Abstract
Förståelse tumör clonality är avgörande för att förstå de mekanismer som är involverade i tumörbildning och sjukdomsprogress. Dessutom kan förstå de klonala sammansättning förändringar som sker inom en tumör som svar på vissa mikromiljön eller behandlingar leda till utformningen av mer sofistikerade och effektiva metoder för att utrota tumörceller. Har dock spåra tumör klonala delpopulationer varit utmanande på grund av bristen på urskiljbara markörer. För att lösa detta problem, var en VDJ-punkter protokoll skapas för att spåra klonala evolution mönster diffusa storcelliga B-cellslymfom (DLBCL) återfall genom att utnyttja VDJ rekombination och somatisk hypermutation (SHM), två unika egenskaperna hos B-cellslymfom.
I detta protokoll, var nästa generations sekvensering (NGS) bibliotek med indexerings potential tillverkad av förstärkt rearrangerade immunoglobulin tung kedja (IgH) VDJ regionen från par av primär diagnos och återfall DLBCL samples. I genomsnitt mer än en halv miljon VDJ-sekvenser per prov erhölls efter sekvensering, som innehåller både VDJ rearrangemang och SHM information. Dessutom har anpassade bioinformatik rörledningar utvecklats till fullo utnyttja sekvensinformation för karakterisering av IgH-VDJ repertoar inom dessa prover. Dessutom tillåter rörledningen återuppbyggnad och jämförelse av klon arkitektur enskilda tumörer, vilket möjliggör en undersökning av klon heterogenitet inom diagnos tumörer och avdrag för klonala evolution mönster mellan diagnos och återfall tumör par. Vid tillämpning av denna analys till flera diagnos återfall par, avslöjade vi nyckel bevis för att flera distinkta tumör evolutionära mönster kan leda till DLBCL återfall. Dessutom kan utökas detta synsätt i andra kliniska aspekter, såsom identifiering av minimal kvarvarande sjukdom, övervakning återfall framsteg och behandlingssvar, och utredning av immun repertoares i icke-lymfom sammanhang.
Introduction
Cancer är en klonal sjukdom. Sedan trettio år sedan när Peter C. Nowell föreslog cancer klon evolution modell 1, har många studier försökt dissekera klonala populationer inom tumörprover och rekonstruera klonal expansion och evolution mönster som ligger till grund för tumörbildning processen 2. Nyligen har hela-genomet sekvensering möjlig utredarna att ta ett djupt titt på klon heterogenitet och evolution 3,4. Men på grund av bristen på lätthanterliga markörer i många celltyper, är det svårt att sluta sig till den exakta klonal arkitektur och utvecklingsväg. Lyckligtvis finns det en naturlig clonality markör i mogna B-celler från vilka många lymfoida maligniteter, inklusive DLBCL, har sitt ursprung. Som svar på antigenstimulering, kan varje B-cell bildar en enda produktiv IgH VDJ-sekvens genom att gå en Vh (variabel), en D (mångfald) och JH (sammanfogning) segment tillsammans från en stor pool av dessa segment. Under denna process, kan små delar av den ursprungliga sekvensen tas bort och ytterligare icke-styrd nukleotider får tillsättas för att skapa en unik VDJ ombildning. Denna specifika VDJ ombildning kan ärvas i alla avkomman av detta B-cell, därför märka individuella mogna B-cellen och dess avkomma 5. Dessutom förekommer SHM på rekombinerade VDJ-sekvenser i den efterföljande germinal center (GC) reaktion att införa ytterligare mutationer för utbyggnad av antikroppen poolen och förbättring av antikroppsaffinitet 6. Därför, genom att jämföra och kontrastera VDJ och SHM mönster lymfom prover som har genomgått dessa processer inom tumör heterogenitet kan avgränsas och klon evolution väg av sjukdomen kan härledas.
Tidigare kunde VDJ ombildning och SHM identifieras genom PCR förstärka de rekombinerade regionerna kloning av PCR-produkter, och därefter Sanger-sekvensering för att erhålla sekvensinformation. Detta tillvägagångssätt is låg genomströmning och lågt utbyte, hämta endast en mycket liten del av hela den rekombinerade VDJ-repertoar, och hindrar karakteriseringen av den totala representationen av den klonala populationen inom ett givet prov. En modifierad metod skapades genom att generera NGS indexerade sekvense bibliotek från VDJ PCR-produkter och utför PE 2x150 bp sekvensering för att få mer än en halv miljon rekombinerade VDJ-sekvenser per prov. Dessutom har en egen pipeline utvecklats för att utföra kvalitetskontroll (QC), justera, filter VDJ sekvense läser att identifiera rearrangemang och SHMS varje läsning, och utföra fylogenetiska analys av klon arkitektur varje prov. Dessutom har en ny metod har upprättats för att ytterligare karakterisera klonala evolution mönster för prover som tagits vid olika sjukdomsstadier.
Vi har tillämpat denna teknik för att DLBCL patientprover. DLBCL är en aggressiv form av non-Hodgkin lymfom med täta återfall i upp till en eIRD av patienterna 7. DLBCL återfall inträffar normalt tidigt, inom två till tre år av den första diagnosen, även om vissa uppstår efter 5 år 8. Prognos för återfall patienter är dålig, med endast 10% att uppnå 3 års progressionsfri överlevnad på grund av begränsade behandlingsalternativ. Detta är grunden till det akuta behovet av nya metoder för att behandla DLBCL återfall 9,10. Men molekylära mekanismer i samband med DLBCL återfall är fortfarande till stor del okända. I synnerhet den roll som klonal heterogenitet vid diagnos och klon utveckling under DLBCL återfall utveckling är för närvarande uncharacterized, vilket gör det svårt att definiera en korrekt och användbar biomarkör för att förutsäga återfall. För att ta itu med dessa frågor, tillämpade vi vår VDJ-sekvense strategi på flera par av matchade primär diagnos-återfall DLBCL provpar. Två distinkta klon evolutionära scenarier för återfall uppstått ur jämförelsen av de klonala arkitekturer mellan diagnos och återfall samples som föreslår flera molekylära mekanismer kan vara inblandade i DLBCL återfall.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. VDJ Amplifiering
1,1) DNA-extraktion från tumörprover
- Extrahera DNA från tunna sektioner (10-20 pm) av frysta OCT inbäddade normala eller maligna vävnader.
- Smälta 10-30 tunna sektioner av inbäddad vävnad skärs av en kryostat mikrotom i 4 ml Nucleic lysbuffert (0,0075 M Tris-HCl, pH 8,2; 0,3 M NaCl; 0,002 M Na-2-EDTA) med proteinas K (0,5 mg / ml, slutkoncentration ) och 0,625% SDS i en 15 ml centrifugrör i en 37 ° C vattenbad över natt.
- Tillsätt 1 ml mättad NaCl (5 M) till digereringsblandningen och skaka kraftigt i 15 sek.
- Centrifugera vid 1100 xg under 15 min vid rumstemperatur.
- Överför supernatanten till ett nytt 15 ml centrifugrör och tillsätt två volymer 100% etanol.
- Blanda genom att vända röret 6-8 gånger. Centrifugera vid 5000 xg under 60 min vid 4 ° C för uppsamling av den utfällda DNA.
- Tvätta DNA-pelleten två gånger med 70% etanol. Centrifuge vid 5000 xg under 15 minuter varje gång för att samla pelleten.
- Upplös DNA i 100-400 | il TE-buffert vid rumstemperatur på en skakare över natten. DNA Utbytet är 5 till 200 | j, g (slutlig koncentration mellan 50 till 500 ng / ul) beroende på storleken av vävnaden
- Extrahera DNA från tunna sektioner (10-20 pm) av formalinfixerade, paraffin- inbäddad (FFPE) normal eller malign vävnad.
- Inkubera paraffinsnitt i 1 ml xylen två gånger vid rumstemperatur under 10 minuter varje gång i en 1,5 ml mikrocentrifugröret för att de-paraffinize. Samla vävnadssnitt genom centrifugering vid 13 tusen xg under 5 min vid rumstemperatur.
- Inkubera sektioner i en ml 100% etanol två gånger vid rumstemperatur, 10 minuter varje gång för att avlägsna xylener rest. Samla vävnadssnitt genom centrifugering vid 13 tusen xg under 5 min vid rumstemperatur. Paraffinet är helt upplöst vid denna punkt och endast vävnadssnittet återstår.
- Lufttorka avsnitten på rummet temperature under 10-15 min.
- Gör en 0,5 mg / ml proteinas K-lösning med 1x PCR-buffert (utspädd från 10 x PCR-buffert med nukleasfritt vatten). Till proteinas K-lösning till proverna i en slutlig volym av 50 till 100 | il och inkubera över natten vid 37 ° C.
- Värm proverna vid 95 ° C under 10 minuter för att inaktivera proteinas K.
Obs: I detta steg, är prov-DNA löst i PCR-buffert och kan användas i steg 1,2 och 1,3 direkt. DNA Utbytet är 0,5 till 20 ^ g (slutkoncentration mellan 10-200 ng / ul) beroende på storleken av vävnaden.
1.2) Bedömning DNA Kvalitet
- Blanda 0,25 il Taq DNA-polymeras med 45 il huvudblandning från den kommersiella stege kit i en PCR-rör.
- Tillsätt 5 pl DNA framställt från 1.1.1.7 eller 1.1.2.5 i PCR-röret och blanda väl genom att pipettera upp och ned under minst 5 gånger.
- Använd följande villkor för att amplifiera DNA: 95 ° C under7 min; följt av 35 cykler av 45 sek vid 95 ° C, 45 sekunder vid 60 ° C och 90 sekunder vid 72 ° C; sedan 72 ° C under 10 minuter och håll vid 15 ° C.
- Bered en 2% agarosgel i TBE (Tris / borat / EDTA).
- Blanda 20 pl PCR-reaktion med 4 | il 6x laddningsfärg, och laddar in en två% agarosgel.
- Fläck agarosgel med 0,5 pg / ml etidiumbromid lösning och detektera PCR-produkter med en gel föreställa systemet. Obs: de prover som ger 5 PCR-produkter på storlekar 100, 200, 300, 400 och 600 bp kommer att fortsätta att generera VDJ amplikoner.
VARNING: Etidiumbromid är en potent mutagen. Vänligen hanteras med yttersta försiktighet genom att bära skyddande redskap, det vill säga handskar, och avyttra till särskilda behållare per institutionens riktlinjer.
1,3) VDJ-PCR
1.3.1) Amplify rekombinerades IgH VDJ Segment från Framework Region 1 (IgVHFR1)
- Blanda 45 pl Master Mix från röretikettenceras som "Mix 2" av en kommersiell somatisk IGH Hypermutation Analys för Gel Detection kit, 0,25 | il Taq DNA-polymeras, och 5 | il prov-DNA framställd från 1.1.1.7 eller 1.1.2.5 i ett PCR-rör.
- Använd följande villkor för att amplifiera DNA: 95 ° C i 7 minuter; följt av 35 cykler av 45 sek vid 95 ° C, 45 sekunder vid 60 ° C och 90 sekunder vid 72 ° C; sedan 72 ° C under 10 minuter och håll vid 15 ° C.
- Lösa hela PCR-produkten i en 2% agarosgel genom elektrofores.
- Fläck agarosgel med 0,5 pg / ml etidiumbromid lösning och detektera PCR-produkter med en gel avbildningssystem. En monoklonal amplikon förväntas med storleksintervallet 310-380 bp.
- Skära geldelen innehållande den monoklonala amplikon mellan 310-380 bp.
- Rena DNA från exciderad under användning av en standard-Gel Extraction Kit enligt tillverkarens protokoll. Obs: för prover som FR1 fragment kan erhållas, finns det ingen anledning att tydligt IGVHFR2 och IgVHFR3.
1.3.2) Amplify rekombinerades IgH VDJ Segment från Framework Region 2 (IgVHFR2)
- Blanda 45 pl Master Mix från röret märkt som "rör B" av en kommersiell IGH Gene Clonality Analys för Gel Detection kit, 0,25 | il Taq DNA-polymeras, och 5 | il prov-DNA framställd från 1.1.1.7 eller 1.1.2.5 i ett PCR-rör .
- Använd följande villkor för att amplifiera DNA: 95 ° C i 7 minuter; följt av 35 cykler av 45 sek vid 95 ° C, 45 sekunder vid 60 ° C och 90 sekunder vid 72 ° C; sedan 72 ° C under 10 minuter och låt stå i 15 ° C.
- Lösa hela PCR-produkten i en 2% agarosgel genom elektrofores.
- Visualisera PCR-produkt (er) genom 0,5 | ig / ml etidiumbromid färgning. En monoklonal amplikon kan observeras inom storleksområdet 250 till 295 bp.
- Skära geldelen innehållande den monoklonala amplikon mellan 250-295 bp.
- Rena DNA från utskurna gel med en vanlig Gel Extractjon Sats enligt tillverkarens protokoll.
1.4) Optimera VDJ PCR
- Använd följande modifierade PCR-betingelser för att amplifiera IgVHFR1 och IgVHFR2 användning suboptimal DNA: 95 ° C under 7 minuter, 40 cykler av 95 ° C under 60 sek, 60 ° C under 60 sek, och 72 ° C under 90 sek, slutlig förlängning vid 72 ° C under 10 minuter.
2. VDJ Amplicon Library Förberedelser och sekvensering
2.1) Bibliotek Förberedelse
2.1.1) End-reparation
- Överför VDJ PCR-produkten från 1,3 till ett PCR-rör och tillsätt resuspensionsbuffert från DNA Provberedning Kit för att få upp volymen till 60 pl.
- Tillsätt 40 pl av End Reparation Mix från DNA Provberedning Kit och blanda väl.
- Inkubera reaktionen vid 30 ° C under 30 min i en förvärmd termocykler (30 ° C) med en i förväg uppvärmt lock vid 100 ° C.
- Blanda 136 pl magnetiska pärlor och 24 pl PCR grade vattnet först i en 1,5 ml rör, för över hela slutreparationsreaktion från 2.1.1.3 in i 1,5 ml rör och blanda väl med lösningen pärlor.
- Placera rören på en magnetisk stå i 2 min för att tillåta separation av pärlorna från lösningen. Aspirera supernatanten och tvätta pärlorna med 80% nya förberedda EtOH två gånger medan röret är på den magnetiska monter.
- Aspirera etanollösningen helt och låta pärlorna till lufttorka under 15 min vid rumstemperatur under 15 minuter.
- Ta röret utanför de magnetiska stativ och återsuspendera pärlor i 17,5 ul resuspensionsbuffert.
- Placera rören tillbaka på den magnetiska stativ för 2 minuter för att separera pärlor från resuspensionsbuffert. Ta bort resuspensionsbuffert (End-reparationsprodukten suspenderas i resuspensionsbuffert nu) i en ren PCR-rör.
2.1.2) A-tailing
- Lägg 12,5 pl A-tailing blandningen i PCR-rör innehållande slut reparation produkt och blanda väl. Inkubera PCR-rör vid 37 ° C under 30 minuter i en förvärmd termo (37 ° C) med en förvärmd lock vid 100 ° C.
2.1.3) Adaptor Ligering
- Tillsätt 2,5 pl resuspensionsbuffert, 2,5 pl ligeringsblandning och 2,5 l DNA-adapter Index i A-svans reaktion.
- Inkubera reaktionen vid 30 ° C under 30 minl i en förvärmd termocykler (30 ° C) med en i förväg uppvärmt lock vid 100 ° C.
- Tillsätt 5 pl Stop ligeringsbuffert i varje reaktion och blanda väl.
- Blanda 42,5 il väl blandade magnetiska pärlor för att rengöra reaktion efter steg 2.1.1.5 till 2.1.1.8. Lägg 50 pl resuspensionsbuffert att eluera adaptern-ligerade produkten.
- Rengör adaptern-ligerade produkten för andra gången med hjälp av 50 pl väl blandade AMPure XP pärlor, och eluera produkten i 25 ul resuspensionsbuffert i en ren PCR-rör.
2.1.4) Amplify DNA-fragment
- Tillsätt 5 pl PCR Primer Cocktail och 25 pl PCR Master Mix till PCR-rör innehållande adapter-ligerade produkten och blanda väl.
- Utför förstärkning i en förprogrammerad termo med följande villkor: 98 ° C under 30 sekunder; 10 cykler av 98 ° C under 10 sek, 60 ° C under 30 sek och 72 ° C under 30 sek; sedan 72 ° C under 5 minuter och håll vid 10 ° C.
- Städa upp reaktionen genom användning av 50 | j, l väl blandade magnetiska pärlor, och eluera den slutliga produkten i 30 | il resuspensionsbuffert.
2.1.5) Bibliotek Validation
- Kvantifiera den slutliga produkten med en fluorometer med användning tillverkarens protokoll. Slutlig bibliotekskoncentrationen är mellan 2,5 till 20 ng / ul.
- Bedöma kvaliteten på slutprodukten genom användning av en analytisk instrument med hög känslighet DNA-chip enligt tillverkarens protokoll. Räkna med ett enda band med den förväntade storleken för antingen IGVHFR1, IGVHFR2 eller IGVHFR3. Digxpected storlek på biblioteket produkten är lika med storleken på den ursprungliga VDJ amplicon plus storleken på adaptrar (~ 125 bp).
2.2) VDJ-PCR Library Pooling och sekvensering
- Beräkna molariteten för varje bibliotek fraktion med användning av följande formel: nM = [(ng / 1000) / kp * 660] x 10 9 där ng är koncentrationen av VDJ-PCR-bibliotek som uppmätts i steg 2.1.5.1 och bp är toppen Storleken på VDJ-PCR bibliotek mätt i steg 2.1.5.2.
- Späd biblioteket till 2 nM (10 | j, l totalt) med DNas-fritt vatten.
- Kombinera 10 il av de utspädda 2 biblioteken nM ihop till en 1,5 ml rör.
- Tillsätt en lika volym av PhiX spike-kontroll in i 1,5 ml rör.
- Fyll poolen på 7:00 koncentration på en flödescellen.
- Sekvensera biblioteken med hjälp av en parade end 150 cykel sequencer enligt tillverkarens protokoll.
3. Data Analysis
Obs: En summari av bioinformatik skript som används i det här avsnittet kan finnas som ett kompletterande Code fil.
3.1) Anpassning och QC
- Karta parade slut sekvensering läser mot en mänsklig IGH V, D och J-regionen databas hämtas från IMGT webbplats 11 med hjälp av en anpassad nukleotid blast algoritm baserad på "BLASTN" tillgänglig från NCBI med gap öppen straff 2, luckförlängningskostnad på 1, ordlängd på 7, och e-tröskelvärde på 10 -4. Kasta läs-pair inte mappas till både en IGH V och J-regionen.
- Räkna de återstående läst paren som har IGH V och J avbildningar att erhålla frekvenserna för matchande VJ kombinationer i alla läs paren erhållna från sekvenseringskörning på provet. Räkna en skriv par om det avbildas till både en IGH V och J-genen, och sedan lägga till sin allelen till motsvarande räkningen för den särskilda VJ kombinationen.
- Rangordna räknas för varje återförenas VDJ region erhållen från 3.1.2 från högaest till den lägsta. Den VDJ regionen har den högsta läser räkningen definieras som större ombildning kombination.
- Kasta inriktade sekvenser som täcker mindre än 35% av domänen större ombildning identifierats i 3.1.3.
3.2) SHM profil Identifiering
- Räkna alla SHM mönster över läser från steg 3.1.3. Definiera varje SHM mönster som en subklon.
- Räkna antalet subklonerna som motsvarar olika unika SHM mönster, och antalet läsningar som mappas till individuella subkloner.
3.3) Grafisk representation av resultat
- Utför fylogenetisk analys på subkloner med sina motsvarande SHM mönster med hjälp av en stadsdel förbindningsmetod från R-paketet "apa" enligt tillverkarens protokoll. Beräkna avstånd matris från de enskilda olika anpassningar för att återskapa subklonen fylogeni rotade till nedärvda sekvensen för VJ kombination i fråga för varje parad provuppsättning.
- Använd nukleotidsekvensen av varje subklon som teckenvektor och beräkna det ungefärliga strängen avståndet mellan alla subkloner i de stora VJ omlagring för både diagnos och motsvarande återfall prover med användning av en Levenshtein avståndsmåttet där matematiskt avståndet mellan två inriktningar ges av d x, y (i, j) där d x, y (i, j) = 1 om i ≠ j och 0 på annat sätt och sedan summera denna funktion över längden av den sträng som motsvarar nukleotidsekvenser i och j.
- Grafiskt visa den resulterande matrisen av subklon avstånd och deras motsvarande subklon räknas i följande två sätt:
- Använd R-paketet "MASS" enligt tillverkarens protokoll att tillämpa flerdimensionell skalning till subklonen avståndstabell och generera en tvådimensionell princip koordinater karta, som sedan plottas tillsammans med logaritmenav subclonal räknas som radien av cirkeln.
- Konstruera en oriktad graf baserad på Levenshtein avstånd, där spetsarna motsvarar en och samma subklon till följd av den stora VJ ombildning.
Obs: Om avståndet mellan två olika kloner är lika med en då det finns en kant mellan dessa två hörn. Om avståndet är större än ett, då finns det ingen kant ansluter dem. - Upprätta en kurva av 3.3.3.2 använda tkplot funktionen i "iGraph" R paket med Kamada Kawai orienteringen enligt tillverkarens protokoll. Radien av hörnen är proportionell mot kubik roten av det totala antalet kloner mappade till det och skuggningen använder en röd och blå intervall för att beteckna den andel av kloner som antingen hör till diagnos (blå) eller återfall (röd) prover .
3.4) Heterogen (Entropi) Mätning
- Undersök siffror och subklon räknas avindividuella mönster av somatisk hypermutation som förekommer i stora VJ ombildning för varje parad uppsättning prover.
- Beräkna den empiriska entropi och resterande empiriska entropi justerad för antalet distinkta kloner i varje prov med hjälp av standard histogrambaserad entropi uppskattning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det övergripande förfarandet enligt VDJ-sekvensning (VDJ-punkter), inklusive DNA-extraktion, rekombinerade VDJ-regionen amplifiering och rening, sekvensbestämning bibliotekskonstruktion, läser bearbetning och fylogenetisk analys, representeras i figur 1. Rutinmässigt 5-200 pg DNA kan hämtas från frysta fast vävnadssektioner eller 0,5-20 ^ g DNA från formalinfixerade paraffininbäddade vävnadssnitt. Beroende på kvaliteten, ombildning mönster och SHM grad av individuella prover, kan en variation av VDJ PCR-produkter från olika prover erhållas (Figur 2), inklusive IGVHFR1 (310-380 bp), FR2 (250-295 bp), och FR3 (70-120 bp). Prover från vilka endast FR3 fragment kan erhållas från VDJ PCR uteslöts från den återstående studien på grund av den korta produkt som inte ger tillräcklig mängd sekvensinformation för nedströms dataanalys ändamål. Endast prover varav en stor FR1 eller FR2 PCR-produkten kan visualiseras på the agarosgel bearbetas för att generera sekvense bibliotek. Utbytet av den huvudsakliga PCR-produkten efter gelrening varierar från tio till 50 ng totalt.
Hela renade PCR-produkten användes för den efterföljande bibliotekskonstruktion för sekvense bibliotek. Efter adapter ligering erhåller varje prov sin egen unika index. Under biblioteks förstärkning, var 10 cykler av PCR som kan ge mer än 30 ng som slutbiblioteksprodukter. Biblioteket Kvaliteten nås genom en Bioanalyzer. Som visas i figur 3, finns det en enda produkt i provet biblioteket med en storlek förskjutning av ~ 125 bp bilda den ursprungliga VDJ PCR amplikon produkt med angivande av ytterligare adapter. För varje sekvenseringskörning, var 5-10 bibliotek sammanförs på 7 iM. Dessutom, på grund av den höga sekvenslikheten mellan VDJ PCR-produkterna var bibliotekspool blandades med 50% PhiX spike-in för att säkerställa komplexiteten av körningen och korrekt identifiering av basytterligare efter varje sekvensecykel. Biblioteket DNA-fragment sekvenserades för 150 bp på båda ändarna, vilket medger återvinning av tillräcklig mängd sekvensinformation som spänner över VD och DJ korsningar för FR1 fragment och SHM mutations mönster för fylogenetisk analys.
Tidigare utförde vi VDJ sekvense på 32 DLBCL prover som tagits vid diagnos och återfall från 14 patienter (flera patienter hade flera prover antingen diagnos eller återfall skede) med tillstånd som beskrivits ovan 12. Genom att utföra fylogenetisk analys av SHM profiler av de stora Vh DJn-omlagringar mellan de parade prover, ett "Tidigt-divergent" och en "Late-divergenta" läge av klonal utveckling associerad med DLBCL återfall identifierades 12. Häri har samma tillvägagångssätt tillämpas på ett nyinsamlade DLBCL diagnos och återfall par. De FR1 regionerna erhölls i båda proven efter PCR-amplifiering. En stor PCR-produkt med storleken cirka 344 bp (mätt med Bioanalyzer) erhölls från både diagnos och återfalls proverna. Efter sekvensering, läser totalt 0,70 miljoner parade slut erhölls för diagnos provet och 0.730.000 parade slut läser för återfall provet, som var inom intervallet av antalet läsningar erhölls per prov i den tidigare studien (0.38- 1420000, i genomsnitt 0,75 ± 0260000) 12. Efter kartläggning parade slut läser mot IMGT databas, läser som inte har träffar i alla tre V, var D och J-regionerna kasseras. V H DJ H arrangemang tilldelades varje parad slut läsa. Totalt 0,64 miljoner och 0,67 miljoner V H DJ H korsningar identifierades i diagnos och återfallsprover Det innebär mer än 90% inriktningshastighet. Genom att räkna hur många gånger varje kombination av Vjj DJn-hittades i individuella prov, 808 distinkta Vh </ sub> DJ H korsningar hittades i prov diagnos och 581 distinkta V H DJ H korsningar i återfall provet. Den dominerande V H DJ H övergång i både provet är IGHV4-34 * 2 IGHD5-5 * 01 IGHJ2 * 01, bekräftar att de är klon närstående. Denna dominerande VH DJn-korsningen stod för 97% av hela mappas Vh DJn-korsning läser i både prov diagnos och återfall provet.
Att spåra klon utvecklingen av denna DLBCL återfall fall var fylogenetisk analys av SHM profiler av de stora V H DJ-omlagringar mellan detta par diagnos och återfall prover utförs. Vi observerade att klon evolution mönstret för detta par följde "Late-divergent" väg (Figur 4), att subklonerna från diagnos och återfallstumörer klustrade tillsammans på samma gren av fylogenetiskt träd, och den dominerandediagnos subklon och de dominerande återfalls subkloner delade liknande SHM mönster med några ytterligare mutationer inträffade i återfall subklonen. Dessa resultat tyder på att potentiellt fanns en subklon i diagnosen tumör som var antingen kemo-resistenta eller rymt från behandlingen, och sedan så småningom utvecklades till återfall tumören.
För att ytterligare karakterisera och visualisera klonal arkitektur av varje prov och klonal evolution mönster under återfall process har två nya analyser utvecklats. I dessa analyser har hela uppsättningen av subkloner av de stora VJ ombildning i varje prov som används för att beräkna den parvisa strängen avståndet mellan alla subkloner som definieras av deras mönster av SHM. Sedan genom användning av multidimensionell skalning (figur 5A, 5B) eller genom att bygga en oriktad graf (fig 5C, 5D) som beskrivs i dataanalys, var diagram som representerar fördelningen och heterogeniteten hos subkloner skapas. Somillustreras i fig 4, uppvisar MDS plot betydligt mindre sekvensmångfald mellan större subkloner i slutet divergerande fall (figur 5A) än i de tidiga divergerande fallen (figur 5B). Vidare under kloner av diagnosprov och under kloner av återfall provet i början av avvikande fall helt skilja från varandra, vilket tyder på bristande likheten mellan SHM mönster mellan dessa tumörer trots att de har samma VDJ ombildning . På samma sätt oriktade grafer i (Figur 5C) och (Figur 5D) visar att fördelningen av subklonen räknas i slutet av divergerande fallet (figur 5C) skiljer sig från den tidiga divergent (figur 5D). Den senare har mer framträdande, men genetiskt olika stora kloner från diagnos till återfall. Dessutom bristen på kanterna och mindre subkloner kopplingar mellan de stora diagnos och återfalls kloner itidigt divergerande fall (figur 5D), visar sekvensmångfald natur tidiga avvikande återfall fall.
Figur 1:.. Steg för steg flödesschema för VDJ-punkter strategi Det övergripande förfarandet för VDJ sekvense visas Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representant bilder av VDJ PCR amplikon produkter. Gel bilder som visar den representativa IGVH-FR1 (till vänster) och IGVH-FR2 (högra panelen) PCR-produkter från DNA extraherat från lymfom patientprover. En PCR-produkt kunde inte erhållas i prov 5 förmodligen på grund av antingen den lågaprov-DNA kvalitet eller SHM på primerställen som osäkra PCR-reaktionen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. QC av VDJ PCR amplikon och efterföljande sekvense bibliotek genom Bioanalyzer representant Bioanalyzer spår av samma VDJ amplikon innan bibliotekskonstruktion (övre panelen) och efter bibliotekskonstruktion (nedre panelen). Notera storleken övergången från 334 bp till 459 bp indikerar tillsatsen av adaptern. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Klonal evolution analys av ett par DLBCL diagnos och återfallsprover. Phylogenetic analys av ett diagnos återfall DLBCL provpar visar "Late-divergent" klonal evolution läget. Färg tickers representerar mutationsstatus. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Nya grafiska metoder för att visualisera klonala evolution mönster (A, B) Multidimensional skalnings tomter integrerar SHM profiler och subklon räkningar av provpar A visar den sen divergerande återfall läge (A) och provpar B visar tidig divergent återfall läge. (B). Radien av cirklarna anger räknevärdet för subclsom motsvarar en viss SHM profil och färger som motsvarar diagnosen (blå) prov eller återfall (röd) prov. X- och Y-axeln representerar de översta 2 komponenterna av MDA. (C, D) oriktade grafer av provpar A visar den sen divergerande återfall läge (C) och provpar B visar tidig divergent återfall läge (D). Kanter motsvarar två SHM-profiler som har en sträng avstånd av en bokstav separation och utexaminerades skuggning (färgskala bar) som anger hur stor andel av sekvenser kartläggning till en viss SHM profil motsvarande diagnosen (röd) prov eller återfall (gul) prov. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund av det nästan obegränsat antal iterationer av sekvensinformation kodas av VDJ ombildning och SHM på IGH platsen för humana B-celler, undersökning av hela IGH repertoaren av hög genomströmning djupt sekvensering visade sig vara ett effektivt och heltäckande sätt att avgränsa klonal och sub-klon B-cellpopulationer. Dessutom kan denna strategi kan användas för att studera klonal evolution väg B-celltumörutveckling, remission, och återfall genom att jämföra klonala och sub-klon arkitekturer av patientprover som samlats längs olika stadier av sjukdomen. Även om förstärkning av rearrangerade VDJ-sekvenser från delprov DNA lätt utförs i laboratoriemiljö med hjälp av kommersiellt tillgängliga primers, är effektiviteten i förstärkningen till stor del beroende på kvaliteten på prov-DNA. Särskilt DNA extraherat från FFPE provexemplaren låg amplifieringseffektiviteten, och ofta bara den lilla FR3 fragmentet kan framgångsrikt amplifieras från dessaprover, vilket gör dem olämpliga för den efterföljande analysen. Eftersom vår studie som beskrivs häri har utformats för att förstå klonalitet av B-cell-lymfom, vilket är en klonal sjukdom med en eller flera större kloner dominera hela tumören, vi bara uppsamlades och sekvenshuvud VDJ-PCR-produkt. För studier som är intresserade av att katalogisera hela B-cellsklonpopulation av exempelvis, perifert blod, kan en större del av gelén som innehåller flera VDJ-PCR-produkter (flera band eller en smutsfläck på gelén) skäras och sekvenserades. Det är dock viktigt att påpeka att det inte är möjligt att fånga hela ordnas om IGH repertoar eftersom vissa SHM kan inträffa vid där primers mål och försämrar förstärkning av dessa VDJs. Dessutom har nyligen en kommersiell analys direkt koppling IGH ombildning förstärkning och MiSeq sekvensering införts. Denna analys effektiviserar provberedningsprocessen. Eftersom inte alla tumörprover skulle kunna släktente den FR1-fragmentet, rekommenderar vi fortfarande innefattande gelelektrofores steget för att kontrollera produkten av PCR-reaktionen före sammanslagning prover för sekvensering.
Sekvense 150 bp av båda ändarna av VDJ-fragmentet (totalt 300 bp sekvensinformation) har följande fördelar: 1) 300 bp sekvense kan täcka majoriteten av FR1 och hela FR2-fragmentet, ger gott sekvensinformation för identifiering av VDJ-omlagring och somatiska hyper mutationer; 2) Plattformen ger snabb sekvense turn-around tid som kompletterar hela 300 cykler av VDJ-sekvensering i 48 timmar; 3) Varje körning tillåter multiplexering upp till 12 prover och fortfarande uppnår cirka en miljon parade slut läser per prov utgång. Eftersom den höga sekvenslikheten mellan kloner som bär samma VDJ-omlagringen, speciellt i B-cellslymfomprover, är det kritiskt att spika-i 20-50% PhiX under sekvenseringskörning för att tillåta exakt definiera bas ringer matris. Nyligen MiSeqprogramvara har uppdaterats för att ta itu med denna fråga. Det rekommenderas att använda så lite som 5% PhiX spik-in för låg komplexitet bibliotek sekvensering. Däremot har vår sekvense anläggning upplevt inkonsekvent koncentration av PhiX spike-kontroll DNA från tillverkaren som skulle kunna äventyra resultatet av låg komplexitet sekvensering. Därför, i nuvarande praxis, fortfarande använder vi 10-20% PhiX spik-in för VDJ sekvensering. För sekvensering av hela perifert blod av B-celler repertoar, som normalt innehåller ett stort antal olika VDJ arrangemang, är det möjligt att minska mängden PhiX spike-in. Även om antalet kloner och underkloner identifierats av varje prov är positivt korrelerad med antalet läsningar sekvens halv till en miljon av parade slut läser per prov är tillräcklig för att jämföra klonala strukturer mellan prover och härleda klonala evolution mönster mellan prover som tagits vid olika sjukdomsstadier av samma patient 12. det ärmöjligt att PE 150 bp sekvense kanske inte uppnå tillräcklig täckning av de långa FR1 fragment (dvs. 350-380 bp). I vissa fall kan sekvensinformation av D-segmentet inte samlas in eller det kanske inte tillräckligt med sekvensinformation om V-segmentet att skilja subkloner av SHMS. Men med förskottet av sekvenseringsteknik, har det blivit möjligt att sekvensera längre och täcker hela FR1 amplicon.
Genom sekvensering av IGH repertoar av B-celler var det möjligt att spåra utbyggnaden av enskilda B-cellkloner och sluta klon utveckling under loppet från diagnos till återfall. Med hjälp av analys på populationerna av subklonema genereras av SHM mönster, kunde vi skilja två typer av cancer progression till återfall genom att undersöka deras fylogenier. De senaste grafiska representationer som använder flerdimensionella skal tomter och oriktade grafer baserat på Levenshtein bit längre allow oss att förstå 1) den subclonal sammansättningen av varje tumör, 2) hur enskilda subkloner är relaterade till varandra, och 3) hur varje subklon utvecklas under sjukdomsförloppet. Dessutom visade statistisk analys att dessa fylogenetiska strukturer var klart annorlunda och att de subclonal populationerna skilde som gäller deras heterogenitet. Slutligen kan den klonala evolutionen bana erhållen genom VDJ-sekvense vara väl korrelerad med genetisk evolution och kännetecknas av antingen exome eller riktad återsekvenserings 12. Därför att kombinera dessa två tillvägagångssätt har potential att identifiera föraren mutationer under lymphomagenesis och lymfom återfall
Förutom att definiera B-cells IGH repertoar och spåra klon utveckling av lymfom progression, kan VDJ-punkter tillvägagångssätt potentiellt användas som en mycket känslig metod för att spåra minimal sjukdom rest, övervakning tumörrespons till terapier, och potentiellt identifiera närvaronav läkemedelsresistenta kloner. Kan även tillämpas Ett liknande tillvägagångssätt för T-celler för att kartlägga T-cellreceptor repertoar, och kan användas för att sondera immunövervakning svar till cancer. Dessutom kan VDJ-punkter också utföras i musmodeller med hjälp av primers tillgängliga från Hanna et al. 13 Det är troligt att information som samlas in genom sådana åtgärder under de närmaste åren kan leda till en bättre förståelse av dynamiken i tumörutveckling samt utöka vår kunskap om immunsystemet och dess roll i att försvara vår kropp från tumörinvasion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR | 89125-170 | 200 proof, for molecular biology |
| TE buffer | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris·Cl, pH 8.0; 10 mM EDTA |
| Xylenes | VWR | EM-XX0055-6 | 500 ml |
| Proteinase K | Life Technonogies | 25530-015 | 100 mg |
| Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix | Promega | U1515 | 10 mM each nucleotide |
| 10x PCR Buffer | Roche | 11699105001 | Without MgCl2 |
| AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2 | Life Technonogies | 4311806 | 50 µl at 5 U/µl |
| Specimen Control Size Ladder | Invivoscribe Technologies | 2-096-0020 | 33 reactions |
| IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 - Gel Detection | Invivoscribe Technologies | 5-101-0030 | 33 reactions, Mix 2 for IGVHFR1 detection |
| IGH Gene Clonality Assay - Gel Detection | Invivoscribe Technologies | 1-101-0020 | 33 reactions, Tube B for IGVHFR2 detection |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | 20 µl at 5 U/µl |
| 10X Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer | Corning (cellgro) | 46-011-CM | 6x1 L |
| 50x TAE BUFFER | VWR | 101414-298 | 1 L |
| Ethidium bromide solution | Sigma-Aldrich | E1510 | 10 mg/ml |
| 25 bp DNA Ladder | Life Technologies | 10597011 | 1 µg/µl |
| 100 bp DNA Ladder | Life Technologies | 15628-019 | 1 µg/µl |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-500 | 500 g |
| 40% Acrylamide/Bis Solution | Bio-Rad Laboratories | 1610144 | 500 ml |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | 50 columns |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit | Life Technologies | Q32854 | |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| MiSeq | Illumina | ||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32872 | |
| Resuspension buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Ligation mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| DNA adaptor index (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| PCR primer cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Magnetic stand | Life Technologies | 4457858 | |
| Gel imaging system | Bio-Rad Laboratories | 170-8370 |
References
- Nowell, P. C. The clonal evolution of tumor cell populations. Science. 194 (4260), 23-28 (1976).
- Greaves, M., Maley, C. C.
- Ding, L., et al. Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing. Nature. 481 (7382), 506-510 (2012).
- Jiao, W., Vembu, S., Deshwar, A. G., Stein, L., Morris, Q. Inferring clonal evolution of tumors from single nucleotide somatic mutations. BMC bioinformatics. 15, 35 (2014).
- Schatz, D. G., Ji, Y. Recombination centres and the orchestration of V(D)J recombination. Nature reviews immunology. 11 (4), 251-263 (2011).
- Jacob, J., Kelsoe, G., Rajewsky, K., Weiss, U. Intraclonal generation of antibody mutants in germinal centres. Nature. 354 (6352), 389-392 (1991).
- Coiffier, B., et al. CHOP chemotherapy plus rituximab compared with CHOP alone in elderly patients with diffuse large-B-cell lymphoma. N Engl J Med. 346 (4), 235-242 (2002).
- Larouche, J. F., et al. Lymphoma recurrence 5 years or later following diffuse large B-cell lymphoma: clinical characteristics and outcome. J Clin Oncol. 28 (12), 2094-2100 (2010).
- Friedberg, J. W. Relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2011, 498-505 (2011).
- Gisselbrecht, C., et al. Salvage regimens with autologous transplantation for relapsed large B-cell lymphoma in the rituximab era. J Clin Oncol. 28 (27), 4184-4190 (2010).
- Lefranc, M. P. IMGT, the International ImMunoGeneTics Information System for Immunoinformatics : methods for querying IMGT databases, tools, and web resources in the context of immunoinformatics. Molecular biotechnology. 40 (1), 101-111 (2008).
- Jiang, Y., et al. Deep sequencing reveals clonal evolution patterns and mutation events associated with relapse in B-cell lymphomas. Genome biology. 15 (8), 432 (2014).
- Hanna, J., et al. Direct reprogramming of terminally differentiated mature B lymphocytes to pluripotency. Cell. 133 (2), 250-264 (2008).
