Abstract
فهم قابلية التنسيل الورم أمر بالغ الأهمية لفهم الآليات التي تشارك في تكون الأورام وأمراض التقدم. بالإضافة إلى ذلك، فهم التغييرات تكوين نسيلي التي تحدث داخل الورم في الاستجابة لبعض البيئة الصغرى أو العلاجات قد تؤدي إلى تصميم نهج أكثر تطورا وفعالة للقضاء على الخلايا السرطانية. ومع ذلك، فقد كان الورم تتبع نسيلي سكان شبه صعبة نظرا لعدم وجود علامات مميزة. لمعالجة هذه المشكلة، تم إنشاء بروتوكول VDJ تسلسل لتتبع أنماط التطور نسيلي من منتشر كبير سرطان الغدد الليمفاوية الخلية B (DLBCL) الانتكاس من خلال استغلال VDJ إعادة التركيب والتحور الجسدية (SHM)، واثنين من ميزات فريدة من الأورام اللمفاوية الخلايا البائية.
في هذا البروتوكول، شيدت الجيل التالي من التسلسل (خ ع) مكتبات مع إمكانية فهرسة من تضخيم المناعي ترتيبها السلسلة الثقيلة (IGH) المنطقة VDJ من أزواج من التشخيص الأولي والانتكاس DLBCL عصيدةليه. على تم الحصول المتوسط أكثر من نصف مليون تسلسل VDJ في العينة بعد التسلسل، والتي تحتوي على كل VDJ إعادة ترتيب والمعلومات SHM. بالإضافة إلى ذلك، تم تطوير خطوط الأنابيب المعلوماتية الحيوية المخصصة للاستفادة الكاملة من المعلومات تسلسل لتوصيف IGH-VDJ ذخيرة داخل هذه العينات. وعلاوة على ذلك، فإن خط الأنابيب يسمح لإعادة الإعمار والمقارنة بين الهندسة المعمارية نسيلي الأورام الفردية، والتي تمكن الفحص من عدم التجانس نسيلي داخل الأورام التشخيص وخصم من أنماط التطور نسيلي بين التشخيص وأزواج الورم الانتكاس. عند تطبيق هذا التحليل على عدة أزواج التشخيص الانتكاس، وكشف لنا أدلة الرئيسي الذي أنماط تطورية الورم مميزة متعددة يمكن أن يؤدي إلى DLBCL الانتكاس. بالإضافة إلى ذلك، يمكن توسيع هذا النهج في الجوانب السريرية الأخرى، مثل التعرف على المرض المتبقي الحد الأدنى، رصد التقدم المحرز الانتكاس والاستجابة للعلاج، والتحقيق في مأمن repertoirوفاق في سياقات غير سرطان الغدد الليمفاوية.
Introduction
السرطان هو مرض نسيلي. منذ ثلاثين عاما عندما اقترح بيتر C. نويل السرطان نسيلي نموذج التطور 1، وقد حاول العديد من الدراسات لتشريح السكان نسيلي داخل عينات الورم وإعادة التوسع والتطور أنماط نسيلي التي تكمن وراء عملية تكون الأورام 2. في الآونة الأخيرة، وقد مكن كامل الجينوم التسلسل المحققين إلى إلقاء نظرة عميقة على عدم التجانس نسيلي وتطور 3،4. ولكن نظرا لعدم وجود علامات الانقياد في العديد من أنواع الخلايا، فإنه من الصعب للاستدلال على العمارة نسيلي دقيقة والمسار التطوري. لحسن الحظ هناك علامة قابلية التنسيل الطبيعية في خلايا B الناضجة من فيه العديد من الأورام الخبيثة اللمفاوية، بما في ذلك DLBCL، تنشأ. وردا على التحفيز مستضد، ويمكن لكل خلية B تشكيل منتجة تسلسل IGH VDJ واحد من خلال الانضمام إلى H V (متغير)، وD (التنوع)، وJ H (الانضمام) قطعة معا من مجموعة كبيرة من هذه القطاعات. خلال هذه العلاقات العامةocess، وأجزاء صغيرة من التسلسل الأصلي قد يتم حذف ويمكن أن يضاف النيوكليوتيدات غير قالب إضافية لإنشاء VDJ إعادة ترتيب فريدة من نوعها. يمكن أن تكون موروثة هذا إعادة ترتيب VDJ محددة في كل ذرية من هذه الخلايا B، ومن ثم وضع علامات الفردية ناضجة B-الخلية ونتاجه 5. وعلاوة على ذلك، ويحدث SHM على تسلسل VDJ معاد في وسط جرثومي (GC) رد فعل لاحق لتقديم الطفرات إضافية لتوسيع تجمع الأضداد وتعزيز الأجسام المضادة تقارب 6. لذلك، من خلال مقارنة والمتناقضة VDJ وSHM أنماط عينات سرطان الغدد الليمفاوية التي خضعت هذه العمليات، يمكن أن يرسم داخل الورم عدم التجانس ويمكن استخلاصه مسار التطور نسيلي من المرض.
سابقا، يمكن تحديد VDJ إعادة ترتيب وSHM بواسطة PCR تضخيم المناطق معاد، استنساخ المنتجات PCR، وبعد ذلك سانجر التسلسل للحصول على معلومات التسلسل. هذا النهج طق منخفضة الإنتاجية والعائد المنخفض واسترجاع سوى جزء صغير جدا من كامل معاد ذخيرة VDJ، وتعيق توصيف التمثيل العام للسكان نسيلي ضمن عينة معينة. تم إنشاء نهج المعدلة عن طريق توليد NGS فهرسة المكتبات التسلسل من المنتجات VDJ PCR وأداء PE 2x150 بي بي التسلسل للحصول على أكثر من نصف مليون تسلسل VDJ معاد لكل عينة. بالإضافة إلى ذلك، تم تطوير خط أنابيب مخصصة لأداء مراقبة الجودة (QC)، محاذاة، فلتر VDJ التسلسل يقرأ لتحديد إعادة ترتيب وSHMS كل قراءة، وإجراء تحليل النشوء والتطور على بنية نسيلي من كل عينة. بالإضافة إلى ذلك، تم تأسيس نهج جديد لمزيد من تميز وتطور أنماط نسيلي عن العينات التي تم جمعها في مختلف مراحل المرض.
لقد طبقت هذه التقنية لعينات المريض DLBCL. DLBCL هو شكل من اشكال عدوانية من سرطان الغدد الليمفاوية غير هودجكين مع الانتكاس المتكرر في ال تصل إلى واحدIRD من المرضى 7. الانتكاسات DLBCL عادة تحدث في وقت مبكر، في غضون 2-3 سنوات من التشخيص الأولي، على الرغم من أن البعض الآخر تحدث بعد 5 سنوات 8. تشخيص حالة المرضى انتكس والفقراء، مع 10٪ فقط نتوصل إلى 3 سنوات البقاء على قيد الحياة خالية من التقدم بسبب خيارات العلاج محدودة. وهذا هو الأساس للحاجة الملحة لمقاربات جديدة لعلاج DLBCL الانتكاس 9،10. ومع ذلك، الآليات الجزيئية المرتبطة DLBCL الانتكاس لا تزال مجهولة إلى حد كبير. بشكل خاص، دور التجانس نسيلي في التشخيص وتطور نسيلي خلال تطوير الانتكاس DLBCL هم uncharacterized في الوقت الحاضر، مما يجعل من الصعب تعريف العلامات البيولوجية دقيقة ومفيدة للتنبؤ الانتكاس. لمعالجة هذه المسائل، طبقنا نهجنا VDJ التسلسل في أزواج متعددة من مطابقة الأساسي التشخيص الانتكاس عينة DLBCL أزواج. ظهرت سيناريوهين التطورية نسيلي متميزة من الانتكاس من المقارنة بين أبنية نسيلي بين التشخيص وعصيدة الانتكاسليه توحي بأن الآليات الجزيئية متعددة يمكن أن تشارك في DLBCL الانتكاس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. VDJ التضخيم
1.1) استخلاص DNA من عينات الأورام
- استخراج الحمض النووي من الشرائح الرقيقة (10-20 ميكرون) من أكتوبر جزءا لا يتجزأ من الأنسجة الطبيعية أو الخبيثة المجمدة.
- هضم 10-30 أقسام رقيقة من الأنسجة جزءا لا يتجزأ من بتخفيض مشراح ناظم البرد في 4 مل نوكليك الاحتياطي تحلل (0.0075 M تريس حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.2؛ 0.3 M كلوريد الصوديوم؛ 0.002 M نا 2 EDTA) مع بروتين K (0.5 ملغ / مل، وتركيز النهائي ) و0.625٪ SDS في أنبوب 15 مل الطرد المركزي في 37 ° C حمام الماء بين عشية وضحاها.
- إضافة 1 مل من كلوريد الصوديوم المشبع (5 M) إلى خليط الهضم ويهز بقوة لمدة 15 ثانية.
- أجهزة الطرد المركزي في 1100 x ج لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- طاف لنقل 15 مل أنبوب الطرد المركزي الجديدة وإضافة مجلدين من الإيثانول بنسبة 100٪.
- مزيج من قبل قلب الأنبوب 6-8 مرات. الطرد المركزي في 5000 x ج لمدة 60 دقيقة في 4 درجة مئوية لجمع الحمض النووي عجل.
- يغسل بيليه الحمض النووي مرتين مع 70٪ من الإيثانول. CENTRifuge في 5000 x ج لمدة 15 دقيقة في كل مرة لجمع بيليه.
- حل DNA في 100-400 ميكرولتر TE العازلة في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها على شاكر. العائد DNA هو 5-200 ميكروغرام (تركيز النهائي بين 50-500 نانوغرام / ميكرولتر) اعتمادا على حجم الأنسجة
- استخراج الحمض النووي من الشرائح الرقيقة (10-20 ميكرون) من الفورمالين الثابتة، جزءا لا يتجزأ من (FFPE) الأنسجة الطبيعية أو الخبيثة paraffin-.
- احتضان أقسام البارافين في 1 مل الزيلين مرتين في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة في كل مرة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل لنزع paraffinize. جمع المقاطع الأنسجة عن طريق الدوران في 13000 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان المقاطع في 1 مل الإيثانول بنسبة 100٪ مرتين في درجة حرارة الغرفة، و 10 دقيقة في كل مرة لإزالة بقايا الزايلينات. جمع المقاطع الأنسجة عن طريق الدوران في 13000 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. يذوب البارافين تماما في هذه النقطة، وقسم النسيج والمتبقي فقط.
- الهواء الجاف الأقسام في غرفة الشركة المصرية للاتصالاتmperature لمدة 10-15 دقيقة.
- جعل 0.5 ملغ / مل بروتين K الحل مع 1X PCR العازلة (مخفف من 10X PCR العازلة مع nuclease خالية من المياه). إضافة محلول بروتين كاف للعينات في الحجم النهائي من 50-100 ميكرولتر واحتضان ليلا 37 درجة مئوية.
- تسخين العينات عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لإبطال نشاط بروتين K.
ملاحظة: في هذه الخطوة، يذوب DNA العينة في المخزن المؤقت PCR، ويمكن استخدامها في خطوات 1.2 و 1.3 مباشرة. العائد DNA هو 0،5 حتي 20 ميكروغرام (تركيز النهائي بين 10-200 نانوغرام / ميكرولتر) اعتمادا على حجم الأنسجة.
1.2) تقييم جودة DNA
- مزيج 0.25 ميكرولتر طق البلمرة DNA مع 45 ميكرولتر من مزيج الرئيسي من عدة سلم التجارية في أنبوب PCR.
- إضافة 5 DNA ميكرولتر أعدت من 1.1.1.7 أو 1.1.2.5 في أنبوب PCR ومزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا لمدة 5 مرات على الأقل.
- استخدام الشروط التالية لتضخيم DNA: 95 ° C ل7 دقيقة. تليها 35 دورة من 45 ثانية في 95 درجة مئوية، و 45 ثانية في 60 درجة مئوية، و 90 ثانية في 72 ° C؛ ثم 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة وعقد في 15 ° C.
- إعداد agarose هلام 2٪ في TBE (تريس / البورات / EDTA).
- مزيج 20 ميكرولتر PCR تفاعل مع 4 ميكرولتر صبغ 6X التحميل، وتحميل على 2٪ agarose هلام.
- وصمة عار على agarose هلام مع 0.5 ميكروغرام / مل إيثيديوم بروميد الحل وكشف عن المنتجات PCR مع نظام هلام تخيل. ملاحظة: سوف العينات التي تسفر عن 5 منتجات PCR في أحجام 100، 200، 300، 400، و 600 نقطة أساس أن تستمر لتوليد amplicons VDJ.
تنبيه: إيثيديوم بروميد هو المغير قوية. الرجاء التعامل مع الحذر الشديد من خلال ارتداء معدات الوقاية، مثل القفازات، والتصرف في حاويات المحددة في المبادئ التوجيهية المؤسسة.
1.3) VDJ PCR
1.3.1) أسهب معاد IGH VDJ الجزء من الإطار منطقة 1 (IgVHFR1)
- مزيج 45 ميكرولتر مزيج الرئيسي من التسمية أنبوبإد باسم "ميكس 2" لالجسدية IGH التحور الفحص للكشف جل عدة التجارية، 0.25 ميكرولتر طق البلمرة DNA، و 5 ميكرولتر عينة DNA أعدت من 1.1.1.7 أو 1.1.2.5 في أنبوب PCR.
- استخدام الشروط التالية لتضخيم DNA: 95 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. تليها 35 دورة من 45 ثانية في 95 درجة مئوية، و 45 ثانية في 60 درجة مئوية، و 90 ثانية في 72 ° C؛ ثم 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة وعقد في 15 ° C.
- حل المنتج PCR كامل في هلام الاغاروز 2٪ بحلول الكهربائي.
- وصمة عار على agarose هلام مع 0.5 ميكروغرام / مل إيثيديوم بروميد الحل وكشف عن المنتجات PCR مع نظام التصوير هلام. ومن المتوقع مع حجم مجموعة من 310-380 سنة مضت A amplicon وحيدة النسيلة.
- استئصال جزء هلام يحتوي على amplicon وحيدة النسيلة بين 310-380 نقطة أساس.
- تنقية DNA من هلام المستأصل باستخدام أدوات استخراج جل القياسية وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. ملاحظة: بالنسبة للعينات التي شظايا FR1 يمكن الحصول عليها، ليست هناك حاجة إلى بإسهاب IGVHFR2 وIgVHFR3.
1.3.2) أسهب معاد IGH VDJ الجزء من الإطار المنطقة 2 (IgVHFR2)
- مزيج 45 ميكرولتر مزيج الرئيسي من الأنبوب وصفت بأنها "أنبوب B" لأغراض تجارية IGH جين قابلية التنسيل الفحص للكشف جل عدة، 0.25 ميكرولتر طق البلمرة DNA، وDNA عينة 5 ميكرولتر أعدت من 1.1.1.7 أو 1.1.2.5 في أنبوب PCR .
- استخدام الشروط التالية لتضخيم DNA: 95 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. تليها 35 دورة من 45 ثانية في 95 درجة مئوية، و 45 ثانية في 60 درجة مئوية، و 90 ثانية في 72 ° C؛ ثم 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة ويترك عند 15 درجة مئوية.
- حل المنتج PCR كامل في هلام الاغاروز 2٪ بحلول الكهربائي.
- تصور PCR المنتج (ق) من 0.5 ميكروغرام / مل إيثيديوم بروميد تلطيخ. ويمكن ملاحظة amplicon وحيدة النسيلة في نطاق حجم 250-295 نقطة أساس.
- استئصال جزء هلام يحتوي على amplicon وحيدة النسيلة بين 250-295 نقطة أساس.
- تنقية DNA من هلام المستأصل باستخدام استخراج جل القياسيةأيون كيت وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
1.4) تحسين VDJ PCR
- استخدام الظروف PCR المعدلة التالية لتضخيم IgVHFR1 وIgVHFR2 باستخدام الحمض النووي الأمثل: 95 درجة مئوية لمدة 7 دقائق، 40 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 60 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 60 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 90 ثانية، والإرشاد النهائي في 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
2. VDJ Amplicon إعداد مكتبة وتسلسلها
2.1) إعداد مكتبة
2.1.1) نهاية لإصلاح
- نقل VDJ PCR المنتج من 1.3 في أنبوب PCR وإضافة العازلة إعادة تعليق من إعداد مجموعة DNA عينة لإظهار حجم إلى 60 ميكرولتر.
- إضافة 40 ميكرولتر من إصلاح النهاية مزيج من كيت تحضير DNA عينة وتخلط جيدا.
- احتضان رد الفعل عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في thermocycler قبل ساخنة (30 ° C) مع غطاء قبل ساخنة في 100 ° C.
- مزيج 136 ميكرولتر حبات مغناطيسية و24 ميكرولتر PCR زالمياه رادي لأول مرة في أنبوب 1.5 مل، ثم نقل كامل رد فعل نهاية إصلاح من 2.1.1.3 في أنبوب 1.5 مل وتخلط جيدا مع الحل الخرز.
- مكان الأنابيب على الوقوف المغناطيسي لمدة 2 دقيقة للسماح للفصل حبات من الحل. نضح طاف، وتغسل حبات مع 80٪ العذبة استعداد ETOH مرتين في حين أن أنبوب على الوقوف المغناطيسي.
- نضح الحل الايثانول تماما والسماح للالخرز على الهواء الجاف لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
- خذ أنبوب المواجهة و resuspend المغناطيسي حبات في 17.5 ميكرولتر إعادة تعليق العازلة.
- مكان الأنابيب مرة أخرى على الوقوف المغناطيسي لمدة 2 دقيقة إلى حبات منفصلة عن العازلة إعادة تعليق. إزالة العازلة إعادة تعليق (هو معلق المنتج النهائي إصلاح في المنطقة العازلة إعادة تعليق الآن) في أنبوب PCR نظيفة.
2.1.2) A-المخلفات
- إضافة 12.5 ميكرولتر مزيج A-المخلفات في أنبوب PCR يحتوي المنتج النهائي إصلاح وتخلط جيدا. احتضان أنبوب PCR عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في thermocycler قبل ساخنة (37 ° C) مع غطاء ساخنة قبل في 100 ° C.
2.1.3) محول من ربط
- إضافة 2.5 ميكرولتر إعادة تعليق العازلة، 2.5 ميكرولتر من ربط ميكس، و 2.5 ميكرولتر مؤشر محول الحمض النووي في رد فعل المخلفات A.
- احتضان رد الفعل عند 30 درجة مئوية لمدة 30 minl في thermocycler قبل ساخنة (30 ° C) مع غطاء قبل ساخنة في 100 ° C.
- إضافة 5 ميكرولتر من ربط إيقاف مؤقت في كل رد فعل وتخلط جيدا.
- مزيج 42.5 حبات مغناطيسية ميكرولتر جيدا مختلطة لتنظيف رد فعل الخطوات التالية 2.1.1.5 ل2.1.1.8. إضافة 50 ميكرولتر إعادة تعليق مؤقت لأزل المنتج ligated محول.
- تنظيف المنتج ligated محول للمرة الثانية باستخدام 50 ميكرولتر جيدا مختلطة الخرز AMPure XP، وأزل المنتج في 25 ميكرولتر إعادة تعليق العازلة في أنبوب PCR نظيفة.
2.1.4) شظايا تضخيم DNA
- إضافة 5 ميكرولتر PCR التمهيدي كوكتيل و 25 ميكرولتر PCR ميكس ماجستير في أنبوب PCR يحتوي المنتج ligated محول وتخلط جيدا.
- أداء التضخيم في thermocycler مبرمجة مسبقا للشروط التالية: 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ 10 دورات من 98 درجة مئوية لمدة 10 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ ثم 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق مع الاستمرار في 10 ° C.
- تنظيف رد الفعل باستخدام 50 حبات مغناطيسية ميكرولتر جيدا مختلطة، وأزل المنتج النهائي في 30 ميكرولتر إعادة تعليق العازلة.
2.1.5) مكتبة التحقق من صحة
- تحديد المنتج النهائي مع التألق باستخدام بروتوكول الشركة الصانعة. تركيز مكتبة النهائي بين 2،5 حتي 20 نانوغرام / ميكرولتر.
- تقييم جودة المنتج النهائي باستخدام أداة تحليلية مع رقاقة حساسية عالية DNA وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. نتوقع فرقة واحدة مع حجم المتوقع لأي IGVHFR1، IGVHFR2 أو IGVHFR3. البريدحجم xpected المنتج مكتبة يساوي حجم amplicon VDJ الأصلي بالإضافة إلى حجم المحولات (~ 125 شركة بريتيش بتروليوم).
2.2) VDJ-PCR مكتبة تجميع وتسلسلها
- حساب المولية من كل جزء مكتبة باستخدام الصيغة التالية: نانومتر = [(نانوغرام / 1000) / BP * 660] × 10 9 حيث نانوغرام هو تركيز المكتبة VDJ-PCR قياس في خطوة 2.1.5.1 وشركة بريتيش بتروليوم هي قمة حجم مكتبة VDJ-PCR قياس في خطوة 2.1.5.2.
- تمييع المكتبة إلى 2 نانومتر (المجموع 10 ميكرولتر) مع الماء خالية من الدناز.
- الجمع بين 10 ميكرولتر من المخفف 2 المكتبات نانومتر معا في أنبوب 1.5 مل.
- إضافة حجم مساو من PhiX ضبط ارتفاع في في أنبوب 1.5 مل.
- تحميل السباحة في تركيز 07:00 الصعود إلى flowcell.
- تسلسل المكتبات باستخدام إقران نهاية التسلسل 150 دورة وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
تحليل 3. البيانات
ملاحظة: summآرى من النصوص المعلوماتية الحيوية المستخدمة في هذا القسم يمكن العثور على أنها رمز الملف التكميلي.
3.1) محاذاة وQC
- خريطة إقران نهاية التسلسل يقرأ ضد IGH V البشري، D والمنطقة قاعدة بيانات J تحميلها من الموقع IMGT 11 باستخدام خوارزمية الانفجار النووى وتكييفها على أساس 'blastn' المتاحة من NCBI مع الفجوة عقوبة مفتوحة من 2، الفجوة عقوبة تمديد 1، طول كلمة من 7، وعتبة قيمة الإلكترونية من 10 -4. تجاهل الزوج، قراءة لا تعين كلا من IGH V ومنطقة J.
- عد ما تبقى من أزواج قرأت أن يكون IGH V وJ تعيينات للحصول على ترددات مطابقة مجموعات VJ عبر عن قراءة أزواج تم الحصول عليها من المدى التسلسل على العينة. عد للقراءة الزوج إذا تم تعيينه لكلا من IGH V وJ الجينات، ثم قم بإضافة أليل لعدد المقابلة لمزيج VJ معين.
- ترتيب التهم لكل منطقة VDJ معاد تم الحصول عليها من 3.1.2 من أعلىمؤسسة إلى أدنى مستوى. المنطقة VDJ لديها أعلى يقرأ ويعرف العد كما مزيج إعادة ترتيب كبير.
- تجاهل تسلسل الانحياز التي تغطي أقل من 35٪ من إعادة ترتيب رئيسيا في مجال التعرف 3.1.3.
3.2) SHM تحديد الهوية
- عد كل أنماط SHM عبر يقرأ من الخطوة 3.1.3. تعريف كل نمط SHM باعتباره subclone.
- حساب عدد من subclones التي المقابلة لمختلف أنماط SHM فريدة من نوعها، وعدد القراءات التي تم تعيينها إلى subclones الفردية.
3.3) التمثيل البياني للنتائج
- إجراء تحليل النشوء والتطور على subclones استخدام مواردها المقابلة أنماط SHM باستخدام حي الانضمام طريقة من حزمة R "القرد" وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. حساب مصفوفة مسافة واحدة من الاصطفافات متميزة الفردية لإعادة نسالة subclone الجذور إلى تسلسل سلالة الجرثومية للVJ الجمع في السؤال لكل مجموعة العينة الثنائية.
- استخدام تسلسل النوكليوتيدات كل subclone كما ناقلات شخصية وحساب المسافة سلسلة تقريبية بين جميع subclones في إعادة ترتيب VJ رئيسي لكل من التشخيص وعينات الانتكاس المقابلة باستخدام مقياس المسافة Levenshtein حيث رياضيا أن المسافة بين اثنين من التحالفات التي كتبها د س، ص (ط، ي) حيث د س، ص (ط، ي) = 1 إذا كنت ≠ ي و 0 خلاف ذلك، ومن ثم تلخيص هذه الوظيفة على طول السلسلة الموافق النوكليوتيدات تسلسل i و j.
- بيانيا عرض المصفوفة الناتجة من مسافات subclone وتعول subclone يناظرها في الطريقتين التاليتين:
- استخدام حزمة R "الشامل" وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة لتطبيق المقياس متعدد الأبعاد لمصفوفة مسافة subclone وتوليد مبدأ الأبعاد إحداثيات الخريطة، التي يتم بعد ذلك تآمر جنبا إلى جنب مع لوغاريتممن التهم subclonal باعتبارها نصف قطر الدائرة.
- بناء على الرسم البياني صليات على أساس المسافة Levenshtein، حيث تتوافق القمم لكل subclone متميزة الناشئة عن إعادة ترتيب VJ كبير.
ملاحظة: إذا كانت المسافة بين اثنين من الحيوانات المستنسخة متميزة تساوي واحد ثم هناك ميزة بين هذه القمم اثنين. إذا كانت المسافة أكبر من واحد، ثم لا يوجد أي حافة ربطها. - رسم بياني ل3.3.3.2 استخدام وظيفة tkplot في "iGraph" حزمة R مع تخطيط Kamada كاواي وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. دائرة نصف قطرها من القمم يتناسب مع الجذر مكعبة من العدد الإجمالي من الحيوانات المستنسخة التي تم تعيينها إلى ذلك ويستخدم التظليل مجموعة الأحمر والأزرق للدلالة على نسبة من الحيوانات المستنسخة إما أن تنتمي إلى التشخيص (الأزرق) أو الانتكاس (الأحمر) عينات .
3.4) التجانس (الانتروبيا) قياس
- دراسة الأرقام والعد subclone للأنماط الفردية من التحور الجسدية التي تحدث في إعادة ترتيب VJ رئيسيا لكل إقران مجموعة من العينات.
- حساب تجريبي الكون والكون التجريبية المتبقية تعديل لعدد من الحيوانات المستنسخة متميزة في كل عينة باستخدام تقدير الكون الرسم البياني القياسية القائمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الإجراء العام للVDJ التسلسل (VDJ وما يليها)، بما في ذلك استخراج الحمض النووي، معاد VDJ المنطقة التضخيم والتنقية، وبناء مكتبة التسلسل، يقرأ معالجة، وتحليل النشوء والتطور، تتمثل في الشكل 1. روتيني 5-200 DNA ميكروغرام يمكن استرجاعها من أقسام الأنسجة الصلبة المجمدة أو ،5-20 ميكروغرام من الحمض النووي جزءا لا يتجزأ من البارافين أقسام الأنسجة الثابتة الفورمالين. اعتمادا على نوعية، ونمط إعادة ترتيب، ودرجة SHM العينات الفردية، ويمكن الحصول على مجموعة متنوعة من المنتجات VDJ PCR من عينات مختلفة (الشكل 2)، بما في ذلك IGVHFR1 (310-380 بي بي)، FR2 (250-295 بي بي)، و FR3 (70-120 بي بي). تم استبعاد العينات التي يمكن الحصول عليها فقط FR3 جزء من VDJ PCR من الدراسة المتبقية بسبب المنتج القصير الذي لا يوفر كمية كافية من المعلومات تسلسل المصب غرض تحليل البيانات. إلا عينات منها يمكن تصور منتج رئيسي FR1 أو FR2 PCR على التتم معالجة البريد هلام الاغاروز لإنشاء مكتبات التسلسل. العائد من المنتجات الرئيسية PCR بعد تنقية هلام يتراوح 10-50 نانوغرام في المجموع.
تم استخدام المنتج PCR المنقى كامل لبناء مكتبة لاحق لمكتبة التسلسل. بعد محول ربط، كل عينة يحصل مؤشر فريدة من نوعها. خلال التضخيم مكتبة، تم تنفيذ 10 دورات PCR التي يمكن أن تسفر عن أكثر من 30 نانوغرام كمنتجات مكتبة النهائية. تم الوصول إلى جودة مكتبة من قبل bioanalyzer. كما هو مبين في الشكل (3)، وهناك منتج واحد واحد في العينة مكتبة مع تحول حجم ~ 125 سنة مضت تشكل VDJ PCR amplicon المنتج الأصلي مما يدل على إضافي للمحول. لكل شوط التسلسل، وكان يتم تجميع 5-10 المكتبات معا في 7 ميكرومتر. بالإضافة إلى ذلك، نظرا لتشابه تسلسل عالية بين المنتجات VDJ PCR، كانت مختلطة بركة مكتبة مع 50٪ PhiX ارتفاع في ضمان تعقيد المدى والتحديد الصحيح للقاعدةإضافية بعد كل دورة التسلسل. والتسلسل شظايا الحمض النووي المكتبة لمدة 150 سنة مضت على كلا الطرفين، والذي يسمح للاسترجاع كمية كافية من المعلومات تسلسل تمتد VD وDJ تقاطعات لشظايا FR1، وأنماط SHM طفرة لتحليل النشوء والتطور.
سابقا، أجرينا VDJ التسلسل على 32 عينات DLBCL جمعها في التشخيص والانتكاس من 14 مريضا (كان العديد من المرضى عينات متعددة جمعت في أي تشخيص أو مرحلة الانتكاس) باستخدام الشرط المذكورة أعلاه 12. عن طريق إجراء تحليل النشوء والتطور لمحات SHM من كبرى إعادة ترتيب V H DJ H بين عينات مقترن، و"في وقت مبكر-متباينة" واسطة "في وقت متأخر من متباينة" التطور نسيلي المرتبطة DLBCL الانتكاس تم تحديد 12. هنا، تم تطبيق نفس النهج لتشخيص DLBCL جمعت حديثا وزوج والانتكاس. تم الحصول على مناطق FR1 في كل العينات بعد PCR التضخيم. تم الحصول على منتج PCR كبير مع حجم حوالي 344 سنة مضت (تقاس bioanalyzer) من كل من التشخيص والعينات الانتكاس. بعد التسلسل، يقرأ تم الحصول على ما مجموعه 0.70 مليون إقران نهاية للعينة التشخيص و0730000 إقران نهاية يقرأ للعينة الانتكاس، والتي كانت ضمن مجموعة من عدد من يقرأ الحصول عليها في العينة في الدراسة السابقة (0.38- 1420000، متوسط 0.75 ± 0.26 مليون) 12. بعد يقرأ الخرائط إقران نهاية ضد قاعدة بيانات IMGT، يقرأ ذلك لم يكن لديك يضرب في كل ثلاثة V، تم التخلص منها المناطق D وJ. كلف V H DJ H الترتيب لكل إقران نهاية القراءة. وقد تم تحديد ما مجموعه 0640000 و0670000 V H DJ H تقاطعات الطرق في عينات التشخيص والانتكاس على التوالي، وهو ما يمثل معدل محاذاة أكبر من 90٪. عن طريق عد كم مرة تم العثور على كل مجموعة من V H DJ H في عينات فردية، 808 متميز V H </ دون> تم العثور DJ H تقاطعات في العينة التشخيص و 581 متميزة V H DJ H تقاطعات في العينة الانتكاس. المهيمن V H DJ H تقاطع في كل من العينة IGHV4-34 * 2 IGHD5-5 * 01 * 01 IGHJ2، مؤكدا أنها ذات الصلة متطابق بسلالة. شكلت هذه المهيمن V H DJ H تقاطع 97٪ من كامل المعين V H DJ H تقاطع يقرأ في كل عينة تشخيص وعينة الانتكاس.
لتتبع تطور نسيلي من هذه الحالة الانتكاس DLBCL، تم إجراء تحليل النشوء والتطور لمحات SHM من كبرى إعادة ترتيب V H DJ H بين هذا الزوج من عينات التشخيص والانتكاس. لاحظنا أن نمط التطور نسيلي هذا الزوج يتابع المسار "في وقت متأخر من متباينة" (الشكل 4)، أن subclones من الأورام التشخيص والانتكاس تتجمع معا في نفس الفرع من شجرة النشوء والتطور، والمهيمنةحدث subclone التشخيص وsubclones الانتكاس المهيمنة مشترك مماثل نمط SHM مع عدد قليل من الطفرات إضافية في subclone الانتكاس. وتشير هذه النتائج التي يحتمل أن تكون هناك subclone في الورم التشخيص التي كانت إما مقاومة للعلاج الكيميائي أو هرب من العلاج، ثم وضعت في نهاية المطاف إلى الورم الانتكاس.
لمزيد من تميز وتصور العمارة نسيلي من كل العينات وأنماط التطور نسيلي خلال عملية الانتكاس، وقد وضعت اثنين من التحليلات الجديدة. في هذه التحليلات، استخدمت مجموعة كاملة من subclones من إعادة ترتيب VJ الرئيسي في كل عينة لحساب المسافة سلسلة البشرى بين جميع subclones كما حددتها أنماطها من SHM. ثم باستخدام متعددة الأبعاد التحجيم (الشكل 5A، 5B) أو من خلال بناء بياني صليات (الشكل 5C، 5D) كما هو موضح في تحليل البيانات، تم إنشاؤها المؤامرات التي تمثل التوزيع وعدم تجانس subclones. مثلهو موضح في الشكل (4)، والمؤامرة MDS المعارض التنوع أقل بكثير تسلسل بين subclones كبيرة في حالات متباينة في وقت متأخر (الشكل 5A) من أنه في حالات متباينة في وقت مبكر (الشكل 5B). وعلاوة على ذلك، استنساخ الفرعية من العينة التشخيص واستنساخ فرعية من العينة الانتكاس في حالة متباينة في وقت مبكر منفصلة تماما عن بعضها البعض، مما يدل على عدم وجود تشابه أنماط SHM بين هذه الأورام على الرغم من أنها تحمل نفس VDJ إعادة ترتيب . وبالمثل، الرسوم البيانية غير موجهة في (الشكل 5C) و (الشكل 5D) تبين أن توزيع التهم subclone في أواخر حالة متباينة (الشكل 5C) يختلف عن متباينة في وقت مبكر (الشكل 5D). هذا الأخير قد استنساخ الكبرى أكثر وضوحا ولكن متنوعة وراثيا من التشخيص إلى الانتكاس. بالإضافة إلى ذلك، عدم وجود حواف وsubclones أصغر اتصالات بين الحيوانات المستنسخة الرئيسية التشخيص والانتكاس فيفي وقت مبكر حالة متباينة (الشكل 5D)، تدليل على طبيعة التنوع سلسلة من أوائل حالة الانتكاس متباينة.
الشكل 1:.. خطوة خطوة الرسم البياني للنهج VDJ وما يليها يرد الإجراء العام للVDJ التسلسل الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صور الممثل من المنتجات amplicon VDJ PCR. الصور هلام تبين ممثل IGVH-FR1 (اللوحة اليسرى) وIGVH-FR2 (اللوحة اليمنى) منتجات PCR من الحمض النووي المستخرج من عينات المريض سرطان الغدد الليمفاوية. لا يمكن الحصول على منتج PCR في عينة 5 وربما يرجع ذلك إما إلى أدنى مستوىجودة DNA عينة أو SHM في مواقع التمهيدي أن ضعف رد الفعل PCR. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: QC من VDJ PCR amplicon ومكتبة التسلسل اللاحقة التي bioanalyzer يتتبع الممثل Bioanalyzer من نفس VDJ amplicon قبل بناء مكتبة (اللوحة العلوية) وبعد بناء مكتبة (اللوحة السفلية). لاحظ تحول حجم من 334 نقطة أساس إلى 459 نقطة أساس مما يدل على إضافة محول. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4: تحليل تطور نسيلي من زوج من التشخيص والانتكاس عينات DLBCL. تحليل النشوء والتطور من DLBCL عينة الزوج التشخيص الانتكاس تبين وضع التطور نسيلي "في وقت متأخر من متباينة". تمثل آلة للون حالة تحور. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5: طرق رسومية جديدة لتصور أنماط التطور نسيلي (A، B) المؤامرات التحجيم متعددة الأبعاد دمج التشكيلات SHM وتعول subclone من الزوج عينة A تبين في وقت متأخر من متباينة وضع الانتكاس (A) وزوج العينة B تظهر في وقت مبكر-متباينة وضع الانتكاس. (B). دائرة نصف قطرها من الدوائر تشير إلى عدد من subclتلك المقابلة لمحة SHM معين والألوان المقابلة لتشخيص (الأزرق) عينة أو الانتكاس (الأحمر) عينة. وX- وY-محاور تمثل أعلى المكونات 2 من MDA. (C، D) الرسوم البيانية صليات من الزوج عينة A تبين في وقت متأخر من متباينة وضع الانتكاس (C) وزوج العينة B التي تبين وضع الانتكاس المبكر متباينة (D). حواف تتوافق مع اثنين من الملامح SHM وجود مسافة سلسلة من الفصل حرف واحد وتخرج التظليل (لون نطاق بار) تشير إلى نسبة رسم الخرائط تسلسل إلى ملف تعريف SHM معين المقابلة لتشخيص (الأحمر) عينة أو الانتكاس (الصفراء) عينة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نظرا لوجود عدد غير محدود تقريبا من تكرار المعلومات تسلسل مشفرة عن طريق VDJ إعادة ترتيب وSHM في موضع IGH من خلايا B الإنسان، أثبت الفحص للذخيرة IGH بالكامل عن طريق الإنتاجية العالية في أعماق التسلسل لتكون وسيلة فعالة وشاملة لتحديد نسيلي والسكان B-خلية فرعية نسيلي. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الاستراتيجية يمكن استخدامها لدراسة مسار التطور نسيلي التنمية الخلايا B الورم، ومغفرة، والانتكاس عن طريق مقارنة أبنية نسيلي ودون نسيلي من عينات المرضى جمعت على طول مراحل مختلفة من المرض. على الرغم من التضخيم من متواليات VDJ ترتيبها من الحمض النووي العينة الأولية يتم تنفيذ بسهولة في بيئة المختبر باستخدام بادئات المتاحة تجاريا، وكفاءة التضخيم تعتمد إلى حد كبير على نوعية الحمض النووي العينة. على وجه الخصوص، الحمض النووي المستخرج من عينات FFPE المعارض انخفاض كفاءة التضخيم، وغالبا ما سوى جزء صغير FR3 يمكن تضخيم بنجاح من هذهالعينات، مما يجعلها غير صالحة للتحليل لاحقة. منذ تم تصميم دراستنا الموصوفة هنا لفهم قابلية التنسيل من سرطان الغدد الليمفاوية B الخلية، وهو مرض نسيلي مع واحد أو عدة استنساخ الكبرى التي تسيطر على الورم بأكمله، جمعنا فقط والتسلسل المنتج الرئيسي VDJ-PCR. للدراسات المهتمة في فهرسة الخلية B إجمالي عدد السكان نسيلي، على سبيل المثال، الدم المحيطي، والجزء الأكبر من هلام يحتوي على العديد من المنتجات VDJ-PCR (نطاقات متعددة أو لطخة على جل) يمكن استئصاله والتسلسل. ومع ذلك، فمن المهم أن نشير إلى أنه ليس من الممكن للقبض على كامل ترتيبها ذخيرة IGH لأن بعض SHM قد تحدث في حيث الهدف الاشعال وتنال من التضخيم من هذه VDJs. وعلاوة على ذلك، تم إدخال مؤخرا، مقايسة التجاري اقتران مباشرة التضخيم IGH إعادة ترتيب وMiSeq التسلسل. هذا الاختبار يبسط عملية إعداد العينة. ومع ذلك، منذ ليس كل ورم عينات سيكون قادرا على أجناسالشركة المصرية للاتصالات جزء FR1، ما زلنا نوصي بما في ذلك خطوة الكهربائي للهلام للتحقق من نتاج تفاعل PCR قبل تجميع عينات للتسلسل.
تسلسل 150 سنة مضت من طرفي جزء VDJ (مجموع المعلومات تسلسل 300 بي بي) والمزايا التالية: 1) أن 300 شركة بريتيش بتروليوم التسلسل تغطي غالبية FR1 وFR2 جزء كامل، وتوفير المعلومات تسلسل وافرة لتحديد VDJ إعادة ترتيب و جسدية شديدة الطفرات. 2) توفر منصة تسلسل سريع بدوره حول الوقت الذي يكمل كامل 300 دورات VDJ التسلسل تحت 48 ساعة. 3) كل شوط يسمح مضاعفة تصل إلى 12 عينة ومازال يحقق نحو مليون إقران نهاية يقرأ في إخراج نموذج. لأن التشابه عالية تسلسل بين الحيوانات المستنسخة تحمل نفس VDJ إعادة ترتيب، وخاصة في B عينات سرطان الغدد الليمفاوية الخلية، فإنه أمر بالغ الأهمية لارتفاع في 20-50٪ PhiX خلال الفترة السابقة تسلسل للسماح تحدد بدقة قاعدة يدعو المصفوفة. في الآونة الأخيرة، وMiSeqتم تحديث البرنامج لمعالجة هذه المسألة. فمن المستحسن أن تستخدم ما لا يزيد عن 5٪ PhiX ارتفاع في درجة منخفضة التسلسل مكتبة التعقيد. ومع ذلك، فقد شهدت منشأة التسلسل تركيزنا متناسقة من PhiX-ارتفاع في DNA الرقابة المنصوص من قبل الشركة المصنعة التي من شأنها أن تؤثر سلبا على نتائج منخفضة التعقيد التسلسل. لذلك، في الممارسة الحالية، ونحن لا تزال تستخدم 10-20٪ PhiX ارتفاع في لتسلسل VDJ. لتسلسل كامل ذخيرة B-خلايا الدم المحيطي، والذي يحتوي عادة على عدد كبير من الترتيبات VDJ مختلفة، فمن الممكن أن تقلل من كمية PhiX ارتفاع في. على الرغم من أن عدد من الحيوانات المستنسخة وsubclones المحددة من كل عينة يرتبط ارتباطا إيجابيا مع عدد القراءات متسلسلة، نصف المليون من إقران نهاية يقرأ في عينة كافية لمقارنة الهياكل نسيلي بين العينات واستخلاص أنماط التطور نسيلي بين العينات التي تم جمعها في مختلف مراحل المرض من المريض نفسه (12). هوممكن أن PE 150 نقطة أساس التسلسل قد لا تحقق تغطية كافية من تلك الشظايا FR1 طويلة (أي 350-380 بي بي). في بعض الحالات، معلومات تسلسل الجزء D قد لا يكون جمع أو قد لا يكون هناك ما يكفي من المعلومات تسلسل على القطعة V التفريق subclones التي كتبها SHMS. ومع ذلك، مع تقدم التكنولوجيا التسلسل، فقد أصبح من الممكن لتسلسل أطول وتغطية FR1 amplicon بأكمله.
من خلال تسلسل ذخيرة IGH من خلايا B-كان من الممكن أن تتبع توسيع الفردية استنساخ خلايا B ويستنتج التطور نسيلي على مدى من التشخيص إلى الانتكاس. مع استخدام التحليل على سكان subclones الناتجة عن أنماط SHM، كنا قادرين على التفريق وضعين من تطور مرض السرطان إلى الانتكاس عن طريق فحص شجرة الأنساب الخاصة بهم. أحدث الأشكال البيانية باستخدام قطع التحجيم متعددة الأبعاد والرسوم البيانية غير موجهة على أساس المسافة Levenshtein مزيد ألوث لنا أن نفهم 1) تكوين subclonal كل ورم، 2) كيف subclones الفرد ترتبط مع بعضها البعض، و3) كيفية تطور كل subclone أثناء تطور المرض. وعلاوة على ذلك، أظهر التحليل الإحصائي أن هذه الهياكل النشوء والتطور كانت مختلفة بشكل واضح وأن السكان subclonal اختلفوا فيما يتعلق التجانس بهم. وأخيرا، فإن مسار التطور نسيلي التي حصلت عليها VDJ التسلسل يمكن ربط بشكل جيد مع التطور الجيني وتتميز إما exome أو استهداف resequencing 12. لذلك، والجمع بين هذين النهجين لديه القدرة على تحديد الطفرات سائق أثناء lymphomagenesis وسرطان الغدد الليمفاوية الانتكاس
بالإضافة إلى تحديد B IGH خلية ذخيرة وتتبع تطور نسيلي من سرطان الغدد الليمفاوية تقدم، فإن النهج VDJ تسلسل يمكن يحتمل أن تستخدم كوسيلة حساسة للغاية لتتبع المرض بقايا الحد الأدنى، ورصد استجابة الورم للعلاج، وربما تحديد وجودمن الحيوانات المستنسخة المقاوم للأدوية. ويمكن أيضا أن تطبق نهج مماثل لخلايا تي T على الخريطة مستقبلات الخلايا ذخيرة، والتي يمكن استخدامها لتحقيق استجابة المراقبة المناعية للسرطان. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا VDJ وما يليها أن يؤديها في نماذج الفئران باستخدام بادئات المتاحة من حنا وآخرون 13 ومن المتوقع أن المعلومات التي تم جمعها من خلال هذا النهج في السنوات القليلة المقبلة يمكن أن يؤدي إلى فهم أفضل للديناميات التنمية الورم وكذلك توسيع معرفتنا جهاز المناعة، ودورها في الدفاع عن الجسم من غزو الورم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR | 89125-170 | 200 proof, for molecular biology |
| TE buffer | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris·Cl, pH 8.0; 10 mM EDTA |
| Xylenes | VWR | EM-XX0055-6 | 500 ml |
| Proteinase K | Life Technonogies | 25530-015 | 100 mg |
| Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix | Promega | U1515 | 10 mM each nucleotide |
| 10x PCR Buffer | Roche | 11699105001 | Without MgCl2 |
| AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2 | Life Technonogies | 4311806 | 50 µl at 5 U/µl |
| Specimen Control Size Ladder | Invivoscribe Technologies | 2-096-0020 | 33 reactions |
| IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 - Gel Detection | Invivoscribe Technologies | 5-101-0030 | 33 reactions, Mix 2 for IGVHFR1 detection |
| IGH Gene Clonality Assay - Gel Detection | Invivoscribe Technologies | 1-101-0020 | 33 reactions, Tube B for IGVHFR2 detection |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | 20 µl at 5 U/µl |
| 10X Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer | Corning (cellgro) | 46-011-CM | 6x1 L |
| 50x TAE BUFFER | VWR | 101414-298 | 1 L |
| Ethidium bromide solution | Sigma-Aldrich | E1510 | 10 mg/ml |
| 25 bp DNA Ladder | Life Technologies | 10597011 | 1 µg/µl |
| 100 bp DNA Ladder | Life Technologies | 15628-019 | 1 µg/µl |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-500 | 500 g |
| 40% Acrylamide/Bis Solution | Bio-Rad Laboratories | 1610144 | 500 ml |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | 50 columns |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit | Life Technologies | Q32854 | |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| MiSeq | Illumina | ||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32872 | |
| Resuspension buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Ligation mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| DNA adaptor index (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| PCR primer cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Magnetic stand | Life Technologies | 4457858 | |
| Gel imaging system | Bio-Rad Laboratories | 170-8370 |
References
- Nowell, P. C. The clonal evolution of tumor cell populations. Science. 194 (4260), 23-28 (1976).
- Greaves, M., Maley, C. C.
- Ding, L., et al. Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing. Nature. 481 (7382), 506-510 (2012).
- Jiao, W., Vembu, S., Deshwar, A. G., Stein, L., Morris, Q. Inferring clonal evolution of tumors from single nucleotide somatic mutations. BMC bioinformatics. 15, 35 (2014).
- Schatz, D. G., Ji, Y. Recombination centres and the orchestration of V(D)J recombination. Nature reviews immunology. 11 (4), 251-263 (2011).
- Jacob, J., Kelsoe, G., Rajewsky, K., Weiss, U. Intraclonal generation of antibody mutants in germinal centres. Nature. 354 (6352), 389-392 (1991).
- Coiffier, B., et al. CHOP chemotherapy plus rituximab compared with CHOP alone in elderly patients with diffuse large-B-cell lymphoma. N Engl J Med. 346 (4), 235-242 (2002).
- Larouche, J. F., et al. Lymphoma recurrence 5 years or later following diffuse large B-cell lymphoma: clinical characteristics and outcome. J Clin Oncol. 28 (12), 2094-2100 (2010).
- Friedberg, J. W. Relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2011, 498-505 (2011).
- Gisselbrecht, C., et al. Salvage regimens with autologous transplantation for relapsed large B-cell lymphoma in the rituximab era. J Clin Oncol. 28 (27), 4184-4190 (2010).
- Lefranc, M. P. IMGT, the International ImMunoGeneTics Information System for Immunoinformatics : methods for querying IMGT databases, tools, and web resources in the context of immunoinformatics. Molecular biotechnology. 40 (1), 101-111 (2008).
- Jiang, Y., et al. Deep sequencing reveals clonal evolution patterns and mutation events associated with relapse in B-cell lymphomas. Genome biology. 15 (8), 432 (2014).
- Hanna, J., et al. Direct reprogramming of terminally differentiated mature B lymphocytes to pluripotency. Cell. 133 (2), 250-264 (2008).
