Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.
심근 경색 (MI)는 생리적 및 행동 수준에서 극적인 중장기 결과를 초래하지만, 관련된 메카니즘은 여전히 불명확하다. 우리 연구소는 장애 심장 기능, 변연계의 신경 세포 손실,인지 결핍과 우울증의 행동 징후를 표시 MI 후 증후군의 쥐 모델을 개발했다. MI 후 삼일에 뾰족 – 신경 세포 수준에서 카스파 제 -3 활성화는 편도와 같은 다른 변연 지역에서 포스트 MI의 세포 사멸을 매개. 인지 및 행동 장애는 2-3주에게 포스트 MI를 표시하고 이러한 카스파 제 -3 활성의 조치를 통계적으로 상관 관계. 여기에 설명 된 프로토콜은 MI를 유도 편도 조직을 수집하고 spectrofluorometry를 사용 카스파 제 -3 활성을 측정하기 위해 사용된다. MI를 유도하기 위해, 하행 관상 동맥을 40 분간 폐색된다. 래트를 희생하고 편도선은 RAPI 격리 : 카스파 제 -3 활성의 평가를위한 프로토콜 3 일 후에 시작 MI뇌에서 DLY. 샘플은 신속하게 액체 질소에 냉동과 실제 분석 할 때까지 -80 ℃에서 보관됩니다. 카스파 제 -3 활성을 평가하기 위해 수행 spectrofluorometry 기법에 의해 측정 될 수있는 형광 화합물을 방출하여 카스파 제 -3 기질 (DEVD-AMC)의 절단에 기초한다. 방법론은 정량적 재현성하지만 필수 장비는 고가이고 샘플을 정량화하기위한 절차는 시간을 소모한다. 이 기술은 심장, 신장 같은 다른 조직에 적용될 수있다. DEVD-AMC 다른 카스파 제의 활성을 측정하기 위하여 다른 기판으로 대체 될 수있다.
카스파 또는 시스테인 의존 아스 파르 테이트 지시 단백질 분해 효소는 다양한 항상성 processess 1에 관여하는 효소의 가족입니다. 카스파는 크게 아폽토시스 또는 염증의 역할에 따라 분류 될 수있다. 카스파-1, -4, -5 -12가 세포 사멸에 종사하는 사람들이있을 수있는 반면 염증에 관여하는 하위 분류 기자 카스파로 (카스파 제 8 -9)와 사형 집행 인의 카스파 (카스파 제 -3, -6 및 -7 ).
심근 경색 (MI) 또는 뇌허혈 후 관찰 카스파는 주로 세포 사멸이 과도 할 수있다 질환에 많은 병리에 중요한 역할을한다.
우리의 실험에 사용 된 후 MI 증후군의 쥐 모델에서, 카스파 제 -3은 심근 2뿐만 아니라 분위기 3-6과 감정의 제어에 연루되는 변연계에서뿐만 아니라 활성화되어 있음을 수립한다. 또한, 카스파 제 -3은 상이한 영역에서 활성화되는 것을 알 수있다변연계의 같은 편도체와 해마, 허혈성 모욕 4 후 3 일 주변이 활성화 피크로. 흥미롭게도, 카스파 제 -3 활성은 MI 후 행동 장애와 상관 관계 및 약리 및 영양 개입을 통해 감쇠는 카스파 제 -3 및 사후 MI 우울증 7-12 사이의 가능한 링크를 제안,이 부상을 줄일 수 있습니다.
카스파 제 -3 활성은 다양한 기법에 의해 측정 될 수있다. 웨스턴 블 롯팅은 카스파의 특성을 파악한 후 효소 활성 효소뿐만 아니라 프로 효소 형태를 검출 할 수있다. 웨스턴 블 롯팅은, 그러나, 반 정량적이고, 작은 변화는 약한 신호 – 대 – 잡음 비율 (13)을 통해 손실 될 수있다. 더 나은 기술이 형광 화합물을 해제하고 spectrofluorometry 의해 측정 될 수 카스파 제 (3)에 의한 기판 (DEVD-AMC)의 절단에 기초한다. 카스파 제 -3 활성화는 세포 사멸의 신뢰할 수있는 마커입니다. 세포 사멸의 CA의 측정N의 발생 시간 윈도우가 짧기 때문에 불안정하고, 인접 셀은 세포 자멸 소체 세포 또는 14 phagocytize 있었다. 아폽토시스는 또한 이러한 백스 / 같이 사멸 시그널링 캐스케이드 (6), 또는 항 – 세포 사멸 / 프로 단백질의 비율에 의한 DNA 단편화를 검출하는 그러한 터미널 데 옥시 뉴 클레오 타이 딜 트랜스퍼 dUTP 닉 엔드 (nick end) 표지화 (TUNEL) 분석과 같은 다른 기술들에 의해 확인 될 수있다 BCL2 6.
지난 10 년 동안이 프로토콜을 사용하여 우리의 경험은 중요한 방법 론적 문제의 식별되었다. 첫째, 짓 눌린 된 얼음에 페트리 접시에 빠른 뇌 해부 준비 품질을 유지하는 것이 중요하다. 둘째, 조직은 초음파 등의 심장 (10 초)과 같은 조직의 유형, 또는 신장 (20 초)에 비해 뇌에 대한 편도체 짧다고 실현되어야한다. 셋째, 큰 관심을 신중 샘플에 추가하기 전에, 기판을 혼합주의해야한다. 혼합 순서가 불충분 한 때 우리는 변수 신호가 발생했습니다. 샘플을 판독 할 때 제, 기포는 석영 셀에 존재할 수 없어야한다. 그렇지 않으면, 신호가 변경 될 수있다.
1 μL 미만의 체적을 피하기 위해 기판 부피가 증가 : 우리는 결과의 재현성을 높이기 위해 지난 몇 년 동안 변화했다. 여전히 작은 변화는 연속 분석법 사이에서 발생할 수 있고, 적어도 3 개의 시료를 제어하는 데 사용되어야변화를 제어 할 수 있습니다. 이러한 컨트롤 형광 측정 평균화하고, 평균 100 %로 설정된다. 실험 샘플의 형광 측정은 대조 시료의 퍼센트로 변환된다.
기술의 또 다른 한계는 따라서, 카스파 제 -3 활성을 과소 평가 될 수있는 조직의 일부만이 사용되도록하고. 실제로, 아폽토시스의 시간 윈도우는 임의의 주어진 셀 짧게 중이며 1,4,15 샘플링시의 인접 지역에서 발생하더라도 누락 될 수있다. 반대의 경우도 가능하다 : 세포 사멸은 카스파 제 -3 활동의 과대 평가 결과, 조직의 부분에서 특히 강렬한 될 수 있습니다. 우리는 TUNEL 분석 또는 Bax의 /에서 Bcl2 비율 (소개를 참조하십시오)와 같은 보완적인 기술에 대한 잔여 조직 (편도)의 사용을 권장합니다.
Spectrofluorometry 웨스턴 블로 팅을 통해 적어도 두 가지 장점이 있습니다. 첫째, 직접 정량 데이터를 생성한다. 둘째, 효소를 측정ctivity 자체보다는 무관 할 수 있으며,이 단백질의 발현은 효소 활성의 변화없이 증가 할 수 있음을 공지 된 단백질 또는 RNA 발현. 또한, spectrofluorometry는 다른 조직 또는 다른 동물 종으로 수행 될 수 있고, 다른 기판에, 다른 카스파 아형에 대해 조절 될 수 있으므로, 그 비교는 안전 할 수있다.
결론적으로,이 문서는 세포 사멸 3 일 심근 경색 후 변연계의이 지역에서 발생하는 증거를 제공하는 편도체에서 카스파 제 -3 활성을 측정하는 spectrofluorometry을 사용하는 방법을 보여줍니다.
The authors have nothing to disclose.
. 상테 -이 작품은 자연 과학 및 캐나다 김 길버트 공학 연구위원회에서 보조금에 의해 지원되었다 퐁 드 라 공들인 뒤 퀘벡에서 재학를 보유하고있다.
Spectroflurometer | Photon technology Instrument (now Horiba) | Ratiomaster M-40 | with DeltaRAM Random Access Monochromator |
Respirator | Harvard apparatus | 683 | small animal ventilation |
Glass cuvette | NSG precision cells | 3G10 | Optical Glass (340-2,500nm) 10 mm path |
Sonicator | Cole Parmer | 4710 series | |
Spectrometer | Varian | Cary 50 Bio |