Abstract
Begrip tumor klonaliteit is van cruciaal belang voor het begrijpen van de betrokken zijn bij het ontstaan van tumoren en de progressie van de ziekte mechanismen. Verder inzicht in de klonale samenstelling veranderingen die binnen een tumor in reactie op bepaalde micro-omgeving of behandelingen kunnen leiden tot het ontwerp van betere en meer doeltreffende methoden om tumorcellen te roeien. Echter, het bijhouden tumor klonale subpopulatie uitdagend vanwege het gebrek aan onderscheiden markeringen. Om dit probleem aan te pakken, werd een VDJ-seq protocol gemaakt om de klonale evolutie patronen van diffuus grootcellig B-cellymfoom (DLBCL) terugval op te sporen door gebruik VDJ recombinatie en somatische hypermutatie (SHM), twee unieke kenmerken van B-cel lymfomen.
In dit protocol werden de next-generation sequencing (NGS) bibliotheken met indexering potentieel opgebouwd uit versterkte herschikte immunoglobuline zware keten (IgH) VDJ regio van paren van primaire diagnose en recidief DLBCL samples. Op werden gemiddeld meer dan een half miljoen VDJ sequenties per monster verkregen na sequencing, die zowel VDJ omlegging en SHM informatie bevatten. Daarnaast werden aangepast bioinformatica pijpleidingen ontwikkeld om sequentie-informatie voor het karakteriseren van IgH-VDJ repertoire in deze monsters volledig te benutten. Bovendien is de pijpleiding maakt de reconstructie en vergelijking van de klonale architectuur van individuele tumoren, waarbij het onderzoek van de klonale heterogeniteit binnen de diagnose tumoren en aftrek van klonale evolutiepatronen tussen diagnose en recidief tumor paren mogelijk maakt. Bij de toepassing van deze analyse een aantal diagnose-terugval paren, we ontdekt belangrijkste bewijs dat meerdere onderscheidende tumor evolutionaire patronen kan leiden tot DLBCL terugval. Bovendien kan deze aanpak worden uitgebreid naar andere klinische aspecten, zoals identificatie minimale ziekte, monitoring terugval voortgang en respons op de behandeling, en het onderzoek van het immuunsysteem repertoirees in non-lymfoom contexten.
Introduction
Kanker is een klonale ziekte. Sinds dertig jaar geleden Peter C. Nowell voorgesteld kanker klonale evolutie model 1, hebben vele studies geprobeerd klonale populaties ontleden in tumormonsters reconstrueren klonale expansie en evolutie patronen die de tumorigenese proces 2 ten grondslag liggen. Onlangs heeft het hele genoom sequencing onderzoekers nodig om een diepe blik op de klonale heterogeniteit en de evolutie 3,4 nemen. Echter, vanwege het gebrek aan handelbaar markers in vele celtypen is het moeilijk om de precieze klonale architectuur en evolutionaire weg afleiden. Gelukkig is er een natuurlijke klonaliteit marker in rijpe B-cellen van die vele lymfoïde maligniteiten, met inbegrip van DLBCL, afkomstig. In antwoord op antigen stimulatie, kan elke B-cel een productieve IgH VDJ sequentie samen door bij een VH (variabel), D (diversiteit), en J H (verbinden) segment uit een grote pool van deze segmenten. Tijdens deze process kunnen kleine gedeelten van de oorspronkelijke sequentie verwijderd en aanvullende niet-matrijs nucleotiden worden toegevoegd aan een unieke VDJ herrangschikking te creëren. Deze specifieke VDJ omlegging kan worden overgenomen in alle nakomelingen van deze B-cellen, dus etiketteren individuele mature B-cel en zijn nakomelingen 5. Bovendien SHM gebeurt op gerecombineerde VDJ-sequenties in de daaropvolgende kiemcentra (GC) reactie aanvullende mutaties voor de uitbreiding van het antilichaam pool en de versterking van antilichaamaffiniteit 6. Daarom is door het vergelijken en contrasterende VDJ en SHM patronen van lymfoom monsters die deze processen hebben ondergaan, intra-tumor heterogeniteit kon worden afgebakend en klonale evolutie pad van de ziekte kan worden afgeleid.
Voorheen kon VDJ herrangschikking en SHM geïdentificeerd met PCR amplificeren van het gerecombineerde gebieden, het kloneren van de PCR producten en vervolgens Sanger sequentiebepaling sequentie informatie te verkrijgen. Deze aanpak is lage doorvoer en lage opbrengst binnenhalen slechts een klein deel van de gehele gerecombineerde VDJ repertoire en belemmeren de karakterisering van de algemene representatie van de klonale populatie binnen een bepaald monster. Een aangepaste aanpak werd gecreëerd door het genereren van NGS geïndexeerd sequencing bibliotheken van VDJ PCR-producten en het uitvoeren van PE 2x150 bp sequencing om meer dan een half miljoen gerecombineerde VDJ sequenties per monster te verkrijgen. Daarnaast werd een aangepaste pipeline ontwikkeld voor kwaliteitscontrole (QC) uitvoeren, uitlijnen, filter VDJ sequentiebepaling leest herschikkingen en SHMS van elke lees- identificeren en uitvoeren fylogenetische analyse van de klonale architectuur van elk monster. Daarnaast is een nieuwe benadering ingesteld om verder te karakteriseren de klonale evolutie patronen voor monsters in verschillende ziektestadia.
We hebben deze techniek DLBCL patiënt monsters toegepast. DLBCL is een agressieve vorm van non-Hodgkin lymfoom frequent terugval in maximaal één thIRD van de patiënt 7. DLBCL recidieven normaal optreden vroeg, binnen 2 tot 3 jaar van de initiële diagnose, hoewel sommige doen zich na 5 jaar 8. Prognose voor recidiverende patiënten is slecht, met slechts 10% bereiken van 3 jaar progressievrije overleving als gevolg van beperkte behandelingsmogelijkheden. Dit is de basis voor de dringende behoefte aan nieuwe benaderingen van DLBCL terugval 9,10 behandelen. Echter, moleculaire mechanismen geassocieerd met DLBCL terugval zijn nog grotendeels onbekend. Vooral de rol van klonale heterogeniteit bij diagnose en klonale veranderingen tijdens DLBCL terugval ontwikkeling momenteel gekarakteriseerde, waardoor het moeilijk om een accurate en bruikbare biomarker terugval voorspellen definiëren. Om deze vragen te beantwoorden, passen we onze VDJ-sequencing aanpak op meerdere paren van overeenkomstige primaire diagnose-recidief DLBCL monster paren. Twee verschillende klonale evolutionaire scenario van terugval voortgekomen uit de vergelijking van de klonale architecturen tussen diagnose en recidief samples die meerdere moleculaire mechanismen betrokken zouden kunnen zijn bij DLBCL terugval.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. VDJ Amplification
1,1) DNA Extraction uit tumormonsters
- Uittreksel DNA van dunne secties (10-20 micrometer) van bevroren oktober ingebed normaal of kwaadaardig weefsel.
- Digest 10-30 snijden van dunne ingebed weefsel gesneden op een cryostaat microtoom in 4 ml Lysis Buffer Nucleic (0,0075 M Tris HCI, pH 8,2, 0,3 M NaCl, 0,002 M Na2EDTA) met Proteinase K (0,5 mg / ml, eindconcentratie ) en 0,625% SDS in een 15 ml centrifugebuis in een 37 ° C waterbad gedurende de nacht.
- Voeg 1 ml verzadigd NaCl (5 M) aan het digestiemengsel en schud krachtig gedurende 15 seconden.
- Centrifugeer bij 1100 xg gedurende 15 min bij kamertemperatuur.
- Breng het supernatant naar een nieuwe 15 ml centrifugebuis en voeg twee volumes 100% ethanol.
- Meng door het buisje 6-8 keer. Centrifugeer bij 5000 xg gedurende 60 min bij 4 ° C om het geprecipiteerde DNA te verzamelen.
- Was de DNA pellet tweemaal met 70% ethanol. Centrifuge bij 5000 xg gedurende 15 min elke keer om de pellet te verzamelen.
- Los DNA in 100-400 pi TE-buffer bij kamertemperatuur op een schudder overnacht. De DNA-opbrengst 5-200 ug (eindconcentratie tussen 50-500 ng / ul) afhankelijk van de grootte van het weefsel
- Extraheer DNA uit dunne gedeelten (10-20 um) van met formaline gefixeerd paraffine ingebed (FFPE) normaal of kwaadaardig weefsel.
- Incubeer paraffinecoupes in 1 ml xyleen tweemaal bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten telkens in een 1,5 ml microcentrifugebuis om de-paraffinize. Verzamel de weefselcoupes door het draaien bij 13.000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Incubeer secties in 1 ml 100% ethanol tweemaal bij kamertemperatuur 10 minuten telkens resten xylenen te verwijderen. Verzamel de weefselcoupes door het draaien bij 13.000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. De paraffine wordt volledig opgelost op dit moment en alleen de weefselsectie resteert.
- Air-droog de secties bij kamertemperatuur temperature gedurende 10-15 min.
- Voeg een 0,5 mg / ml proteïnase K oplossing met 1 x PCR buffer (verdund uit 10 x PCR buffer met nuclease-vrij water). Voeg de proteïnase K oplossing van de monsters in een uiteindelijk volume van 50-100 pi en incubeer overnacht bij 37 ° C.
- Verwarm de monsters bij 95 ° C gedurende 10 min te inactiveren Proteïnase K.
Opmerking: In deze stap wordt het monster DNA opgelost in de PCR buffer en kunnen worden gebruikt in de stappen 1.2 en 1.3 direct. De DNA-opbrengst 0,5 tot 20 ug (eindconcentratie tussen 10-200 ng / ul) afhankelijk van de grootte van het weefsel.
1.2) DNA Quality Assessment
- Meng 0,25 ul Taq DNA polymerase met 45 pi master mix van de commerciële ladder kit in een PCR-buis.
- Voeg 5 ul DNA bereid uit 1.1.1.7 of 1.1.2.5 in de PCR-buis en meng goed door en neer te pipetteren minstens 5 keer.
- Gebruik de volgende situaties het DNA te amplificeren: 95 ° C7 min; gevolgd door 35 cycli van 45 sec bij 95 ° C, 45 sec bij 60 ° C en 90 sec bij 72 ° C; vervolgens 72 ° C gedurende 10 min en houden op 15 ° C.
- Bereid een 2% agarosegel in TBE (Tris / boraat / EDTA).
- Meng 20 ul PCR reactie met 4 pi 6x ladingskleurstof en laden op een 2% agarosegel.
- Vlekken op de agarosegel met 0,5 ug / ml ethidiumbromide oplossing en detecteren PCR producten met een gel verbeelding systeem. Opmerking: de monsters die 5 PCR producten verkregen van het formaat 100, 200, 300, 400 en 600 bp wordt verder VDJ amplicons gegenereerd.
LET OP: Ethidiumbromide is een potente mutagene stof. Behandel met uiterste voorzichtigheid door het dragen van beschermende versnellingen, dwz handschoenen en verwerken in specifieke containers per richtlijnen instelling.
1,3) VDJ PCR
1.3.1) Amplify Gerecombineerde IgH- VDJ Segment van Framework Regio 1 (IgVHFR1)
- Mix 45 pi master mix van de buis labeled als "Mix 2" van commerciële somatische IGH Hypermutatie test voor Gel Detection kit, 0,25 pi Taq DNA polymerase, en 5 pl monster-DNA bereid uit 1.1.1.7 of 1.1.2.5 in een PCR buis.
- Gebruik de volgende situaties het DNA te amplificeren: 95 ° C gedurende 7 min; gevolgd door 35 cycli van 45 sec bij 95 ° C, 45 sec bij 60 ° C en 90 sec bij 72 ° C; vervolgens 72 ° C gedurende 10 min en houden op 15 ° C.
- Los het gehele PCR-product in een 2% agarosegel met elektroforese.
- Vlekken op de agarosegel met 0,5 ug / ml ethidiumbromide oplossing en detecteren PCR producten met een gel beeldvormingssysteem. Een monoklonaal amplicon wordt verwacht met de orde van grootte van 310-380 bp.
- Accijnzen de gel gedeelte met de monoklonale amplicon tussen 310-380 bp.
- Zuiver DNA uit uitgesneden onder toepassing van een standaard Gel Extraction Kit volgens het protocol van de fabrikant. Opmerking: voor monsters die FR1 fragmenten kunnen worden verkregen, hoeft overvloedig te IgVHFR2 en IgVHFR3.
1.3.2) Amplify Gerecombineerde IgH- VDJ Segment van Framework Regio 2 (IgVHFR2)
- Mix 45 pi master mix van de buis gelabeld als "Tube B" van een commercieel IGH Gene klonaliteit test voor Gel Detection kit, 0,25 ul Taq DNA polymerase, en 5 ul monster-DNA bereid uit 1.1.1.7 en 1.1.2.5 in een PCR-buis .
- Gebruik de volgende situaties het DNA te amplificeren: 95 ° C gedurende 7 min; gevolgd door 35 cycli van 45 sec bij 95 ° C, 45 sec bij 60 ° C en 90 sec bij 72 ° C; vervolgens 72 ° C gedurende 10 min en de reactie bij 15 ° C.
- Los het gehele PCR-product in een 2% agarosegel met elektroforese.
- Visualiseren PCR product (en) van 0,5 ug / ml ethidiumbromide kleuring. Een monoklonaal amplicon kan worden waargenomen binnen het groottebereik van 250-295 bp.
- Accijnzen de gel gedeelte met de monoklonale amplicon tussen 250-295 bp.
- Zuiver DNA uit uitgesneden gel met een standaard Gel Extraction Kit volgens het protocol van de fabrikant.
1.4) Optimaliseren VDJ PCR
- Gebruik de volgende gewijzigde PCR- omstandigheden voor het amplificeren IgVHFR1 en IgVHFR2 gebruik suboptimale DNA: 95 ° C gedurende 7 min, 40 cycli van 95 ° C gedurende 60 sec, 60 ° C gedurende 60 sec en 72 ° C gedurende 90 sec, laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 10 min.
2. VDJ Amplicon Bibliotheek Voorbereiding en Sequencing
2.1) Bibliotheek Voorbereiding
2.1.1) End-reparatie
- Transfer VDJ PCR-product van 1,3 in een PCR-buis en voeg resuspensiebuffer uit DNA Monstervoorbereiding Kit om het volume tot 60 pi te brengen.
- Voeg 40 ul van End Repair Mix uit DNA Monstervoorbereiding Kit en meng.
- Incubeer de reactie bij 30 ° C gedurende 30 min in een voorverwarmde thermocycler (30 ° C) met een voorverwarmde deksel bij 100 ° C.
- Meng 136 ul magnetische bolletjes en 24 ul PCR grade water eerst in een 1,5 ml buis, vervolgens over de volledige End-reparatie reactie van 2.1.1.3 in de 1,5 ml buis en meng goed met de kralen oplossing.
- Plaats de buisjes op een magnetische standaard gedurende 2 min aan de afscheiding van de beads uit de oplossing toe. Zuig de supernatant en was de kralen met 80% vers bereide EtOH tweemaal terwijl de buis op de magnetische standaard.
- Zuig het ethanoloplossing volledig en laat de korrels aan de lucht drogen gedurende 15 min bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
- Neem de buis uit de magnetische stand en resuspendeer kralen in 17,5 ul resuspensiebuffer.
- Plaats de buisjes weer op de magnetische standaard voor 2 min afzonderlijke kralen uit de resuspensiebuffer. Verwijder de hersuspensiebuffer (End-reparatie product wordt gesuspendeerd in de hersuspensiebuffer nu) in een schone PCR-buis.
2.1.2) A-tailing
- Voeg 12,5 ul A-tailing mix in de PCR-buis met End-reparatie product en meng. Incubeer de PCR-buis bij 37 ° C gedurende 30 min in een voorverwarmde thermocycler (37 ° C) met een voorverwarmde deksel bij 100 ° C.
2.1.3) Adaptor Ligatie
- Voeg 2,5 ul resuspensiebuffer, 2,5 ul ligatiemengsel, en 2,5 pl DNA-adapter Index in de A-tailing reactie.
- Incubeer de reactie bij 30 ° C gedurende 30 minl in een voorverwarmde thermocycler (30 ° C) met een voorverwarmde deksel bij 100 ° C.
- Voeg 5 ul Stop ligatiebuffer in elke reactie en meng.
- Meng 42,5 ul goed gemengde magnetische korrels om de reactie volgende stappen 2.1.1.5 tot 2.1.1.8 te reinigen. Voeg 50 ul resuspensiebuffer de adaptor-geligeerde product te elueren.
- Reinig de adaptor-geligeerde product een tweede maal met 50 pi goed gemengde AMPure XP kralen, en elueer het product in 25 gl resuspensiebuffer in een schone PCR buis.
2.1.4) Amplify DNA-fragmenten
- Voeg 5 ul PCR Primer Cocktail en 25 pi PCR Master Mix aan de PCR-buis met adapter geligeerde product en meng.
- Voer amplificatie in een voorgeprogrammeerde thermocycler onder de volgende omstandigheden: 98 ° C gedurende 30 seconden; 10 cycli van 98 ° C gedurende 10 sec, 60 ° C gedurende 30 seconden en 72 ° C gedurende 30 seconden; vervolgens 72 ° C gedurende 5 min en houden op 10 ° C.
- Ruim het reactiemengsel met 50 pi goed gemengde magnetische korrels, en elueer het eindproduct 30 gl resuspensiebuffer.
2.1.5) Bibliotheek Validation
- Kwantificeren van het eindproduct met behulp van een fluorometer protocol van de fabrikant. Bibliotheek uiteindelijke concentratie 2,5 tot 20 ng / ul.
- Beoordeel de kwaliteit van het eindproduct met behulp van een analytisch instrument High Sensitivity DNA-chip volgens het protocol van de fabrikant. Verwacht een enkele band met de verwachte grootte voor beide IGVHFR1, IGVHFR2 of IGVHFR3. UERWACHTE grootte van de bibliotheek product is gelijk aan de grootte van de oorspronkelijke VDJ amplicon plus de grootte van de adapters (~ 125 bp).
2.2) VDJ-PCR Bibliotheek Pooling en Sequencing
- Bereken de molariteit van elke bibliotheek fractie met de volgende formule: nM = [(ng / 1000) / 660 bp *] x 10 9 ng waarbij de concentratie van het VDJ-PCR bibliotheek gemeten in stap 2.1.5.1 bp en is de piek grootte van de VDJ-PCR bibliotheek gemeten in stap 2.1.5.2.
- Verdunnen de bibliotheek om 2 Nm (10 pi totaal) met DNase-vrij water.
- Combineer de 10 ul van de verdunde 2 nM bibliotheken samen in een 1,5 ml buis.
- Voeg een gelijk volume PhiX spike-controle in de 1,5 ml buis.
- Laad het zwembad van 07:00 concentratie op een doorstroomcel.
- Sequentie van de bibliotheken met behulp van een gepaarde-end 150 cyclus sequencer volgens het protocol van de fabrikant.
3. Data Analysis
Opmerking: Een summAry van de bioinformatica scripts gebruikt in deze sectie kan worden gevonden als een aanvullende code bestand.
3.1) Alignment en QC
- Kaart gepaarde-end sequencing leest tegen een mens IGH V, D en J regio databank gedownload van de IMGT website 11 met behulp van een aangepaste nucleotide BLAST-algoritme op basis van 'blastn' verkrijgbaar bij NCBI met gap geopend boete van 2, gap extension penalty van 1, woord lengte van 7, en e-drempelwaarde van 10 -4. Gooi de lees-pair niet in kaart zowel een IGH V en J regio.
- Tel de resterende lezen-paren die IGH V en J mappings moeten de frequenties van bijpassende VJ combinaties in alle gelezen paren verkregen uit de sequencing run op het monster te verkrijgen. Graaf een read-pair wanneer wordt toegewezen aan zowel een IGH V en J-gen en voeg het allel in de overeenkomstige telling voor de specifieke combinatie VJ.
- Rang de tellingen voor elk gecombineerd VDJ regio verkregen uit 3.1.2 van de hogeest tot het laagste. Het gebied VDJ heeft de hoogste leest telling wordt gedefinieerd als belangrijke omlegging combinatie.
- Gooi uitgelijnde sequenties die minder dan 35% van het domein grote omlegging die in 3.1.3 dekken.
3.2) SHM Profiel Identification
- Tel alle SHM patronen over de leest van stap 3.1.3. Definieer elke SHM patroon als een subkloon.
- Tel het aantal subklonen die overeenkomen met verschillende unieke SHM patronen, en het aantal gelezen die zijn toegewezen aan individuele subklonen.
3.3) grafische weergave van resultaten
- Voer de fylogenetische analyse van de subklonen met behulp van de bijbehorende SHM patronen met behulp van een wijk toetreden methode van R-pakket "aap" volgens het protocol van de fabrikant. Bereken een afstand matrix van de afzonderlijke verschillende uitlijningen de subkloon fylogenie verankerd aan de sequentie van de kiemlijn V opnieuwJ combinatie in kwestie voor elke gekoppelde sample set.
- Gebruik de nucleotidesequentie van elke subkloon als teken vector en berekent de geschatte tekenreeks afstand tussen alle subklonen in grote VJ omlegging voor zowel diagnose en bijbehorende recidief monsters met een Levenshtein afstandsmaat wanneer mathematisch de afstand tussen twee uitlijning wordt gegeven door d x, y (i, j) waarbij d x, y (i, j) = 1 indien i ≠ j en 0 anders, en som functie over de lengte van de tekenreeks overeenkomen met sequenties i en j nucleotide.
- Grafisch weer de resulterende matrix van subkloon afstanden en de bijbehorende subkloon tellingen in de volgende twee manieren:
- Gebruik R pakket "MASS" volgens het protocol van de fabrikant multidimensionale schaling toegepast op de subkloon afstandsmatrix en genereert een tweedimensionale coördinaten beginsel map, die vervolgens wordt uitgezet langs de logaritmevan subclonal geldt als de straal van de cirkel.
- Bouwen een ongerichte grafiek op basis van de Levenshtein afstand, waarbij de hoekpunten corresponderen met elke afzonderlijke subkloon die voortvloeien uit de grote VJ omlegging.
Opmerking: Als de afstand tussen twee verschillende klonen is gelijk aan dan bestaat er een grens tussen deze twee hoekpunten. Als de afstand groter is dan één, is er geen rand te verbinden. - Plot de grafiek van 3.3.3.2 met de tkplot functie in de "iGraph" R-pakket met de Kamada Kawai indeling volgens het protocol van de fabrikant. De straal van de hoekpunten is evenredig met de derde macht wortel van het aantal klonen in kaart gebracht worden gehouden en de arcering gebruikt een rode en blauwe bereik het aantal klonen dat ofwel tot de diagnose (blauw) of recidief (rood) monsters duiden .
3.4) Heterogeniteit (Entropy) Meting
- Onderzoekt de aantallen en subkloon tellingen van deindividuele patronen van somatische hypermutatie zich in grote VJ omlegging per gekoppelde set monsters.
- Bereken de empirische entropie en overgebleven empirische entropie gecorrigeerd voor het aantal afzonderlijke klonen in elk monster met behulp van de standaard histogram gebaseerde entropie schatting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De algemene procedure van VDJ sequencing (VDJ-seq), waaronder DNA-extractie, gerecombineerde VDJ regio amplificatie en zuivering, sequentiebepaling bibliotheekconstructie, leest verwerking en fylogenetische analyse is weergegeven in figuur 1. Routinematig 5-200 ug DNA kan worden opgehaald uit stijf bevroren weefselcoupes of 0,5-20 ug DNA uit formaline gefixeerde in paraffine ingebedde weefselcoupes. Afhankelijk van de kwaliteit, omlegging patroon en SHM mate van individuele monsters, kan een verscheidenheid van VDJ PCR producten van verschillende monsters verkregen (figuur 2), waaronder IGVHFR1 (310-380 bp), FR2 (250-295 bp), en FR3 (70-120 bp). Monsters waarvan alleen FR3 fragment verkrijgbaar door PCR VDJ werden uitgesloten van de overgebleven onderzoek door de korte product dat voldoende sequentie-informatie niet voorziet stroomafwaartse gegevensanalyse doel. Slechts monsters waarvan een belangrijke FR1 en FR2 PCR product kan worden gevisualiseerd op the agarosegel worden verwerkt tot sequencing bibliotheken te genereren. De opbrengst van de belangrijkste PCR product na gelzuivering varieert van 10 tot 50 ng in totaal.
De gehele gezuiverde PCR product werd gebruikt voor de volgende bibliotheekconstructie voor sequencing bibliotheek. Na adapter ligatie, elk monster krijgt zijn eigen unieke index. Tijdens bibliotheek amplificatie werden 10 cycli van PCR uitgevoerd waarbij meer dan 30 ng als definitief bibliotheekproducten kan opleveren. De bibliotheek kwaliteit werd geopend door een bioanalyzer. Zoals getoond in figuur 3, is er een enkel product in de bibliotheek monster met een afmeting verschuiving van ~ 125 bp vorm de originele VDJ PCR-amplicon waarin de bijkomende adapter. Voor elke sequencing run, werden 5-10 bibliotheken samengevoegd op 7 uM. Bovendien, vanwege de hoge sequentieovereenkomst tussen de VDJ PCR producten werd de bibliotheek pool gemengd met 50% PhiX spike in de complexiteit van de run en de correcte identificatie van de base waarborgenNa elke additionele cyclus sequencing. Bibliotheek DNA-fragmenten werd de sequentie van 150 bp aan beide uiteinden, waarbij het ophalen van voldoende sequentiegegevens spanning VD en DJ knooppunten voor FR1 fragmenten toelaat, en SHM mutatiepatronen voor fylogenetische analyse.
Eerder hebben we uitgevoerd VDJ sequencing op 32 DLBCL monsters verzameld op de diagnose en de terugval van de 14 patiënten (meerdere patiënten hadden meerdere monsters verzameld op een van beide diagnose of recidief stadium) met de voorwaarde hierboven 12 beschreven. Door het uitvoeren van de fylogenetische analyse van de SHM profielen van grote VHDJH herschikkingen tussen gepaarde monsters, een "Early-divergent" en "Late-divergent" -modus van klonale evolutie geassocieerd met DLBCL recidief geïdentificeerd 12. Hierin werd dezelfde benadering toegepast op een nieuw verzamelde DLBCL diagnose en terugval pair. De FR1 gebieden werden verkregen in beide monsters na PCR amplificatie. Een grote PCR-product met de grootte ongeveer 344 bp (gemeten met bioanalyzer) verkregen uit zowel de diagnose en de terugval monsters. Na sequentiebepaling leest totaal 0,70 miljoen gepaarde-end werden verkregen voor de diagnose monster en 0.730.000 gepaarde-end leest de terugval monster dat binnen het bereik van het aantal leest verkregen per monster in de eerdere studie waren (0.38- 1.420.000, gemiddeld 0,75 ± 0.260.000) 12. Na mapping gepaarde-end leest tegen IMGT databank staat dat geen hits in drie V hebben, werden D en J gebieden weggegooid. VHDJH regeling is toegewezen aan elke gepaarde-end lezen. Een totaal van 0.640.000 en 0.670.000 VHDJH kruispunten werden geïdentificeerd in de diagnose en terugval monsters respectievelijk, wat neerkomt op meer dan 90% uitlijning tarief. Door te tellen hoe vaak een combinatie van VHDJH werd gevonden in afzonderlijke monsters, 808 afzonderlijke VH </ sub> DJ H knooppunten gevonden in de diagnose monster en 581 afzonderlijke VHDJH knooppunten in de terugval monster. De dominante VHDJH junctie in beide monster IGHV4-34 * 2 IGHD5-5 * 01 * 01 IGHJ2 bevestigd dat ze klonaal verwant. Deze dominante VHDJH junction goed voor 97% van de totale toegewezen VHDJH knooppunt leest zowel de diagnose monster en de terugval monster.
Om de klonale evolutie van deze DLBCL terugval geval traceren fylogenetische analyse van de SHM profielen van grote VHDJH herschikkingen tussen dit paar diagnose en terugval monsters werd uitgevoerd. We zagen dat de klonale evolutie patroon van dit paar werd na de "Late-divergent" path (figuur 4), dat het subklonen van de diagnose en recidief tumoren geclusterd op dezelfde tak van de fylogenetische boom, en de dominantediagnose subkloon en de dominante terugval subklonen gedeeld vergelijkbaar SHM patroon met een paar extra mutaties voorgedaan in de terugval subkloon. Deze resultaten suggereren dat mogelijk was een subkloon van de diagnose tumor die ofwel chemo-resistente was of ontsnapt uit de behandeling, en dan uiteindelijk ontwikkeld tot terugval tumor.
Om verder te karakteriseren en te visualiseren klonale architectuur van elk samples en klonale evolutie patronen tijdens terugval proces, hebben twee nieuwe analyses ontwikkeld. In deze analyses werden de gehele set van subklonen van de belangrijkste VJ herschikking in elk monster gebruikt om de paarsgewijze draad afstand tussen alle subklonen zoals gedefinieerd door hun patronen van SHM berekenen. Vervolgens met behulp van meerdimensionale schalen (figuur 5A, 5B) of door het bouwen een ongerichte graaf (figuur 5C, 5D) zoals beschreven in Data Analysis, plots die de verspreiding en heterogeniteit van subklonen werden gecreëerd. Alsin figuur 4, de MDS plot vertoont veel minder diversiteit sequentie tussen grote subklonen in de late uiteenlopende gevallen (figuur 5A) dan in de vroege uiteenlopende gevallen (figuur 5B). Bovendien is de subklonen van de diagnose monster en het sub-klonen van de terugval monster in het begin divergerende geval compleet scheiden van elkaar vermelding het gebrek aan overeenstemming van de SHM patronen tussen deze tumoren hoewel zij hebben dezelfde VDJ herrangschikking . Ook de ongerichte grafieken in (figuur 5C) en (Figuur 5D) blijkt dat de verdeling van subkloon telt in de late divergerende geval (figuur 5C) verschilt van de eerste divergerende (Figuur 5D). De laatste heeft meer op de voorgrond, maar genetisch diverse grote klonen van diagnose tot terugval. Bovendien, het ontbreken van randen en kleinere subklonen verbindingen tussen de belangrijkste diagnose en terugval klonen in devroeg uiteenlopende geval (figuur 5D), tonen de diversiteit volgorde aard van de vroege uiteenlopende terugval geval.
Figuur 1:.. Stap voor stap stroomschema van het VDJ-seq benadering De totale procedure van VDJ sequencing wordt getoond Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve beelden van VDJ PCR amplicon producten. Gel beelden die de vertegenwoordiger IgVH-FR1 (linker paneel) en IgVH-FR2 (rechter paneel) PCR producten van DNA geëxtraheerd uit lymfoom patiënt monsters. Een PCR-product kon worden verkregen in Voorbeeld 5 waarschijnlijk door ofwel de laagDNA-monster kwaliteit of SHM bij primer sites die de PCR-reactie slechtzienden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. QC van VDJ PCR amplicon en daaropvolgende sequencing bibliotheek door bioanalyzer Vertegenwoordiger Bioanalyzer sporen van dezelfde VDJ amplicon voordat bibliotheek bouw (bovenste paneel) en na de bibliotheek bouw (onderste paneel). Let op de grootte verschuiving van 334 bp tot 459 bp vermelding van de toevoeging van de adapter. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Klonale evolutie analyse van een paar DLBCL diagnose en terugval monsters. Fylogenetische analyse van een diagnose-recidief DLBCL monsterparen met het "Late-divergent" klonale evolutie mode. De kleur tickers vertegenwoordigen de mutatie-status. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Nieuwe grafische methoden om klonale evolutie patronen visualiseren (A, B) Multidimensional scaling percelen integreren SHM profielen en subkloon tellingen van het monster paar A met de late-uiteenlopende terugval modus (A) en het monster paar B toont vroege uiteenlopende terugval mode. (B). De straal van de cirkels geven de telling van subcldie overeenkomt met een bepaalde SHM profiel en de kleuren die overeenkomen met de diagnose (blauw) monster of recidief (rood) monster. De X- en Y-as vertegenwoordigt de top 2 componenten van MDA. (C, D) Ongerichte grafieken van het monster paar A met de late-uiteenlopende terugval mode (C) en het monster paar B toont vroege uiteenlopende terugval modus (D). Randen komen overeen met twee SHM profielen met een string afstand van één letter scheiding en afgestudeerd shading (kleur schaal bar) met vermelding van het aandeel van de sequenties in kaart brengen om een bepaalde SHM profiel overeenkomt met de diagnose (rood) monster of recidief (geel) monster. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Door de bijna onbeperkt aantal herhalingen van de sequentie-informatie gecodeerd door VDJ herrangschikking en SHM de IGH locus van menselijke B-cellen, onderzocht de gehele IGH repertoire van high-throughput deep-sequencing bleek een efficiënte en volledige wijze te bakenen klonale worden en sub-klonale B-cel populaties. Bovendien kan deze strategie worden gebruikt om de klonale evolutiepad van B-cel tumorontwikkeling, vermindering en terugval studie door vergelijking van de klonale en sub-klonale architecturen van patiëntmonsters langs verschillende stadia van de ziekte verzameld. Hoewel amplificatie van geherrangschikte VDJ-sequenties uit basismonster DNA wordt gemakkelijk uitgevoerd in een laboratoriumomgeving met in de handel verkrijgbaar primers, de efficiëntie van de amplificatie is grotendeels afhankelijk van de kwaliteit van het monster DNA. Vooral DNA geëxtraheerd uit FFPE monsters vertoont lage amplificatie-efficiëntie, en vaak slechts kleine FR3 fragment met succes kan worden geamplificeerd uit dezesamples, waardoor ze ongeschikt zijn voor de daaropvolgende analyse. Aangezien onze studie hier beschreven werd ontworpen om de clonaliteit van B-cel lymfoom, een klonale ziekte met één of meerdere belangrijke klonen domineert de gehele tumor begrijpen we alleen verzameld en de sequentie van de belangrijkste VDJ-PCR product. Voor studies geïnteresseerd in catalogiseren van de gehele B-cel klonale populatie van bijvoorbeeld perifeer bloed, kan een groter deel van de gel die meerdere VDJ-PCR producten (meerdere banden of een uitstrijkje van de gel) bevat worden uitgesneden en gesequenced. Het is echter belangrijk erop te wijzen dat het niet mogelijk is de volledige geherrangschikt IGH repertoire vangen omdat bepaalde SHM kan op indien primers doel en beïnvloeden de amplificatie van deze VDJs. Bovendien is onlangs een commerciële assay direct koppelen IGH herrangschikking amplificatie en sequencing MiSeq ingevoerd. Deze test stroomlijnt monstervoorbereiding proces. Omdat niet alle tumormonsters kunnen genera zoutE de FR1 fragment, willen we toch waaronder gelelektroforese stap om het product van de PCR reactie voordat pooling monsters voor sequencing.
Sequencing 150 bp van beide einden van de VDJ fragment (totaal 300 bp sequentie-informatie) heeft de volgende voordelen: 1) 300 bp sequentie kan betrekking hebben op de meerderheid van de FR1 en het gehele FR2 fragment, verschaffen voldoende sequentie-informatie voor het identificeren VDJ herrangschikking en somatische hyper-mutaties; 2) Het platform biedt snelle sequencing turn-around tijd dat de gehele 300 cycli van VDJ-sequencing voltooit onder 48 uur; 3) Elke run maakt multiplexen tot 12 monsters en nog steeds behaalt ongeveer een miljoen gepaarde-end leest per monster uitgang. Omdat de hoge sequentieovereenkomst tussen klonen waaraan dezelfde VDJ herrangschikking, vooral bij B cel lymfoom monsters, is het essentieel om spike in 20-50% PhiX tijdens de sequencing run om nauwkeurig te bepalen base bellen matrix. Onlangs heeft de MiSeqsoftware is bijgewerkt om deze vraag te beantwoorden. Aanbevolen wordt slechts 5% PhiX piek in gebruik voor lage complexiteit bibliotheek sequencing. Echter, onze sequencing faciliteit inconsistent concentratie van de PhiX spike-controle DNA van de fabrikant dat de uitkomst van lage complexiteit sequencing in gevaar zou brengen ervaren. Daarom is in de huidige praktijk, gebruiken we nog steeds 10-20% PhiX spike-in voor de VDJ sequencing. Voor sequentiebepaling van het volledige perifere bloed B-cel repertoire, die normaal bevat een groot aantal verschillende VDJ regelingen is het mogelijk om de hoeveelheid PhiX spike in verminderen. Hoewel het aantal klonen en subklonen die van elk monster is positief gecorreleerd met het aantal leest gesequenced, half tot 1 miljoen gepaarde-end leest per monster voldoende klonale structuren klonale evolutiepatronen vergelijking tussen monsters en afleiden tussen monsters op verschillende ziektestadia van dezelfde patiënt 12. het ismogelijk dat PE 150 bp sequencing voldoende dekking van die lange FR1 fragmenten (dwz 350-380 bp) niet zou kunnen bereiken. In sommige gevallen kan sequentie-informatie van het D-segment niet verzameld of er wellicht niet voldoende sequentie-informatie over de V segment subklonen onderscheiden door SHMS zijn. Echter, met de opmars van de sequencing technologie, is het mogelijk geworden om langer te sequencen en bestrijkt de gehele FR1 amplicon.
Door sequencing van de IGH repertoire van B- cellen was het mogelijk om de expansie van afzonderlijke B-celklonen volgen en afleiden klonale evolutie in de loop van diagnose tot recidief. Met het gebruik van analyse van de populaties van subklonen gegenereerd door SHM patronen, konden we twee modi kankervooruitgang terugval onderscheiden door onderzoek van hun fylogenie. De nieuwste grafische voorstellingen met multidimensionale schaling percelen en ongerichte grafieken op basis van de Levenshtein afstand verder allow wij begrijpen 1) subclonal de samenstelling van elke tumor, 2) hoe individuele subklonen zijn aan elkaar, en 3) hoe elke subkloon zich ontwikkelt tijdens ziekteprogressie. Verder statistische analyse bleek dat deze fylogenetische structuren waren duidelijk verschillend en de subclonal populaties verschilden wat betreft hun heterogeniteit. Tenslotte kan de klonale evolutie traject verkregen door VDJ-sequencing goed gecorreleerd met genetische evolutie en gekenmerkt door hetzij exome of gerichte resequencing 12. Daarom combineert deze twee benaderingen heeft het potentieel om mutaties te identificeren bestuurder tijdens lymfomen en lymfoom recidief
Naast het definiëren van de B-cel repertoire IGH en sporenelementen klonale ontwikkeling van lymfoom progressie kan het VDJ-seq benadering eventueel worden gebruikt als een zeer gevoelige methode voor het volgen van minimale resten ziekte, bewaking tumor respons op therapieën, en mogelijk identificeren van de aanwezigheidvan resistente klonen. Een soortgelijke aanpak kan worden toegepast aan T-cellen T-cel receptor repertoire kaart, en kunnen worden gebruikt om immune surveillance reactie op kanker sonde. Bovendien kan VDJ-seq ook worden uitgevoerd in muizenmodellen gebruikmaking van primers beschikbaar van Hanna et al. 13 Het is te verwachten dat informatie die via deze benadering de komende jaren kan leiden tot een beter begrip van de dynamiek van tumorontwikkeling en uitbreiden van de kennis van het immuunsysteem en zijn rol bij de verdediging van het lichaam van tumorinvasie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR | 89125-170 | 200 proof, for molecular biology |
| TE buffer | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris·Cl, pH 8.0; 10 mM EDTA |
| Xylenes | VWR | EM-XX0055-6 | 500 ml |
| Proteinase K | Life Technonogies | 25530-015 | 100 mg |
| Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix | Promega | U1515 | 10 mM each nucleotide |
| 10x PCR Buffer | Roche | 11699105001 | Without MgCl2 |
| AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2 | Life Technonogies | 4311806 | 50 µl at 5 U/µl |
| Specimen Control Size Ladder | Invivoscribe Technologies | 2-096-0020 | 33 reactions |
| IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 - Gel Detection | Invivoscribe Technologies | 5-101-0030 | 33 reactions, Mix 2 for IGVHFR1 detection |
| IGH Gene Clonality Assay - Gel Detection | Invivoscribe Technologies | 1-101-0020 | 33 reactions, Tube B for IGVHFR2 detection |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | 20 µl at 5 U/µl |
| 10X Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer | Corning (cellgro) | 46-011-CM | 6x1 L |
| 50x TAE BUFFER | VWR | 101414-298 | 1 L |
| Ethidium bromide solution | Sigma-Aldrich | E1510 | 10 mg/ml |
| 25 bp DNA Ladder | Life Technologies | 10597011 | 1 µg/µl |
| 100 bp DNA Ladder | Life Technologies | 15628-019 | 1 µg/µl |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-500 | 500 g |
| 40% Acrylamide/Bis Solution | Bio-Rad Laboratories | 1610144 | 500 ml |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | 50 columns |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit | Life Technologies | Q32854 | |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| MiSeq | Illumina | ||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32872 | |
| Resuspension buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Ligation mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| DNA adaptor index (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| PCR primer cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Magnetic stand | Life Technologies | 4457858 | |
| Gel imaging system | Bio-Rad Laboratories | 170-8370 |
References
- Nowell, P. C. The clonal evolution of tumor cell populations. Science. 194 (4260), 23-28 (1976).
- Greaves, M., Maley, C. C.
- Ding, L., et al. Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing. Nature. 481 (7382), 506-510 (2012).
- Jiao, W., Vembu, S., Deshwar, A. G., Stein, L., Morris, Q. Inferring clonal evolution of tumors from single nucleotide somatic mutations. BMC bioinformatics. 15, 35 (2014).
- Schatz, D. G., Ji, Y. Recombination centres and the orchestration of V(D)J recombination. Nature reviews immunology. 11 (4), 251-263 (2011).
- Jacob, J., Kelsoe, G., Rajewsky, K., Weiss, U. Intraclonal generation of antibody mutants in germinal centres. Nature. 354 (6352), 389-392 (1991).
- Coiffier, B., et al. CHOP chemotherapy plus rituximab compared with CHOP alone in elderly patients with diffuse large-B-cell lymphoma. N Engl J Med. 346 (4), 235-242 (2002).
- Larouche, J. F., et al. Lymphoma recurrence 5 years or later following diffuse large B-cell lymphoma: clinical characteristics and outcome. J Clin Oncol. 28 (12), 2094-2100 (2010).
- Friedberg, J. W. Relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2011, 498-505 (2011).
- Gisselbrecht, C., et al. Salvage regimens with autologous transplantation for relapsed large B-cell lymphoma in the rituximab era. J Clin Oncol. 28 (27), 4184-4190 (2010).
- Lefranc, M. P. IMGT, the International ImMunoGeneTics Information System for Immunoinformatics : methods for querying IMGT databases, tools, and web resources in the context of immunoinformatics. Molecular biotechnology. 40 (1), 101-111 (2008).
- Jiang, Y., et al. Deep sequencing reveals clonal evolution patterns and mutation events associated with relapse in B-cell lymphomas. Genome biology. 15 (8), 432 (2014).
- Hanna, J., et al. Direct reprogramming of terminally differentiated mature B lymphocytes to pluripotency. Cell. 133 (2), 250-264 (2008).
