Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.
Hjerteinfarkt (MI) har dramatiske midt-og langsiktige konsekvenser på de fysiologiske og atferdsmessige nivåer, men mekanismene som er involvert er fortsatt uklart. Vårt laboratorium har utviklet en rotte modell av post-MI syndrom som viser nedsatt hjertefunksjon, neuronal tap i det limbiske system, kognitiv svikt og atferdsmessige tegn på depresjon. På den neuronale nivå, medierer caspase-3 aktivering post-MI apoptose i forskjellige limbiske områder, slik som amygdala – med en topp på 3 dager post-MI. Kognitive og atferdsvansker vises 2-3 uker etter MI og disse korrelerer statistisk med tiltak av caspase-3-aktivitet. Protokollen er beskrevet her blir brukt til å indusere MI, samle amygdala vev og måle caspase-3-aktivitet ved hjelp spectrofluorometry. For å indusere MI, blir den nedadstigende koronararterie okkludert i 40 min. Protokollen for evaluering av caspase-3 aktivering begynner 3 dager etter MI: rottene avlivet og amygdala isolert rapiDLY fra hjernen. Prøver blir raskt frosset i flytende nitrogen og oppbevart ved -80 ° C inntil selve analysen. Teknikken utført for å vurdere kaspase-3 aktivering er basert på spaltning av et substrat (DEVD-AMC) av caspase-3, som frigjør en fluorogen forbindelse som kan måles ved spectrofluorometry. Metodikken er kvantitativ og reproduserbar, men utstyret som kreves er dyrt og fremgangsmåten for kvantifisering av prøvene er tidkrevende. Denne teknikken kan brukes til andre vev, slik som hjerte og nyrer. DEVD-AMC kan erstattes av andre substrater for å måle aktiviteten av andre caspaser.
Kaspaser eller Cysteine-avhengige aspartat-rettet proteaser er en familie av enzymer som er involvert i ulike homeostase processess en. Kaspaser kan grovt klassifiseres i henhold til deres roller i apoptose eller betennelse. Caspase-1, -4, -5 og -12 er involvert i betennelsen, mens de som er engasjert i apoptose kan være under klassifisert som initiativtaker kaspaser (caspase-8 og -9) og bøddel kaspaser (caspase-3, -6 og -7 ).
Kaspaser spille viktige roller i mange sykdommer, hovedsakelig i lidelser hvor apoptose kan være overdreven, som observert etter hjerteinfarkt (MI) eller cerebral iskemi.
I rottemodellen av post-MI syndrom anvendt i vårt laboratorium, blir det fastslått at caspase-3 aktiveres ikke bare i myokard, men også to i det limbiske system, som er implisert i kontrollen av humør og følelser 3-6. Det er også sett at caspase-3 aktiveres i forskjellige regionerav det limbiske system, slik som amygdala og hippocampus, og denne aktiverings toppene rundt 3 dager etter iskemisk fornærmelse fire. Interessant, korrelerer caspase-3-aktivitet med post-MI atferdsvansker, og dens demping gjennom farmakologiske og ernæringsmessige intervensjoner reduserer disse skadene, noe som tyder på en mulig sammenheng mellom caspase-3 og post-MI depresjon 7-12.
Caspase-3 aktivering kan måles ved hjelp av forskjellige teknikker. Western blotting konstaterer de enzymatiske egenskaper av kaspasene, og kan detektere aktive enzymer, så vel som deres pro-enzym former. Western-blotting, imidlertid, er semi-kvantitativ, og små variasjoner kan gå tapt gjennom svake signal-støy-forhold 13. En bedre metode er basert på spaltning av et substrat (DEVD-AMC) av caspase-3 som frigjør en fluorogen forbindelse, og kan måles ved spectrofluorometry. Caspase-3 aktivering er en pålitelig markør for apoptose. Måling av apoptose can være ustabil fordi tidsvinduet for forekomst er kort, og nabocellene kunne phagocytize apoptotiske legemer eller celler 14. Apoptose kan ytterligere bekreftet av andre teknikker, slik som terminal deoksynukleotidyltransferase dUTP Nick endemerking (TUNEL) assay, som detekterer DNA-fragmentering som følge av apoptotiske signalkaskader 6, eller forholdet mellom pro- / anti-apoptotiske proteiner, så som Bax / BCL2 6.
Vår erfaring med denne protokollen i løpet av de siste 10 årene ført til identifisering av kritiske metodiske problemstillinger. For det første er hurtig hjerne disseksjon i en petriskål på knust is viktig for å opprettholde forberedelse kvalitet. For det andre må man være klar over at vevet sonication er kortere for cerebral amygdala sammenlignet med andre typer vev, for eksempel i hjertet (10 sek) eller nyrene (20 sek). Tredje, stor forsiktighet bør tas for å nøye blande underlaget før du legger det til prøvene. Vi møtte variable signaler når blande sekvensen var utilstrekkelig. For det fjerde bør ingen bobler være til stede i kvartscelle ved lesing av prøvene. Ellers kan signalet endres.
Vi har gjort en endring i de siste årene for å øke reproduserbarheten av resultatene: øke substrat volum for å unngå volum mindre enn 1 mL. Likevel kan små variasjoner forekomme mellom suksessive analyser, og minst 3 kontrollprøver skal brukes til åkontroll for variasjoner. Fluorescens tiltak av disse kontrollene er gjennomsnitt, og gjennomsnittlig er satt til 100%. Fluorescens tiltak i eksperimentelle prøvene blir forvandlet i prosent av kontrollprøver.
En annen begrensning av teknikken er at bare en del av vev blir brukt, og derfor kan caspase-3 aktivitet undervurderes. Faktisk, er den tidsvindu av apoptose kort i en gitt celle, og kan bli savnet, selv om det forekommer i naboområder på tidspunktet for prøvetaking 1,4,15. Det omvendte er også mulig: apoptose kan være særlig intens i deler av vev, noe som resulterer i overestimering av caspase-3 aktivitet. Vi anbefaler bruk av gjenværende vev (amygdala) for komplementære teknikker, for eksempel tunel analyser eller Bax / BCL2 ratio (se Innledning).
Spectrofluorometry har minst to fordeler i forhold til Western blotting. Først genererer den direkte kvantitative data. For det andre, måler det enzymatisk enctivity selv heller enn proteiner eller RNA-ekspresjon, noe som kan være irrelevant, og det er kjent at protein ekspresjon kan økes uten noen endring i enzymatisk aktivitet. Videre kan spectrofluorometry utføres på andre vev eller med forskjellige dyrearter, og kan justeres til andre kaspase subtyper, med forskjellige substrater, slik at trygge sammenligninger kan gjøres.
Som konklusjon, viser dette dokumentet ved bruk av spectrofluorometry å måle caspase-3 aktivitet i amygdala, gir bevis for at apoptose oppstår i denne region av det limbiske system 3 dager etter MI.
The authors have nothing to disclose.
. Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning fra naturvitenskap og Engineering Research Council of Canada Kim Gilbert har en studieplass fra Fonds de la recherche du Québec – Santé.
Spectroflurometer | Photon technology Instrument (now Horiba) | Ratiomaster M-40 | with DeltaRAM Random Access Monochromator |
Respirator | Harvard apparatus | 683 | small animal ventilation |
Glass cuvette | NSG precision cells | 3G10 | Optical Glass (340-2,500nm) 10 mm path |
Sonicator | Cole Parmer | 4710 series | |
Spectrometer | Varian | Cary 50 Bio |