Abstract
Clonality tumor compreensão é fundamental para a compreensão dos mecanismos envolvidos na tumorigênese e progressão da doença. Além disso, a compreensão das alterações da composição clonais que ocorrem dentro de um tumor em resposta a certos micro-ambiente ou tratamentos podem levar à concepção de abordagens mais sofisticadas e eficazes para a erradicação de células de tumor. No entanto, o rastreamento tumorais clonais sub-populações tem sido um desafio devido à falta de marcadores distinguíveis. Para resolver este problema, um protocolo VDJ-seq foi criada para rastrear os padrões de evolução clonal de linfoma de grandes células B (LDGCB) recaída difusa, explorando VDJ recombinação e mutação somática (SHM), duas características únicas de linfomas de células B.
Neste protocolo, Next-Generation seqüenciamento (NGS) bibliotecas com potencial de indexação foram construídos a partir de cadeia pesada de imunoglobulina rearranjados amplificado (IgH) região VDJ de pares de diagnóstico primário e recaída samp DLBCLles. Em média, mais de meio milhão de sequências VDJ por amostra foram obtidos após o seqüenciamento, que contêm tanto VDJ e rearranjo informações SHM. Além disso, condutas bioinformatics personalizados foram desenvolvidos para utilizar completamente a informação de sequência para a caracterização de IgH-VDJ repertório dentro destas amostras. Além disso, a tubagem permite a reconstrução e comparação da arquitectura clonal de tumores individuais, o que permite o exame da heterogeneidade clonal dentro dos tumores de diagnóstico e dedução de padrões de evolução clonal entre o diagnóstico de tumor e pares de recaída. Ao aplicar essa análise para vários pares diagnóstico de recidiva, nós descobriu a evidência chave que múltiplos padrões evolutivos tumorais distintivo poderia levar a DLBCL recaída. Além disso, esta abordagem pode ser alargada a outros aspectos clínicos, tais como a identificação de doença residual mínima, monitorar o progresso recaída e resposta ao tratamento e investigação do repertório imunees em contextos não-linfoma.
Introduction
O câncer é uma doença clonal. Desde há trinta anos atrás, quando Peter Nowell C. propôs o modelo de evolução clonal câncer 1, muitos estudos têm tentado dissecar populações clonais dentro de amostras de tumores e reconstruir expansão e evolução padrões clonais que fundamentam o processo de tumorigênese 2. Recentemente, todo o seqüenciamento do genoma permitiu que os investigadores tomar um profundo olhar para a heterogeneidade clonal e evolução 3,4. No entanto, devido à falta de marcadores tratáveis em muitos tipos de células, é difícil deduzir a arquitectura clonal caminho preciso e evolutiva. Felizmente, existe um marcador clonality natural em células maduras B a partir do qual muitas doenças malignas linfóides, incluindo DLBCL, são originários. Em resposta a estimulação por antigénio, cada célula B pode formar uma única sequência de IgH VDJ produtiva juntando um H V (variável), um D (diversidade), e um J H (unir) segmento em conjunto a partir de um grande pool de estes segmentos. Durante este processo, pequenas porções da sequência original pode ser eliminado e nucleótidos não templated adicionais podem ser adicionados para criar um rearranjo VDJ única. Este rearranjo VDJ específica pode ser herdado em toda a descendência desta célula B, por conseguinte, a marcação de células B maduras individual e a sua prole 5. Além disso, SHM ocorre nas sequências de VDJ recombinados na reacção subsequente centro germinal (GC) para introduzir mutações adicionais para a expansão do conjunto de anticorpo e o aumento da afinidade do anticorpo 6. Portanto, comparando e contrastando padrões de amostras de linfoma que tenham sido submetidos a esses processos VDJ e SHM, heterogeneidade intra-tumoral pode ser delineada e caminho de evolução da doença clonal pode ser deduzida.
Anteriormente, VDJ e rearranjo SHM puderam ser identificados por PCR amplificar as regiões recombinadas, clonagem dos produtos de PCR, e subsequentemente a sequenciação de Sanger para obter informação sobre a sequência. Esta abordagem is de baixo rendimento e baixo rendimento, recuperando apenas uma pequena parte de todo o repertório de VDJ recombinadas, e impedindo a caracterização da representação global da população clonal dentro de uma dada amostra. A abordagem modificada foi criado por meio da geração NGS indexados bibliotecas de seqüenciamento dos produtos de PCR VDJ e realizando PE 2x150 bp seqüenciamento obter mais de meio milhão de sequências VDJ recombinadas por amostra. Além disso, uma tubagem personalizada foi desenvolvido para realizar o controlo de qualidade (QC), alinhar, VDJ filtro sequenciação leituras para identificar rearranjos e SHMS de cada leitura, e realizar a análise filogenética na arquitectura clonal de cada amostra. Além disso, uma nova abordagem foi estabelecida para caracterizar adicionalmente os padrões de evolução clonal para amostras recolhidas em vários estádios da doença.
Nós aplicamos essa técnica para amostras de pacientes LDGCB. DLBCL é uma forma agressiva de linfoma não-Hodgkin com recaídas freqüentes em até um thIRD dos pacientes 7. Recaídas LDGCB normalmente ocorrem no início, dentro de 2 a 3 anos do diagnóstico inicial, embora alguns ocorrem após 5 anos 8. O prognóstico para pacientes recidiva é pobre, com apenas 10% alcançar três anos sobrevida livre de progressão devido a opções de tratamento limitadas. Esta é a base para a necessidade urgente de novas abordagens para o tratamento de DLBCL recaída 9,10. No entanto, os mecanismos moleculares associados com DLBCL recaída são ainda desconhecidos. Em particular, o papel da heterogeneidade clonal no momento do diagnóstico e evolução clonal durante DLBCL desenvolvimento recaída são atualmente descaracterizado, o que torna difícil definir um biomarcador preciso e útil para predizer recaída. Para abordar essas questões, nós aplicamos nossa abordagem VDJ-sequenciação de múltiplos pares de pares combinados de amostra DLBCL diagnóstico de recidiva primária. Dois cenários evolutivos clonais distintos de recaída surgiu a partir da comparação dos arquiteturas clonais entre o diagnóstico e samp recaídales sugere que vários mecanismos moleculares podem estar envolvidos na DLBCL recaída.
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Protocol
1. VDJ Amplification
1.1) a extração de DNA a partir de amostras de tumores
- Extrair DNA de cortes finos (10-20 um) de PTU tecidos normais ou malignas embutidos congelados.
- Digerir 10-30 secções finas de tecido embebido corte por micrótomo criostato um em 4 ml de tampão de lise Nucleico (0,0075 M Tris-HCl, pH 8,2; NaCl 0,3 M; 0,002 M Na2EDTA) com proteinase K (0,5 mg / ml, concentração final ) e 0,625% de SDS num tubo de centrífuga de 15 ml num banho de água a 37 C ° durante a noite.
- Adicionar 1 ml de solução saturada de NaCl (5 M) à mistura de digestão e agitar vigorosamente durante 15 segundos.
- Centrifugar a 1.100 xg durante 15 min à temperatura ambiente.
- Transferir o sobrenadante para um novo tubo de centrífuga de 15 ml e adicionar dois volumes de etanol a 100%.
- Misture invertendo o tubo 6-8 vezes. Centrifugar a 5.000 xg durante 60 min a 4 ° C para recolher o precipitado de ADN.
- Lava-se a pelete de ADN duas vezes com etanol a 70%. Centrifuge a 5000 xg durante 15 min de cada vez para recolher o sedimento.
- Dissolve-se o ADN em tampão de TE 100-400 uL à temperatura ambiente durante a noite num agitador. O rendimento de DNA é de 5 a 200 ug (concentração final entre 50-500 ng / mL), dependendo do tamanho do tecido
- Extrair DNA de cortes finos (10-20 um) de, incorporado (FFPE) tecido normal ou maligno incluídas em parafina fixado em formalina.
- Incubar secções de parafina em 1 ml de xileno duas vezes à temperatura ambiente, durante 10 min de cada vez, em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml de de-paraffinize. Recolher as secções de tecido por centrifugação a 13000 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
- Incubar secções em 1 ml de etanol a 100% à temperatura ambiente duas vezes, 10 min cada vez, para remover xilenos resíduos. Recolher as secções de tecido por centrifugação a 13000 xg durante 5 min à temperatura ambiente. A parafina é completamente dissolvido neste momento e apenas a secção de tecido é restante.
- Secar as seções em te quartomperatura por 10-15 min.
- Adicione uma solução / ml de Proteinase K a 0,5 mg, com tampão de PCR 1x (diluído a partir de tampão de PCR 10x com água livre de nuclease). Adicionar a solução de proteinase K para as amostras num volume final de 50-100 ul e incubar durante a noite a 37 ° C.
- Aquecer as amostras a 95 ° C durante 10 min para inactivar proteinase K.
Nota: Neste passo, o ADN da amostra é dissolvida num tampão de PCR e pode ser utilizado nos passos 1.2 e 1.3 directamente. O rendimento de ADN é de 0,5 a 20 ug (concentração final entre 10-200 ng / mL), dependendo do tamanho do tecido.
1.2) Avaliação da Qualidade DNA
- Misture 0,25 ul DNA polimerase Taq com 45 ul de mistura principal do kit de escada comercial em um tubo de PCR.
- Adicionar 5 uL de ADN preparado a partir 1.1.1.7 1.1.2.5 ou no tubo de PCR e misturar bem por pipetagem para cima e para baixo por, pelo menos, 5 vezes.
- Use as seguintes condições para amplificar o ADN: 95 ° C durante7 min; seguido por 35 ciclos de 45 seg a 95 ° C, 45 s a 60 ° C, e 90 seg a 72 ° C; em seguida 72 ° C durante 10 minutos e mantenha a 15 ° C.
- Preparar um gel de agarose a 2% em TBE (Tris / borato / EDTA).
- Misturar 20 uL da reacção de PCR com corante de carga 6x 4 ul, e carrega-se num gel de agarose a 2%.
- Corar o gel de agarose com 0,5 ug ml de brometo de etídio solução / e detectar os produtos de PCR com um sistema de gel de imaginar. Observação: as amostras que produzem produtos de PCR em 5 tamanhos de 100, 200, 300, 400, e 600 pb será continuado para gerar produtos de amplificação VDJ.
CUIDADO: O brometo de etídio é um agente mutagênico potente. Por favor, manipular com muito cuidado através do uso de protetor de artes, isto é, luvas, e dispor em recipientes específicos por diretrizes da instituição.
1.3) VDJ PCR
1.3.1) Segmento Amplify recombinados IgH VDJ do Framework Região 1 (IgVHFR1)
- Misture master mix 45 ul da etiqueta do tuboEd como "mistura de 2" de uma célula somática IGH Hipermutação Ensaio para a Detecção de Gel kit comercial, 0,25 ul ADN-polimerase Taq, e 5 ul de amostra de ADN preparado a partir 1.1.1.7 1.1.2.5 ou em um tubo de PCR.
- Use as seguintes condições para amplificar o ADN: 95 ° C durante 7 min; seguido por 35 ciclos de 45 seg a 95 ° C, 45 s a 60 ° C, e 90 seg a 72 ° C; em seguida 72 ° C durante 10 minutos e mantenha a 15 ° C.
- Resolver o produto de PCR todo em um 2% de gel de agarose por electroforese.
- Corar o gel de agarose com 0,5 ug ml de brometo de etídio solução / e detectar os produtos de PCR com um sistema de imagem em gel. Um anticorpo monoclonal é amplicão esperado com a gama de tamanhos de 310-380 pb.
- Extirpar a parte de gel contendo o fragmento amplificado monoclonal entre 310-380 pb.
- Purifica-se o ADN a partir de gel excisado utilizando um kit de extracção de Gel padrão de acordo com o protocolo do fabricante. Nota: para amostras que FR1 fragmentos poderiam ser obtidos, não há nenhuma necessidade de se amplamente IgVHFR2 e IgVHFR3.
1.3.2) Segmento Amplify recombinado de IgH de estrutura da região VDJ 2 (IgVHFR2)
- Misturar mistura principal 45 ul do tubo rotulado como "Tubo B" de um comercial IGH Gene clonalidade Ensaio para a Detecção de kit Gel, 0,25 ul ADN-polimerase Taq, e 5 ul de ADN da amostra preparada a partir 1.1.1.7 1.1.2.5 ou em um tubo de PCR .
- Use as seguintes condições para amplificar o ADN: 95 ° C durante 7 min; seguido por 35 ciclos de 45 seg a 95 ° C, 45 s a 60 ° C, e 90 seg a 72 ° C; em seguida 72 ° C durante 10 minutos e deixar a 15 ° C.
- Resolver o produto de PCR todo em um 2% de gel de agarose por electroforese.
- Visualizar produto de PCR (s) por 0,5 ug ml de brometo de etídio de coloração /. Um amplicão monoclonal pode ser observada dentro da gama de tamanhos de 250-295 pb.
- Extirpar a parte de gel contendo o fragmento amplificado monoclonal entre 250-295 pb.
- Purifica-se o ADN a partir de gel excisado utilizando um extracto de gel padrãoKit de iões de acordo com o protocolo do fabricante.
1.4) Optimize VDJ PCR
- Use as seguintes condições de PCR modificados para amplificar IgVHFR1 e IgVHFR2 utilizando ADN sub-óptima: 95 ° C durante 7 min, 40 ciclos de 95 ° C durante 60 seg, 60 ° C durante 60 segundos, e 72 ° C durante 90 seg, extensão final a 72 ° C durante 10 min.
2. VDJ Amplicon Biblioteca Preparação e Sequencing
2.1) Preparação da biblioteca
2.1.1) Fim-de reparação
- Transfira produto PCR VDJ, de 1,3 em um tubo de PCR e adicionar Resuspension tampão de amostra de ADN Preparação Kit para abrir o volume para 60 mL.
- Adicionar 40 ul de Reparação End Mix Kit de Preparação de Amostras de DNA e misture bem.
- Incubar a reacção a 30 ° C durante 30 minutos num termociclador pré-aquecido (30 ° C) com uma tampa pré-aquecido a 100 ° C.
- Misturar 136 ul de contas magnéticas e 24 ul de PCR grade água primeiro em um tubo de 1,5 ml, em seguida, transferir a reacção de toda extremidade de 2.1.1.3-reparação no tubo de 1,5 ml e misture bem com a solução de grânulos.
- Colocar os tubos em um suporte magnético durante 2 min para permitir a separação das esferas da solução. Aspirar o sobrenadante e lavar as contas com 80% fresco preparado EtOH duas vezes enquanto o tubo está no suporte magnético.
- Aspirar a solução de etanol completamente e permitir que as esferas secar ao ar durante 15 min à temperatura ambiente durante 15 min.
- Tome tubo fora do carrinho e re-suspenda as esferas magnéticas em 17,5 ul Resuspension Buffer.
- Tubos lugar de volta no suporte magnético por 2 min a esferas separadas do Resuspension buffer. Remover o tampão de ressuspensão (End-reparação produto é ressuspenso no tampão de ressuspensão agora) num tubo de PCR limpo.
2.1.2) A-tailing
- Adicionar 12,5 ul mix A-tailing para dentro do tubo de PCR contendo End-Conserto do produto e misture bem. Incubar o tubo de PCR a 37 ° C durante 30 minutos num termociclador pré-aquecido (37 ° C) com uma tampa pré-aquecida a 100 ° C.
2.1.3) Adaptor Ligation
- Adicionar 2,5 mL Resuspension Buffer, 2,5 ul Ligation Mix, e 2,5 l DNA Index Adaptor na reacção seguindo-A.
- Incubar a reacção a 30 ° C durante 30 MINL num termociclador pré-aquecido (30 ° C) com uma tampa pré-aquecido a 100 ° C.
- Adicionar 5 mL Parar Ligation tampão em cada reação e misture bem.
- Misture 42,5 esferas magnéticas ul bem misturadas para limpar a reação seguinte etapas 2.1.1.5 a 2.1.1.8. Adicionar 50 ul de tampão de ressuspensão para eluir o produto ligado-adaptador.
- Limpar o produto ligado do adaptador por uma segunda vez, utilizando 50 ul bem misturada grânulos AMPure XP, e elui-se o produto em 25 ul de tampão de ressuspensão para um tubo de PCR limpo.
2.1.4) fragmentos de DNA Amplify
- Adicionar 5 mL PCR Primer Cocktail e 25 ul PCR Master Mix ao tubo de PCR contendo produto ligado adaptador e misture bem.
- Efectue a amplificação num termociclador pré-programado com as seguintes condições: 98 ° C durante 30 seg; 10 ciclos de 98 ° C durante 10 seg, 60 ° C durante 30 seg e 72 ° C durante 30 seg; em seguida 72 ° C durante 5 min e manter a 10 ° C.
- Limpar a reacção, usando 50 ul de contas magnéticas bem misturadas, e elui-se o produto final em 30 ul de tampão de ressuspensão.
2.1.5) Biblioteca de Validação
- Quantificar o produto final com um fluorómetro utilizando o protocolo do fabricante. Biblioteca concentração final situa-se entre 2,5 a 20 ng / ul.
- Avaliar a qualidade do produto final por meio de um instrumento analítico com chip de ADN alta sensibilidade de acordo com o protocolo do fabricante. Esperar uma única banda com o tamanho esperado para qualquer IGVHFR1, IGVHFR2 ou IGVHFR3. Texpected tamanho da biblioteca de produto é igual ao tamanho do fragmento amplificado VDJ original mais o tamanho dos adaptadores (~ 125 pb).
2.2) VDJ-PCR Biblioteca Pooling e Sequencing
- Calcula-se a molaridade de cada fracção da biblioteca utilizando a seguinte fórmula: = nM [(ng / 1,000) / * 660 pb] x 9 10 em que ng é a concentração da biblioteca de VDJ-PCR medida no passo 2.1.5.1 e pb é o pico tamanho da biblioteca VDJ-PCR medida no passo 2.1.5.2.
- Diluiu-se a biblioteca a 2 nM (10 ul total) com água sem ADNase.
- Combinar os 10 ul da diluídos bibliotecas 2 nM em conjunto num tubo de 1,5 ml.
- Adicionar um volume igual de controlo de pico phix-in para o tubo de 1,5 ml.
- Carregue o piscina na concentração 7:00 em uma célula de fluxo.
- Sequenciar as bibliotecas usando um sequenciador de ciclo combinado-end 150 de acordo com o protocolo do fabricante.
Análise 3. Dados
Nota: A summary dos scripts de bioinformática utilizados nesta secção podem ser encontrados como um Documento Suplementar código.
3.1) Alinhamento e QC
- Mapa emparelhados-end seqüenciamento lê contra um IGH humano V, D e banco de dados região J baixado do site da IMGT 11 utilizando um algoritmo explosão de nucleótidos adaptada com base em 'blastn' disponível a partir de NCBI com gap open penalty de 2, lacuna extensão penalidade de 1, comprimento de palavra de 7, e de e-valor limiar de 10 -4. Descarte a-par ler não mapeia para tanto um IGH V e uma região J.
- Contar as restantes pares de ler que têm IGH V e J mapeamentos para obter as frequências das correspondentes combinações VJ em todos ler pares obtidos a partir do sequenciamento corrida na amostra. Contagem de um par de leitura se está mapeado para um tanto CMI V e J do gene, e, em seguida, adicionar o seu alelo para a contagem correspondente para a combinação particular de VJ.
- Posição as contagens para cada região recombinados VDJ obtido a partir 3.1.2 do altoEst para o menor. A região VDJ tem a maior contagem de lê é definido como importante concentração de rearranjo.
- Descartar sequências alinhadas, que cobrem menos do que 35% do rearranjo importante domínio identificado em 3.1.3.
3.2) SHM perfil Identificação
- Contagem de todos os padrões de SHM em todo o lê a partir do passo 3.1.3. Definir cada padrão SHM como um subclone.
- Contar o número de subclones que são correspondentes aos diferentes padrões únicos SHM, e o número de leituras que são mapeados para os subclones individuais.
3.3) representação gráfica dos resultados
- Realizar a análise filogenética nos subclones utilizando seus correspondentes padrões SHM usando um bairro método de pacote R "macaco" juntar de acordo com o protocolo do fabricante. Calcule uma matriz de distância dos alinhamentos distintos individuais para recriar a filogenia subclone enraizada para a sequência da linha germinativa do VJ combinação em questão para cada conjunto de amostras pareadas.
- Utilizar a sequência de nucleótidos de cada subclone como vetor de caracteres e calcular a distância cadeia aproximada entre todos os subclones no grande rearranjo VJ tanto para o diagnóstico e amostras de recaída correspondentes, utilizando uma medida de distância Levenshtein onde matematicamente a distância entre dois alinhamentos é dado por d x, y (i, j), onde d x, y (i, j) = 1 se i ≠ j e 0 em contrário, e depois resumir esta função ao longo do comprimento da cadeia de caracteres correspondendo a sequências de nucleótidos que i e j.
- Graficamente exibir a matriz resultante das distâncias subclone e suas contagens subclone correspondentes nas duas formas seguintes:
- Usar o pacote R "em massa" de acordo com o protocolo do fabricante para aplicar escalonamento multidimensional para a matriz de distância subclone e gerar um princípio bidimensional coordenadas do mapa, o qual é então marcados ao longo com o logaritmocontagens de subclonal como o raio do círculo.
- Construir um grafo não direcionado com base na distância de Levenshtein, onde os vértices correspondem a cada subclone distinta resultante da grande rearranjo VJ.
Nota: Se a distância entre dois clones distintos é igual a um, então existe uma aresta entre estes dois vértices. Se a distância é maior do que um, então não há nenhuma aresta ligando-os. - Traçar o gráfico de 3.3.3.2 utilizando a função tkplot no "IGRAPH" pacote de R com o layout Kamada Kawai de acordo com o protocolo do fabricante. O raio dos vértices é proporcional à raiz cubos de o número total de clones mapeado para ele e o sombreamento usa um intervalo de vermelho e azul para indicar a percentagem de clones que podem pertencer ao diagnóstico (azul) ou recaída (vermelho) amostras .
3.4) A heterogeneidade Entropia) Medição (
- Examine os números e contagem do subclonepadrões individuais de hipermutação somática que ocorrem na maior rearranjo VJ emparelhado para cada conjunto de amostras.
- Calcular a entropia empírica e entropia empírica residual ajustada para o número de clones distintos em cada amostra, utilizando a estimativa do histograma de entropia com base padrão.
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Representative Results
O procedimento geral de VDJ sequenciação (VDJ-SEQ), incluindo a extracção de ADN, amplificação da região VDJ recombinados e a purificação, a construção da biblioteca de sequenciação, lê-se o processamento e análise filogenética, é representado na Figura 1. Rotineiramente 5-200 ug de ADN pode ser recuperado a partir de secções de tecido congelado ou 0,5-20 ug de ADN de secções de tecido fixado em formol e embebidos em parafina. Dependendo da qualidade, padrão de rearranjo, e SHM grau de amostras individuais, uma variedade de produtos de PCR de VDJ de diferentes amostras pode ser obtido (Figura 2), incluindo IGVHFR1 (310-380 pb), FR2 (250-295 pb), e FR3 (70-120 pares de bases). As amostras para as quais apenas FR3 fragmento podem ser obtidos a partir de VDJ de PCR foram excluídos do estudo remanescente devido à curta produto que não fornece quantidade suficiente de informação de sequência para a finalidade da análise dos dados a jusante. Apenas amostras dos quais um grande produto ou FR1 FR2 PCR podem ser visualizadas no the em gel de agarose são processados para gerar bibliotecas de sequenciação. O rendimento do principal produto de PCR após purificação em gel varia entre 10 e 50 ng no total.
Todo o produto de PCR purificado foi utilizado para a construção da biblioteca para subsequente sequenciação biblioteca. Depois de adaptador de ligação, cada amostra obtenha seu próprio índice exclusivo. Durante a amplificação de biblioteca, 10 ciclos de PCR foram realizados, que poderia produzir mais do que 30 ng de biblioteca como produtos finais. A qualidade biblioteca foi acessada por um Bioanalyzer. Como mostrado na Figura 3, há um produto único na amostra biblioteca com uma mudança de tamanho de ~ 125 pb formar o produto de PCR inicial amplicão VDJ indicando o adicional de adaptador. Para cada execução seqüenciamento, 5-10 bibliotecas foram agrupados em 7 M. Além disso, devido à elevada semelhança de sequências entre os produtos de PCR VDJ, o pool da biblioteca foi misturado com 50% phix pico-se para assegurar a complexidade da execução e identificação correcta da baseadicional depois de cada ciclo de sequenciação. Fragmentos de ADN da biblioteca foram sequenciados para 150 pb em ambas as extremidades, o que permite a recuperação de uma quantidade suficiente de informação de sequência que abrange VD e DJ junções para os fragmentos FR1, e padrões de mutação SHM para análise filogenética.
Anteriormente, foi realizada VDJ seqüenciamento em 32 amostras coletadas no momento do diagnóstico LDGCB e recaída de 14 pacientes (vários pacientes tinham várias amostras coletadas em cada diagnóstico ou estágio recaída), utilizando a condição descrita acima de 12. Ao realizar a análise filogenética dos perfis SHM das grandes rearranjos V H DJ H entre as amostras pareadas, uma "Early-divergente" e um modo de "Late-divergente" da evolução clonal associada com DLBCL recaída foram identificados 12. Aqui, a mesma abordagem foi aplicada a um diagnóstico DLBCL recentemente recolhido e par recaída. As regiões FR1 foram obtidos em ambas as amostras após PAmplificação CR. Um dos principais produtos PCR com o tamanho em torno de 344 pb (medido por Bioanalyzer) foi obtido a partir de tanto o diagnóstico e as amostras de recaída. Após sequenciação, um total de 0,70 milhões emparelhado-fim leituras foram obtidos para a amostra de diagnóstico e 0,73 milhões emparelhado lê-fim para a amostra de recidiva, que estavam dentro da gama do número de leituras obtidas por amostra no estudo anterior (0.38- 1.420.000, média 0,75 ± 0,26 milhões) 12. Após o mapeamento emparelhado-fim lê base de dados contra IMGT, lê-se que não tem acessos em todas as três regiões V, D e J foram descartados. Arranjo VH DJ H foi atribuído a cada leitura emparelhada-fim. Um total de 0,64 milhões e 0,67 milhões de VH junções DJ H foram identificados nas amostras de diagnóstico e de recaída, respectivamente, o que representa mais do que 90% de taxa de alinhamento. Ao contar quantas vezes cada combinação de V H DJ H foi encontrada em amostras individuais, 808 distinta V H </ sub> junções DJ H foram encontrados na amostra de diagnóstico e distintas junções 581 V H H DJ na amostra recaída. A junção V H DJ H dominante em ambos amostra é IGHV4-34 * 2 IGHD5-5 * 01 * 01 IGHJ2, confirmando que eles são clonalmente relacionada. Esta junção V DJ H H dominante responsável por 97% de toda a junção mapeado V DJ H H lê tanto na amostra de diagnóstico e a amostra de recaída.
Para traçar a evolução clonal deste caso recaída DLBCL, foi realizada a análise filogenética dos perfis SHM das grandes rearranjos V H DJ H entre este par de diagnóstico e de recaída amostras. Observou-se que o padrão de evolução clonal desta dupla estava seguindo o caminho "Late-divergente" (Figura 4), que os subclones dos tumores de diagnóstico e de recaída agrupadas no mesmo ramo da árvore filogenética, ea dominantesubclone diagnóstico e os subclones de recaída dominantes compartilhados padrão semelhante SHM com algumas mutações adicionais ocorreu no subclone recaída. Estes resultados sugerem que, potencialmente, houve um subclone no tumor diagnóstico que era ou resistente a quimio ou escapou do tratamento e, em seguida, eventualmente, o tumor desenvolveu-se em recaída.
Para caracterizar adicionalmente e visualizar arquitectura clonal de cada amostra e padrões evolução clonal durante o processo de recaída, duas novas análises foram desenvolvidos. Nestas análises, todo o conjunto de subclones do rearranjo importante VJ em cada amostra foram utilizadas para calcular a distância entre a corda de pares todos subclones como definidas pelos seus padrões de SHM. Em seguida, utilizando escalonamento multidimensional (Figura 5A, 5B), ou através da construção de um gráfico de não-dirigida (Figura 5C, 5D), como descrito na análise dos dados, foram criados tramas que representam a distribuição e a heterogeneidade de subclones. Comoilustrado na Figura 4, a trama MDS exibe diversidade de sequências muito menos importantes entre subclones no final dos casos divergentes (Figura 5A) do que no início dos casos divergentes (Figura 5B). Além disso, os sub-clones da amostra de diagnóstico e os sub-clones da amostra recaída no caso divergente início de separar completamente uma da outra, indicando a falta de semelhança entre os padrões SHM entre estes tumores, embora eles carregam o mesmo rearranjo VDJ . Da mesma forma, os gráficos não dirigidos em (Figura 5C) e (Figura 5D), que mostram a distribuição das contagens subclone no caso divergente tarde (Figura 5C) difere do divergente precoce (Figura 5D). Este último tem mais proeminentes, mas geneticamente diversas grandes clones a partir do diagnóstico para a recaída. Além disso, a falta de arestas e subclones menores ligações entre as grandes clones de diagnóstico e na recaídacedo caso divergente (Figura 5D), demonstram a natureza da diversidade de sequências caso divergente recidiva precoce.
Figura 1:.. Passo a passo fluxograma da abordagem VDJ-seq O procedimento geral de VDJ seqüenciamento é mostrada Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens representativas de produtos amplicon VDJ PCR. Gel imagens que mostram o representante IgVH-FR1 (painel da esquerda) e IgVH-FR2 (painel direito) Os produtos de PCR a partir de DNA extraído a partir de amostras de doentes com linfoma. Um produto de PCR não poderia ser obtida na Amostra 5 provavelmente devida quer ao baixoqualidade do DNA da amostra ou SHM em locais de primers que dificultaram a reação de PCR. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:., QC do fragmento amplificado por PCR e VDJ biblioteca por sequenciação subsequente Bioanalyzer representativas Bioanalyzer traça da mesma amplicão VDJ antes da construção da biblioteca (painel superior) e depois de a construção da biblioteca (painel inferior). Observe a mudança de tamanho, de 334 pb, para 459 pb, indicando a adição do adaptador. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise de evolução clonal de um par de LDGCB de diagnóstico e de recaída amostras. A análise filogenética de um par amostra DLBCL diagnóstico de recidiva mostrando o modo de evolução clonal "Late-divergente". Os tickers cor representa o estado de mutação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Novos métodos gráficos para visualizar padrões de evolução clonais (A, B) parcelas escalonamento multidimensional integrando perfis SHM e contagens subclone da par amostra A mostrando o modo de recaída late-divergente (A) e um par amostra B mostrando modo de recidiva precoce-divergente. (B). O raio dos círculos indicam a contagem de subclaqueles correspondentes a um determinado perfil SHM e cores correspondentes ao diagnóstico (azul) da amostra ou recaída (vermelho) da amostra. Os X e Y eixos representam as 2 principais componentes do MDA. (C, D) sem direção de gráficos par amostra A mostrando o modo de fim de recaída divergente (C) e um par amostra B mostrando modo de recidiva precoce-divergente (D). Edges correspondem a dois perfis de SHM que têm uma distância corda de uma separação carta e graduou sombreamento (cor escala bar) indicando a proporção de sequências de mapeamento para um determinado perfil SHM correspondente ao diagnóstico (vermelho) da amostra ou recaída (amarelo) da amostra. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Devido ao número quase ilimitado de iterações de informação sobre a sequência codificada por VDJ rearranjo e SHM no locus IGH de células B humanas, exame de todo o repertório de CMI por high-throughput-sequenciação profunda provou ser uma maneira eficiente e abrangente para delinear clonal e populações sub-clonais de células-B. Além disso, esta estratégia pode ser usada para estudar o caminho do desenvolvimento evolução clonal de células B do tumor, remissão, e recaída comparando as arquitecturas clonais e sub-clonais de amostras recolhidas de pacientes ao longo de várias fases da doença. Embora a amplificação de sequências de VDJ rearranjadas de amostra de ADN primário é prontamente realizada num ambiente de laboratório utilizando iniciadores comercialmente disponíveis, a eficiência de amplificação é em grande parte dependente da qualidade da amostra de ADN. Em particular, o ADN extraído de amostras de FFPE exibe uma baixa eficiência de amplificação, e muitas vezes apenas o pequeno fragmento FR3 pode ser amplificado com sucesso a partir destasamostras, tornando-os impróprios para posterior análise. Dado que o nosso estudo aqui descrito foi concebido para compreender a clonalidade de linfoma de células B, que é uma doença clonal com um ou vários grandes clones de dominar todo o tumor, que só recolhido e sequenciado o produto principal VDJ-PCR. Para estudos interessados em catalogar toda a população clonal de células B de, por exemplo, do sangue periférico, uma maior porção do gel que contém vários produtos VDJ-PCR (várias bandas ou uma mancha no gel) podem ser excisados e sequenciados. No entanto, é importante salientar que não é possível para capturar todo o repertório IGH rearranjadas, porque certos SHM pode ocorrer no alvo onde iniciadores e prejudicar a amplificação destes VDJs. Além disso, recentemente, um ensaio comercial acoplamento directo amplificação rearranjo IGH e MiSeq sequenciação foi introduzido. Este ensaio agiliza processo de preparação da amostra. No entanto, uma vez que nem todas as amostras de tumor seria capaz de géneroste o fragmento FR1, ainda recomendamos incluindo a etapa de eletroforese em gel de verificar o produto da reação de PCR antes reunindo amostras para seqüenciamento.
A sequenciação de 150 pb de ambas as extremidades do fragmento de VDJ (total de informação de sequência de 300 pb) tem as seguintes vantagens: 1) 300 pb de sequenciação pode cobrir a maior parte da FR1 e todo o fragmento de FR2, fornecem uma ampla informação de sequência para identificar VDJ rearranjo e somáticas hiper-mutações; 2) A plataforma fornece sequenciamento rápido tempo de rotação que completa toda a 300 ciclos de VDJ-seqüenciamento sob 48 h; 3) Cada execução permite a multiplexação de até 12 amostras e ainda atinge cerca de um milhão emparelhados-end leituras por exemplo de saída. Porque a elevada semelhança de sequências entre clones que transportam o mesmo rearranjo VDJ, especialmente em amostras de linfoma de células B, é fundamental para cravar-in 20-50% phix durante o seqüenciamento de execução para permitir definir com precisão de base chamando matriz. Recentemente, o MiSeqsoftware foi atualizado para abordar esta questão. Recomenda-se usar o mínimo de 5% phix spike-in para baixo seqüenciamento biblioteca complexidade. No entanto, o nosso serviço de sequenciação tem experimentado concentração inconsistente do controle DNA spike-in phix fornecido pelo fabricante que possa comprometer o resultado do seqüenciamento baixo complexidade. Portanto, na prática atual, nós ainda usamos 10-20% phix spike-in para o seqüenciamento VDJ. Para a sequenciação de todo o repertório de células B de sangue periférico, a qual contém normalmente um grande número de diferentes disposições VDJ, é possível reduzir a quantidade de pico-phix em. Embora o número de clones e subclones identificadas de cada amostra é positivamente correlacionada com o número de leituras sequenciado, metade de um milhão de emparelhados-end leituras por amostra é suficiente para comparar as estruturas clonais entre amostras e deduzir padrões de evolução clonais entre amostras coletadas em diferentes estádios da doença do mesmo paciente. 12 isto épossível que PE 150 pb seqüenciamento pode não atingir a cobertura suficiente desses fragmentos FR1 longos (ou seja, 350-380 bp). Em alguns casos, informação da sequência do segmento D pode não ser recolhido ou pode não ser suficiente informação sobre a sequência no segmento V do diferenciar subclones por SHMS. No entanto, com o avanço das tecnologias de sequenciação, tornou-se possível sequenciar mais e abrange todo o amplicão FR1.
Através da sequenciação do IGH repertório das células B, foi possível controlar a expansão dos clones de células B individuais e inferir a evolução clonal ao longo de diagnóstico para recaída. Com o uso de análise sobre as populações de subclones gerados por padrões SHM, fomos capazes de diferenciar dois modos de progressão do câncer a recaída examinando suas filogenias. As últimas representações gráficas usando parcelas de escalonamento multidimensional e gráficos sem direção com base na distância Levenshtein mais alloW-nos para compreender 1) a composição subclonal de cada tumor, 2) como subclones individuais estão relacionadas entre si, e 3) como cada subclone evolui durante a progressão da doença. Além disso, a análise estatística mostrou que estas estruturas filogenéticas eram claramente diferentes e que as populações subclonal diferiam no que se refere à sua heterogeneidade. Finalmente, a trajetória evolução clonal obtido por VDJ-seqüenciamento pode ser bem correlacionado com a evolução genética e caracterizada por um ou outro exome ou resequencing 12 alvejado. Por conseguinte, a combinação destas duas abordagens tem o potencial para identificar mutações condutoras durante lymphomagenesis e linfoma recaída
Para além de definir o repertório IGH célula B e rastrear a evolução clonal de progressão do linfoma, a abordagem VDJ-SEQ pode ser potencialmente utilizado como um método altamente sensível para controlar a doença resíduo mínimo, monitorização da resposta do tumor à terapia, e potencialmente identificar a presençade clones resistentes a drogas. Uma abordagem similar pode também ser aplicado às células T para mapear repertório do receptor de células T, e podem ser utilizados para sondar resposta à vigilância imunitária a cancro. Além disso, VDJ-seguintes também podem ser realizados em modelos de murino, utilizando iniciadores disponíveis a partir Hanna et al 13. É previsível que as informações recolhidas utilizando esta abordagem nos próximos anos, pode resultar numa melhor compreensão da dinâmica do desenvolvimento do tumor, bem como expandir nosso conhecimento do sistema imunológico e seus papéis em defender o nosso corpo de invasão tumoral.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR | 89125-170 | 200 proof, for molecular biology |
| TE buffer | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris·Cl, pH 8.0; 10 mM EDTA |
| Xylenes | VWR | EM-XX0055-6 | 500 ml |
| Proteinase K | Life Technonogies | 25530-015 | 100 mg |
| Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix | Promega | U1515 | 10 mM each nucleotide |
| 10x PCR Buffer | Roche | 11699105001 | Without MgCl2 |
| AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2 | Life Technonogies | 4311806 | 50 µl at 5 U/µl |
| Specimen Control Size Ladder | Invivoscribe Technologies | 2-096-0020 | 33 reactions |
| IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 - Gel Detection | Invivoscribe Technologies | 5-101-0030 | 33 reactions, Mix 2 for IGVHFR1 detection |
| IGH Gene Clonality Assay - Gel Detection | Invivoscribe Technologies | 1-101-0020 | 33 reactions, Tube B for IGVHFR2 detection |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | 20 µl at 5 U/µl |
| 10X Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer | Corning (cellgro) | 46-011-CM | 6x1 L |
| 50x TAE BUFFER | VWR | 101414-298 | 1 L |
| Ethidium bromide solution | Sigma-Aldrich | E1510 | 10 mg/ml |
| 25 bp DNA Ladder | Life Technologies | 10597011 | 1 µg/µl |
| 100 bp DNA Ladder | Life Technologies | 15628-019 | 1 µg/µl |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-500 | 500 g |
| 40% Acrylamide/Bis Solution | Bio-Rad Laboratories | 1610144 | 500 ml |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | 50 columns |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit | Life Technologies | Q32854 | |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| MiSeq | Illumina | ||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32872 | |
| Resuspension buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Ligation mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| DNA adaptor index (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| PCR primer cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Magnetic stand | Life Technologies | 4457858 | |
| Gel imaging system | Bio-Rad Laboratories | 170-8370 |
References
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