dans le système limbique qui est impliquée dans la régulation de l'humeur et les émotions ^3-6. On voit également que la caspase-3 est activé dans différentes régionsdu système limbique, comme l'amygdale et l'hippocampe, et cette activation pics près de 3 jours après l'agression ischémique ^4. Fait intéressant, activité caspase-3 est en corrélation avec post-IM troubles de comportement, et de son atténuation par des interventions pharmacologiques et nutritionnelles réduit ces blessures, ce qui suggère un lien possible entre la caspase-3 et la dépression post-MI ^7-12.

Caspase-3 activation peut être mesurée par diverses techniques. Western blot détermine les propriétés enzymatiques des caspases et peut détecter des enzymes actives, ainsi que leurs formes pro-enzyme. Western blot, cependant, est semi-quantitatif, et de petites variations peuvent être perdues par signal-bruit faibles ratios ^13. Une meilleure technique est basée sur le clivage d'un substrat (DEVD-AMC) par la caspase-3 qui libère un composé fluorogène et peut être mesurée par spectrofluorimétrie. Caspase-3 activation est un marqueur fiable de l'apoptose. Mesure de l'apoptose can instable parce que la fenêtre de temps d'apparition est courte, et les cellules voisines pourraient phagocyter des corps apoptotiques ou des cellules ^14. L'apoptose peut être confirmé par d'autres techniques, telles que la désoxynucléotidyl transferase dUTP nick étiquetage d'extrémité (TUNEL) dosage Terminal, qui détecte la fragmentation de l'ADN résultant de cascades apoptotiques de signalisation ^6, ou le rapport des protéines pro / anti-apoptotiques tels que Bax / Bcl2 ^6.

Protocol

Les animaux sont traités en conformité avec la réglementation du Comité de protection des animaux locale, en conformité avec les lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux. Les rats sont logés individuellement dans des conditions constantes (température de 21-22 ° C et une humidité de 40-50%), y compris un cycle de lumière-obscurité de 12 heures, à partir de 08h00. Pastilles Chow et l'eau du robinet sont disponibles ad libitum pendant toute l'étude. Une période d'acclimatation de 3 jours après la livraison par le fournisseur est autorisé avant l'expérience. Des rats Sprague-Dawley pesant entre 300-800 g ont été systématiquement utilisés avec ce protocole.

1. Chirurgie MI

1. Induire une anesthésie avec des injections intra-péritonéales de kétamine 60 mg / kg et de xylazine 10 mg / kg. Confirmez anesthésie appropriée par l'absence de réflexe lorsque les pattes sont pincés.
2. Rasez site chirurgical. Intuber rat avec un tube d'intubation: le cathéter (16G 1,77 pouces) et placez animal en position de décubitus latéral. Placez les animaux sur un coussin chauffant pour maintenir la température autour de 37 ° C. Connectez le tube d'intubation à l'isoflurane 2%.
3. Préparer site chirurgical avec le gluconate de chlorhexidine et de l'alcool isopropylique. Pendant l'opération, utiliser des gants stériles et des instruments stérilisés. Appliquer une pommade ophtalmique à deux yeux pour prévenir la sécheresse tandis que sous anesthésie. Mettez champ stérile sur animaux et les instruments sur un autre champ stérile à côté de l'animal.
4. Inciser la peau avec une lame de bistouri n ° 10. Décoller le tissu musculaire avec une pince hémostatique. Placez l'animal en décubitus ventral. Ouvrir paroi thoracique avec une pince et la position hémostatique poitrine écarteur. Ouvrir le péricarde avec une pince hémostatique.
5. Pour produire une occlusion coronarienne, une boucle 360 ​​mm de long autour de suture en soie 4-0 de l'artère coronaire descendante, en passant par le tissu myocardique contiguë. Insérer les deux extrémités de la suture de soie dans un 14G, long tube de plastique de 1,25 cm.
6. Tirer les deux extrémités du fil de suture en soie et push le tube vers le bas contre l'artère pour boucher ce, pendant 40 min. Occlusion sécurisé par serrage du tube en plastique avec une pince hémostatique.
7. Après 40 min, libérer l'occlusion en libérant la pince hémostatique, puis en enlevant le tuyau et la soie suture flexible.
   Remarque: Les rats témoins Sham subissent le même mode opératoire chirurgical moins l'occlusion de l'artère coronaire.
8. Avant la fermeture de la paroi thoracique, placer un cathéter souple (18G, 4,5 cm) à travers la cavité thoracique pour aspirer l'air sur le thorax avec une seringue de 5 ml pour empêcher un pneumothorax.
9. Fermer cavité thoracique avec 2-0 suture, point le muscle avec 4-0 suture de soie et de la peau avec une suture de soie 3-0.
10. Avant de fermer le dernier point de la peau, tirer à nouveau l'air du thorax avec 5 ml seringue à travers le cathéter placé précédemment dans la cavité thoracique.
11. Suturer dernier point de la peau. Arrêtez la ventilation isoflurane.
12. Surveiller l'éveil de rat. Ne pas laisser un animal sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait regained conscience suffisante pour maintenir décubitus sternal.
13. Traiter chaque rat 8 h pendant 24 heures avec un analgésique (buprénorphine, 0,05 mg / kg ip) et avec un antibiotique (une dose unique de duplocillin, 0,2 mg / kg ip).
14. Après la chirurgie, les rats de maison individuelle jusqu'au moment du sacrifice, soit 3 jours post-IM.
15. Taille de l'infarctus, essentiellement la nécrose, est exprimé comme la proportion de tissu infarci dans la zone à risque du ventricule gauche. Cela peut coloration mesurée en utilisant ¹¹ triphényltétrazolium.

2. Isolement amygdale

1. Placer la première tête d'animal dans un sac en forme de cône, avec son nez faisant saillie hors de l'ouverture d'extrémité étroite. Rat sécurisé pour éviter tout mouvement. Placez la tête de manière appropriée sur la guillotine, entre les lames de ciseaux. Décapitez animal.
2. Lieu la tête du rat dans un plat maintenu sur de la glace pilée. Effectuez toutes les procédures pour l'isolement de tissu sur de la glace pilée (4 ° C).
3. Sk ouverte CouperULL avec des ciseaux, détacher soigneusement gaines osseuses avec rongeurs d'os en tirant et en évitant mutiler le tissu en dessous.
4. Placer la lame plate d'une spatule entre le fond de la boîte crânienne et la surface ventrale postérieure du cerveau et soigneusement détacher cerveau de crâne par doucement pousser la lame vers l'avant le long du fond de la boîte crânienne jusqu'à ce que le cerveau peut être lentement soulevé vers le haut hors de la crâne. Jeter le crâne.
5. Placer cerveau sur sa face dorsale. Identifier hypothalamus (structure avant du cervelet) et couper le cerveau coronaire devant son extrémité antérieure et derrière son extrémité postérieure; jetez les parties antérieure et postérieure du cerveau si non nécessaire pour d'autres usages.
6. Visualisez les amygdalas que de petites sphères sous les lobes temporaux, bilatéralement, juste à côté de l'hypothalamus.
7. Retournez le plat du cerveau sur son extrémité frontale, surface dorsale loin de l'expérimentateur.
8. Commencez par le côté gauche ou droit du cerveau. Séparer l'hémisphères et puis le cortex de l'amygdale contigus. Couper façon d'environ 8 mm de ce cortex lâche pour permettre l'isolement de l'amygdale. Coupez amygdale avec scalpel.
9. Isoler la partie basolatéral de l'amygdale de sa partie centromedial en coupant le long de la suture sombre qui se retrouve à travers elle, presque moitié-moitié. Cette structure ne sont pas toujours facilement identifiable.
10. Mettez sous-parties de l'amygdale dans des fioles distinctes identifiées et de garder sur la glace pilée.
11. Procédure de dissection Répétez avec l'autre hémisphère.
12. Immerger les flacons dans l'azote liquide pendant 1 minute. Conserver le flacon dans -80 ° C congélateur jusqu'à nécessaire.

3. activité caspase-3

1. Préparer du tampon de lyse avec 0,32 M de saccharose, 1% de Triton-X-100, 10 mM de Tris-HCl, pH 8, 5 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique, 2 mM de dithiothréitol, 1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle, 10 ug / ul de leupeptine , 10 ug / ul de la pepstatine A et de 10 pg / pl d'aprotinine.
2. Ajouter 150 ul de tampon de lyse à chaque échantillon (5-10 mg). Garder sur la glace. Soniquer chaque échantillon sur la glace pendant 5 secondes à intensité maximale (40 W). Incuber les tissus dans du tampon de lyse sur de la glace pendant 30 min. Vortexer chaque échantillon pendant 5 min.
3. Effectuez 3 cycles de gel / dégel en plaçant des échantillons alternativement dans l'azote liquide et sur une plaque de chauffage thermostaté réglé à 37 ° C. Tissu Centrifugeuse à 13000 g (4 ° C) pendant 10 min. Retirez délicatement le surnageant et de garder dans le tube sur la glace.
4. Préparer des concentrations de protéine standards entre 0 et 10 ug / ml avec de l'albumine de sérum bovin. Préparer blancs avec tampon seulement.
5. Ajouter 200 pi de réactif de Bradford à chaque norme. Lire standard à 595 nm. Pour des niveaux de protéines, ajouter 5 pl d'échantillon surnageant à 795 ul d'eau distillée et 200 ul de réactif de Bradford. Lire chaque échantillon à 595 nm et de quantifier les protéines avec courbe standard.
6. Préparer du tampon de réaction avec 50 mM de Tris-HCl, pH 7, 5 mM de MgCl _{2 <}/ sub>, 1 mM d'éthylène glycol de l'acide tétra-acétique, 0,1% de 3-cholamidopropyl) diméthylammonio] -1-propanesulfonate et 1 mM de dithiothréitol.
7. Ajouter 25 pg de protéine de tampon de réaction et la caspase-3 pour obtenir des échantillons de substrats réactifs positifs et négatifs. Pour les échantillons négatifs, ajouter un tampon de réaction, 25 pg de protéines, 0,4 pi de Ac-DEVD-CHO 800 uM et 0,8 pi d'Ac-DEVD-AMC 10 mM. Pour les échantillons positifs, ajouter 25 pg de protéine de tampon de réaction et 0,8 ul d'Ac-DEVD-AMC 10 mM. Traiter tous les échantillons négatifs et positifs en trois exemplaires. Compléter le volume final de chaque échantillon jusqu'à 200 pi en ajoutant un tampon de réaction.
8. Produire des témoins négatifs en ajoutant 188,7 pi de tampon de réaction de 0,5 pi de Ac-DEVD-CHO 800 uM, 0,8 ul Ac-DEVD-AMC 10 mM et 10 pi de tampon de lyse. Pour les témoins positifs, ajouter 189,2 pi de tampon de réaction, 0,8 pi d'Ac-DEVD-AMC 10 mM et 10 pi de tampon de lyse.
9. Incuber les échantillons etcontrôles dans l'obscurité pendant 3 heures à 37 ^o C.
10. Arrêter la réaction avec 600 ul de glycine 0,4 M et de NaOH 0,4 M (pH 10) à chaque échantillon et de contrôle.
11. Quantifier la fluorescence par spectrofluorométrie au excitation longueur d'onde de 365 nm de longueur d'onde et l'émission de 465 nm. Ajouter 2 ml d'eau distillée à une réaction dans la cuve de verre. Lire contrôles et les échantillons pendant 10 secondes avec 1 point à chaque sec.
12. Quantifier l'activité spécifique dans chaque échantillon: ((fluorescence des échantillons négatifs moins de fluorescence d'échantillons positifs) x volume de 2,8 ml) divisé par (le temps d'incubation de 3 heures x quantité de protéine 25 mg).

Representative Results

L'amygdale a été isolé dans 8 imposture (contrôle) et 8 MI rats trois jours après l'induction du protocole ischémie / reperfusion. Activité caspase-3 a été mesurée dans ce tissu au moyen d'un fluorochrome qui peut être clivée par la caspase-3 active et détectée par spectrofluorimétrie. Des mesures positives et négatives (voir les étapes 3.11, 3.12 et 3.16) ont été effectuées en triple exemplaire et mesurés pendant 10 sec, avec 1 point à chaque sec. Les différences entre les témoins positifs et négatifs ont été calculées et la moyenne des différences pour tous les tissus factice exécuté lors de cette expérience a été fixé à 100%. Les résultats de rats ont été mis à l'échelle MI selon cette référence et La Figure 1 illustre les résultats définitifs: il indique une activité significativement plus élevée chez le rat par rapport à MI fictive (p <0,05).

Figure 1. Caspase-3activité dans l'amygdale des rats MI, exprimée en pourcentage de l'activité moyenne dans les contrôles de Sham, réglé à 100% (8 rats par groupe). * Indique importante différence entre groupe (p <0,05). Les données sont exprimées en moyenne ± SEM.

Discussion

Notre expérience avec ce protocole au cours des 10 dernières années a conduit à l'identification des questions méthodologiques critiques. Tout d'abord, la dissection rapide du cerveau dans une boîte de Pétri sur de la glace pilée est important de maintenir la qualité de la préparation. Deuxièmement, il faut être conscient que la sonication de tissu est plus court pour l'amygdale cérébrale par rapport à d'autres types de tissus, comme le cœur (10 sec) ou les reins (20 sec). Troisièmement, un grand soin doit être pris pour mélanger soigneusement le substrat avant de l'ajouter aux échantillons. Nous avons rencontré des signaux variables lorsque la séquence de mélange était inadéquate. Quatrièmement, pas de bulles doivent être présents dans la cellule en quartz lors de la lecture des échantillons. Dans le cas contraire, le signal pourrait être modifiée.

Nous avons fait un changement au cours des dernières années pour accroître la reproductibilité des résultats: l'augmentation du volume de substrat pour éviter volume inférieur à 1 pl. Cependant, de petites variations peuvent se produire entre les essais successifs, et au moins 3 échantillons de contrôle doivent être utilisées pourle contrôle des variations. Mesures de fluorescence de ces contrôles sont en moyenne et la moyenne est fixée à 100%. Des mesures de fluorescence dans les échantillons expérimentaux sont transformées en pour cent des échantillons de contrôle.

Une autre limite de cette technique est que seule une partie de tissu est utilisé et, par conséquent, l'activité caspase-3 pourrait être sous-estimée. En effet, la fenêtre de temps de l'apoptose est courte dans une cellule donnée et peut être manquée, même si elle se produit dans des zones voisines au moment de l'échantillonnage ^1,4,15. L'inverse est également possible: l'apoptose pourrait être particulièrement intense dans les parties de tissus, ce qui entraîne une surestimation de l'activité caspase-3. Nous recommandons l'utilisation de tissus restants (amygdale) pour des techniques complémentaires, tels que des essais TUNEL ou rapport Bax / Bcl-2 (voir Introduction).

Spectrofluorométrie a au moins deux avantages sur Western blot. Tout d'abord, il génère directement des données quantitatives. Deuxièmement, il mesure une enzymatiquectivité elle-même plutôt que la protéine ou l'ARN expression, qui peut être sans rapport, et il est connu que l'expression de protéine peut être accrue sans modification de l'activité enzymatique. En outre, spectrofluorimétrie peut être effectuée sur d'autres tissus ou d'espèces différentes et peut être ajusté à d'autres sous-types de caspases, avec différents substrats, de sorte que la comparaison peut être effectuée sans danger.

En conclusion, ce document démontre l'utilisation de spectrofluorométrie pour mesurer activité caspase-3 dans l'amygdale, fournissant la preuve que l'apoptose se produit dans cette région du système limbique 3 jours après un IM.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectroflurometer	Photon technology Instrument (now Horiba)	Ratiomaster M-40	with DeltaRAM  Random Access Monochromator
Respirator	Harvard apparatus	683	small animal ventilation
Glass cuvette	NSG precision cells	3G10	Optical Glass (340-2,500 nm) 10 mm path
Sonicator	Cole Parmer	4710  series
Spectrometer	Varian	Cary 50 Bio