Abstract
Forståelse svulst klonalitet er avgjørende for å forstå mekanismene som er involvert i tumorigenesis og sykdomsutvikling. I tillegg kan forstå de klonale sammensetningen endringer som oppstår i løpet av en tumor som reaksjon på visse mikro-miljø eller behandlinger fører til utforming av mer sofistikerte og effektive metoder for å utrydde tumorceller. Imidlertid har relativ tumor klonale subpopulasjoner vært vanskelig på grunn av mangel på skjelnes markører. For å løse dette problemet, ble en VDJ-seq protokollen opprettet for å spore klonal evolusjon mønstre av diffuse store B-celle lymfom (DLBCL) tilbakefall ved å utnytte VDJ rekombinasjon og somatisk hypermutasjon (SHM), to unike funksjonene til B-celle lymfomer.
I denne protokollen, ble Next-Generation sekvensering (NGS) biblioteker med indeksering potensial konstruert fra forsterket omorganisert immunoglobulin tung kjede (avIgH) VDJ regionen fra par primærdiagnose og tilbakefall DLBCL SAMPles. I gjennomsnitt mer enn en halv million VDJ sekvenser per prøve ble oppnådd etter sekvensering, som inneholder både VDJ omorganisering og SHM informasjon. I tillegg ble tilpasset bioinformatikk rørledninger utviklet for å utnytte sekvensinformasjon for karakterisering av avIgH-VDJ repertoar innenfor disse prøvene. Videre gir rørledningen gjenoppbygging og sammenligning av klonal arkitekturen av individuelle tumorer, som gjør undersøkelsen av den klonale heterogenitet innenfor diagnose-tumorer og fradrag av klonal evolusjon mønsteret mellom diagnose og tilbakefall tumor parene. Ved søknad denne analysen til flere diagnose-tilbakefall parene, avdekket vi viktige bevis på at flere karakteristiske kreft evolusjonære mønstre kan føre til DLBCL tilbakefall. I tillegg kan denne tilnærmingen bli utvidet til andre kliniske aspekter, for eksempel identifisering av minimal restsykdom, overvåking tilbakefall fremgang og behandlingsrespons, og etterforskningen av immunrepertoares i ikke-lymfom sammenhenger.
Introduction
Kreft er en klonal sykdom. Siden tretti år siden, da Peter C. Nowell foreslo kreft klonal evolusjon modell 1, har mange studier forsøkt å dissekere klonale populasjoner innen tumorprøver og rekonstruere klonal ekspansjon og evolusjonsmønstre som ligger til grunn tumorigenesis prosessen to. Nylig har hel-genomsekvense aktivert etterforskere til å ta en grundig titt på klonal heterogenitet og evolusjon 3,4. Imidlertid, på grunn av mangel på medgjørlig markører i mange celletyper, er det vanskelig å utlede nøyaktige klonale arkitektur og Utviklingsretningen. Heldigvis er det en naturlig klonalitet markør i modne B-celler som mange lymfoide maligniteter, inkludert DLBCL, stammer. Som svar på antigen stimulering, kan hver B-celle danne et enkelt produktivt avIgH VDJ-sekvens ved å slutte et V H (variabel), en D (diversitet) og en J H (delta) segment sammen av et stort basseng av disse segmentene. I løpet av denne process, kan små deler av den opprinnelige sekvensen bli slettet og ytterligere ikke-malbasert nukleotider kan tilsettes for å skape et unikt VDJ-omleiring. Denne spesifikke VDJ omorganisering kan være arvelig i alt avkommet av dette B-celle, derfor tagging individuell moden B-celle og dens avkom 5. Videre oppstår SHM på rekombinerte VDJ-sekvenser i det etterfølgende germinalsenter (GC) reaksjon for å innføre ytterligere mutasjoner for utvidelse av antistoffet bassenget og forbedring av antistoff affinitet 6. Derfor, ved å sammenligne og kontrastere VDJ og SHM mønstre av lymfom prøver som har gjennomgått disse prosessene, intra-tumor heterogenitet kan være avgrenset og klonal evolusjon banen av sykdommen kan utledes.
Tidligere kunne VDJ omleiring og SHM bli identifisert ved PCR-amplifisering av de rekombinerte regionene, kloning av PCR-produktene, hvorpå Sanger-sekvensering for å oppnå sekvensinformasjon. Denne tilnærmingen jegs lav gjennomstrømning og lavt utbytte, hente bare en meget liten del av hele repertoaret rekombinerte VDJ, og hindrer karakterisering av den totale fremstilling av klonal populasjon i en gitt prøve. En modifisert tilnærming ble skapt ved å generere NGS indeksert sekvense biblioteker fra VDJ PCR-produkter og utfører PE 2x150 bp sekvensering for å få mer enn en halv million rekombinerte VDJ sekvenser per prøve. I tillegg ble det utviklet en rørledning tilpasset til å utføre kvalitetskontroll (QC), justere filter VDJ-sekvensering for å identifisere leser rearrangementer og SHMS av hver lese- og utføre fylogenetisk analyse på klonale arkitekturen i hver prøve. I tillegg har en ny tilnærming er etablert ytterligere å karakterisere klonal evolusjon mønstre for prøver samlet inn på ulike sykdomsstadier.
Vi har brukt denne teknikken for å DLBCL pasientprøver. DLBCL er en aggressiv form for non-Hodgkins lymfom med hyppige tilbakefall i inntil ett thIFU av pasientene 7. DLBCL tilbakefall oppstår vanligvis tidlig, innen 2 til 3 år etter den første diagnosen, selv om noen oppstår etter 5 år 8. Prognose for tilbakefall pasienter er dårlig, med bare 10% som oppnådde tre år progresjonsfri overlevelse på grunn av begrenset behandlingstilbud. Dette er grunnlaget for det presserende behovet for nye tilnærminger til behandling DLBCL tilbakefall 9,10. Men molekylære mekanismer knyttet DLBCL tilbakefall er fortsatt i stor grad ukjent. Spesielt rollen klonal heterogenitet på diagnose og klonal evolusjon under DLBCL tilbakefall utvikling er i dag uncharacterized, noe som gjør det vanskelig å definere en nøyaktig og nyttig biomarkør for å forutsi tilbakefall. For å løse disse spørsmålene, vi brukt vår VDJ-sekvensering tilnærming på flere par matchet primærdiagnose-tilbakefalls DLBCL prøve par. To forskjellige klonale evolusjonære scenarier for tilbakefall dukket opp fra sammenligning av klonale arkitekturer mellom diagnosen og tilbakefall SAMPles som antyder flere molekylære mekanismer kan være involvert i DLBCL tilbakefall.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. VDJ Amplification
1.1) DNA Extraction fra tumorprøver
- Utdrag DNA fra tynne snitt (10-20 mm) av frosne OCT innebygde normale eller ondartet vev.
- Fordøye 10-30 tynne snitt av innleiret vev kuttet med en kryostat mikrotom i 4 ml Nucleic Lysis Buffer (0,0075 M Tris-HCl, pH 8,2; 0,3 M NaCl; 0,002 M Na2EDTA) med proteinase K (0,5 mg / ml, endelig konsentrasjon ) og 0,625% SDS i et 15 ml sentrifugerør i et 37 ° C vannbad over natten.
- Tilsett 1 ml mettet NaCl (5 M) for å fermenteringsblandingen og rist kraftig i 15 sek.
- Sentrifuger ved 1100 xg i 15 min ved romtemperatur.
- Overfør supernatanten til et nytt 15 ml sentrifugerør og legge til to volumer av 100% etanol.
- Bland ved å snu røret 6-8 ganger. Sentrifuger ved 5000 xg i 60 min ved 4 ° C for å samle det utfelte DNA.
- Vask DNA-pelleten to ganger med 70% etanol. Centrifuge ved 5000 xg i 15 min hver gang for å samle pelleten.
- Oppløs DNA i 100-400 ul TE-buffer ved romtemperatur på en ristemaskin over natten. DNA Utbyttet er 5 til 200 ug (endelig konsentrasjon mellom 50 til 500 ng / mL), avhengig av størrelsen av vevet
- Utdrag DNA fra tynne snitt (10-20 mm) av formalinfiksert, parafin- innebygd (FFPE) normal eller ondartet vev.
- Inkuber parafinsnitt i 1 ml xylen to ganger ved romtemperatur i 10 minutter hver gang i et 1,5 ml mikrosentrifugerør å de-paraffinize. Samle vevssnittene ved spinning ved 13 000 xg i 5 minutter ved romtemperatur.
- Inkuber seksjoner i en ml 100% etanol to ganger ved romtemperatur, 10 minutter hver gang for å fjerne rester av xylen. Samle vevssnittene ved spinning ved 13 000 xg i 5 minutter ved romtemperatur. Parafinen er fullstendig oppløst ved dette punktet, og bare vevet delen er gjenværende.
- Luft-tørke delene på plass temperature i 10-15 min.
- Foreta en 0,5 mg / ml proteinase K-løsning med 1 x PCR-buffer (fortynnet fra 10 x PCR-buffer med nuklease-fritt vann). Tilsett Proteinase K løsningen til prøvene i et endelig volum på 50 til 100 ul og inkubert over natten ved 37 ° C.
- Varme opp prøvene ved 95 ° C i 10 min for å inaktivere proteinase K.
Bemerk: Ved dette trinnet blir prøve-DNA oppløst i PCR-buffer, og kan anvendes i trinn 1.2 og 1.3 direkte. DNA Utbyttet er 0,5 til 20 ug (endelig konsentrasjon mellom 10 til 200 ng / mL), avhengig av størrelsen av vevet.
1.2) DNA Quality Assessment
- Bland 0,25 mL Taq DNA polymerase med 45 mL av masterblanding fra det kommersielle stigen kit i en PCR-rør.
- Tilsett 5 mL DNA forberedt fra 1.1.1.7 eller 1.1.2.5 inn PCR rør og bland godt ved å pipettere opp og ned i minst 5 ganger.
- Bruke følgende forhold for å amplifisere DNA: 95 ° C i7 min; etterfulgt av 35 sykluser på 45 sek ved 95 ° C, 45 sek ved 60 ° C og 90 sek ved 72 ° C; deretter 72 ° C i 10 min og holde ved 15 ° C.
- Forberede en 2% agarosegel i TBE (Tris / Borate / EDTA).
- Bland 20 ul PCR reaksjon med 4 pl 6x lasting fargestoff, og legg på en 2% agarosegel.
- Flekker på agarose-gel med 0,5 ug / ml etidiumbromid oppløsning og påvise PCR-produkter med en gel forestille system. Merk: de prøvene som gir 5 PCR-produkter ved størrelser på 100, 200, 300, 400, og 600 bp vil bli videreført for å generere VDJ amplikoner.
FORSIKTIG: Etidiumbromid er en potent mutagen. Vennligst håndtere med ekstrem forsiktighet ved bruk beskyttende tannhjul, dvs. hansker, og kast i spesifikke containere per institusjonens retningslinjer.
1.3) VDJ PCR
1.3.1) Forsterke saman avIgH VDJ Segment fra Work Region 1 (IgVHFR1)
- Bland 45 mL mester mix fra røret etikettensert som "Mix 2" av en kommersiell somatisk hypermutasjon IGH Assay for Gel Detection kit, 0,25 ul Taq DNA-polymerase, og 5 ul prøve-DNA fremstilt fra 1.1.1.7 eller 1.1.2.5 i et PCR-rør.
- Bruke følgende forhold for å amplifisere DNA: 95 ° C i 7 minutter; etterfulgt av 35 sykluser på 45 sek ved 95 ° C, 45 sek ved 60 ° C og 90 sek ved 72 ° C; deretter 72 ° C i 10 min og holde ved 15 ° C.
- Løse hele PCR-produkt i en 2% agarosegel ved elektroforese.
- Flekker på agarose-gel med 0,5 ug / ml etidiumbromid oppløsning og påvise PCR-produkter med et gel-avbildningssystem. Et monoklonalt amplikon er forventet med størrelsesområdet fra 310 til 380 bp.
- Eksisere gel delen inneholder det monoklonale amplicon mellom 310-380 bp.
- Rense DNA fra utskåret under anvendelse av en standard Gel Extraction Kit ifølge produsentens protokoll. Merk: for prøver som FR1-fragmenter kan oppnås, er det ikke nødvendig å rikelig IGVHFR2 og IgVHFR3.
1.3.2) Forsterke saman avIgH VDJ Segment fra Work Region 2 (IgVHFR2)
- Bland 45 mL mester mix fra røret merket som "Tube B" av en kommersiell IGH Gene klonalitet analyse for Gel Detection kit, 0,25 mL Taq DNA polymerase, og 5 mL prøve DNA fremstilt fra 1.1.1.7 eller 1.1.2.5 i en PCR rør .
- Bruke følgende forhold for å amplifisere DNA: 95 ° C i 7 minutter; etterfulgt av 35 sykluser på 45 sek ved 95 ° C, 45 sek ved 60 ° C og 90 sek ved 72 ° C; og deretter 72 ° C i 10 minutter og lar ved 15 ° C.
- Løse hele PCR-produkt i en 2% agarosegel ved elektroforese.
- Visual PCR-produkt (er) ved 0,5 pg / ml etidiumbromid-farging. Et monoklonalt amplikon kan observeres innenfor størrelsesområdet fra 250 til 295 bp.
- Eksisere gel delen inneholder det monoklonale amplicon mellom 250-295 bp.
- Rense DNA fra utskåret gel ved hjelp av en standard Gel Extraction Kit henhold til produsentens protokoll.
1.4) Optimize VDJ PCR
- Bruke følgende modifiserte PCR-betingelser for å amplifisere IgVHFR1 og IgVHFR2 ved hjelp av suboptimal DNA: 95 ° C i 7 minutter, 40 sykluser av 95 ° C i 60 sek, 60 ° C i 60 sek, og 72 ° C i 90 sek, endelig forlengelse ved 72 ° C i 10 min.
2. VDJ Amplicon Bibliotek Forberedelse og Sequencing
2.1) Library Forberedelse
2.1.1) End-reparasjon
- Overfør VDJ PCR produktet fra 1,3 til en PCR rør og legge Resuspensjon Buffer fra DNA Sample Preparation Kit for å få opp volumet til 60 mL.
- Legg 40 ul End Repair Mix fra DNA Sample Preparation Kit og bland godt.
- Inkuber reaksjonen ved 30 ° C i 30 minutter i en forvarmet thermocycler (30 ° C) med en forvarmet lokk ved 100 ° C.
- Bland 136 mL magnetiske kuler og 24 mL PCR grade vann først i en 1,5 ml tube, deretter overføre hele End-reparasjon reaksjon fra 2.1.1.3 til 1,5 ml tube og bland godt med perler løsning.
- Plasser røret på en magnetisk stativ i 2 minutter for å tillate separasjon av kulene fra oppløsningen. Aspirer supernatanten, og vaske perler med 80% frisk forberedt EtOH to ganger mens røret er på magnetstativet.
- Aspirer etanoloppløsningen helt og tillate kulene lufttørke i 15 minutter ved romtemperatur i 15 min.
- Ta tube av de magnetiske stativ og resuspender perler i 17,5 mL Resuspensjon Buffer.
- Plasser rørene tilbake på magnetstativet i 2 min for å separere perlene fra Resuspensjon buffer. Fjern Resuspensjon Buffer (End-reparere produktet resuspenderes i Resuspensjon buffer nå) i en ren PCR rør.
2.1.2) A-tailing
- Legg 12,5 mL A-tailing bland inn PCR rør som inneholder End-reparere produktet, og bland godt. Inkuber PCR-rør ved 37 ° C i 30 minutter i en forvarmet thermocycler (37 ° C) med en forvarmet lokk ved 100 ° C.
2.1.3) Adaptor Ligation
- Legg 2,5 mL Resuspensjon Buffer, 2,5 mL Ligation Mix, og 2,5 mL DNA Adaptor Oversikt inn i A-tailing reaksjon.
- Inkuber reaksjonen ved 30 ° C i 30 minl i en forvarmet thermocycler (30 ° C) med en forvarmet lokk ved 100 ° C.
- Tilsett 5 mL Stop ringsbuffer i hver reaksjon og bland godt.
- Bland 42,5 mL godt blandet magnetiske kuler for å rengjøre reaksjon etter trinn 2.1.1.5 til 2.1.1.8. Tilsett 50 mL Resuspensjon buffer for å eluere adapter-ligert produkt.
- Rens adapter-ligert produkt for en andre gang ved anvendelse av 50 ul godt blandet AMPure XP perler, og eluere produktet i 25 mL Resuspensjon buffer i et rent PCR-rør.
2.1.4) Amplify DNA-fragmenter
- Tilsett 5 mL PCR Primer Cocktail og 25 mL PCR Master Mix til PCR rør som inneholder adapter-ligert produkt og bland godt.
- Utfører forsterkning i en forhåndsprogrammert thermocycler med følgende betingelser: 98 ° C i 30 sekunder; 10 sykluser med 98 ° C i 10 sek, 60 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 30 sek; deretter 72 ° C i 5 min og holde ved 10 ° C.
- Rydde opp i reaksjon ved bruk av 50 pl godt blandede magnetiske kuler, og eluere det endelige produkt i 30 mL Resuspensjon buffer.
2.1.5) Library Validation
- Kvantifisere det endelige produktet med en fluorometer bruker produsentens protokoll. Slutt bibliotek konsentrasjon er mellom 2,5 til 20 ng / mL.
- Vurdere kvaliteten på det endelige produktet ved hjelp av en analytisk instrument med høy sensitivitet DNA-brikke i henhold til produsentens protokoll. Forvent et enkelt bånd med den forventede størrelsen for enten IGVHFR1, IGVHFR2 eller IGVHFR3. Expected størrelsen av biblioteket produktet er lik størrelsen av den opprinnelige VDJ fragment pluss størrelsen av adapterne (~ 125 bp).
2.2) VDJ-PCR Bibliotek Samling og Sequencing
- Beregn molariteten av hvert bibliotek fraksjon ved hjelp av følgende formel: nM = [(ng / 1000) / BP * 660] x 10 9 hvor ng er konsentrasjonen av VDJ-PCR-bibliotek målt i trinn 2.1.5.1, og bp er toppen Størrelsen av VDJ-PCR-bibliotek målt i trinn 2.1.5.2.
- Fortynne biblioteket til 2 nM (10 pl totalt) med DNase-fritt vann.
- Kombiner 10 mL av de fortynnede 2 nm bibliotekene sammen i en 1,5 ml tube.
- Legge til et likt volum av phix pigg-kontroll inn i 1,5 ml rør.
- Laste bassenget på 19:00 konsentrasjon på en Flowcell.
- Sekvensere bibliotekene benytter en sammenkoblet-end 150 syklus sequencer i henhold til produsentens protokoll.
3. Data Analysis
Merk: En summær av bioinformatikk skript som brukes i denne delen kan bli funnet som en tilleggskode fil.
3.1) Justering og QC
- Kart parvise end sekvense leser mot en menneskelig IGH V, D og J region database ned fra IMGT nettstedet 11 ved hjelp av en tilpasset nucleotide blast algoritme basert på «blastn" tilgjengelig fra NCBI med gapet åpent straff på to, gap forlengelse straff på 1, ordlengde på 7, og e-verdi terskel på 10 -4. Kast lese-paret ikke kart til både en IGH V og J-regionen.
- Telle de rester leser-parene som har IGH V og J kartlegginger for å få frekvensene av matchende VJ kombinasjoner på tvers av alle lest parene hentet fra sekvense kjøre på prøven. Telle en skrive pair hvis det er kartlagt til både en IGH V og J-genet, og deretter legge sin allelet til tilsvarende telling for den spesielle VJ kombinasjon.
- Rangere teller for hver saman VDJ region hentet fra 3.1.2 fra highest til det laveste. Den VDJ regionen har den høyeste leser teller er definert som større omorganisering kombinasjon.
- Kast innrettede sekvenser som dekker mindre enn 35% av det domenet store omleiring identifisert i 3.1.3.
3.2) SHM Profile Identification
- Telle alle SHM mønstre over leser fra trinn 3.1.3. Definere hver SHM mønster som subklon.
- Tell antall subklonene som svarer til ulike unike SHM mønstre, og antall lesninger som er kartlagt til individuelle subkloner.
3.3) grafisk fremstilling av resultater
- Utfør fylogenetisk analyse på subkloner bruker sine tilsvar SHM mønstre ved hjelp av et nabolag sammenføyningsmetode fra R-pakken "ape" i henhold til produsentens protokoll. Beregne en avstand matriks fra de enkelte forskjellige justeringer for å gjenskape subklon fylogenien forankret til kimlinje-sekvensen til V-J kombinasjon aktuelle for hver sammenkoblet prøvesett.
- Bruke nukleotidsekvensen i hver subklon som tegn vektor og beregne den omtrentlige strengen avstanden mellom alle subkloner i større VJ omleiring for både diagnostisering og tilhørende tilbakefalls prøver ved hjelp av en Levenshtein avstandsmål hvor matematisk avstanden mellom to linjer er gitt ved d x, y (i, j) hvor d x, y (i, j) = 1 hvis jeg ≠ j og 0 på annen måte, og deretter summere dette funksjon over lengden av strengen som tilsvarer nukleotidsekvenser i og j.
- Grafisk vise den resulterende matrisen av subklone avstander og deres tilhørende subklone teller i følgende to måter:
- Bruk R pakke "masse" i henhold til produsentens protokoll for å anvende flerdimensjonal skalering til subklon avstand matrisen og generere et todimensjonalt kart-koordinater prinsipp, som deretter plottet sammen med logaritmenav subclonal teller som radien i sirkelen.
- Konstruer en urettet graf basert på Levenshtein avstand, hvor hjørnene tilsvarer hver distinkt subklon som følge av de store VJ omorganisering.
Merk: Når avstanden mellom to distinkte kloner er lik en da det foreligger en kant mellom disse to toppunkter. Hvis avstanden er større enn en, så er det ingen kant som forbinder dem. - Plotte grafen til 3.3.3.2 bruke tkplot funksjon i "iGraph" R pakke med Kamada Kawai layout i henhold til produsentens protokoll. Radien av hjørnene er proporsjonal med kubikkroten av det samlede antall av kloner som er tilordnet det, og skyggelegging bruker en rød og blå rekkevidde for å betegne den andel av kloner som enten tilhører diagnosen (blå) eller tilbakefall (røde) prøver .
3.4) Heterogenitet (Entropy) Måling
- Undersøke tall og subklon tellinger avindividuelle mønstre av somatisk hypermutasjon som forekommer i store VJ omleiring for hver sammenkoblet sett av prøver.
- Beregn den empiriske entropi og rest empirisk entropi justert for antallet distinkte kloner i hver prøve ved å bruke standard histogrammet basert entropi estimering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den generelle fremgangsmåten fra VDJ sekvensering (VDJ-seq), inkludert DNA-ekstraksjon, rekombinert VDJ-regionen amplifikasjon og rensing sekvense bibliotek konstruksjon, leser behandling, og fylogenetisk analyse, er vist i figur 1. Rutinemessig 5-200 ug DNA kan hentes fra frosset fast vevssnitt eller 0,5-20 mikrogram DNA fra formalinfiksert parafin-vevssnitt. Avhengig av kvaliteten, omleiring mønster, og SHM graden av de enkelte prøver, kan et utvalg av VDJ PCR-produkter fra forskjellige prøver oppnås (figur 2), inkludert IGVHFR1 (310-380 bp), FR2 (250-295 bp), og FR3 (70-120 bp). Prøvene som kun FR3 fragment kan fås fra VDJ PCR ble ekskludert fra studien på grunn av resterende av den korte produkt som ikke gir tilstrekkelig mengde sekvensinformasjon for nedstrømsdataanalyseformål. Kun prøvene hvorav hoved FR1 FR2 eller PCR-produktet kan visualiseres på the agarosegel blir behandlet for å generere sekvensbiblioteker. Utbyttet av de store PCR-produktet etter gelrensing går fra 10 til 50 ng totalt.
Hele rensede PCR-produkt ble anvendt for den etterfølgende bibliotekkonstruksjon for sekvensering bibliotek. Etter adapter ligation, får hver prøve sin egen unike indeksen. Under bibliotek forsterkning ble 10 sykluser av PCR utføres som kan gi mer enn 30 ng som endelig bibliotek produkter. Biblioteket kvalitet ble åpnet av en Bioanalyzer. Som vist i figur 3, er det ett enkelt produkt i biblioteket prøven med en størrelse forskyvning på ~ 125 bp danne det opprinnelige PCR-amplikon VDJ produkt som angir den ytterligere strømomformer. For hver sekvense løp, ble 5-10 biblioteker samlet sammen 7 mikrometer. I tillegg, på grunn av høy sekvenslikhet mellom de VDJ PCR-produktene, ble biblioteket bassenget blandet med 50% phix pigg på for å sikre at kompleksiteten av kjøringen og korrekt identifikasjon av basenytterligere etter hvert sekvense syklus. Bibliotek DNA-fragmenter ble sekvensert for 150 bp i begge ender, som tillater gjenfinning av tilstrekkelig mengde sekvensinformasjon som strekker seg VD og DJ knutepunkter for FR1 fragmenter, og SHM mutasjons mønstre for fylogenetisk analyse.
Tidligere utførte vi VDJ-sekvensering på 32 DLBCL prøver samlet ved diagnose og tilbakefall fra 14 pasienter (flere pasienter hadde flere prøver innsamlet ved enten diagnose eller tilbakefall stadium) ved anvendelse av betingelsene beskrevet ovenfor 12. Ved å utføre fylogenetisk analyse av SHM profiler av de store V H DJ H rearrangements mellom de sammenkoblede prøver, en "Early-divergerende" og en "Late-divergerende" -modus av klonal evolusjon forbundet med DLBCL tilbakefall ble identifisert 12. Heri ble den samme metode anvendt på en nylig oppsamlet DLBCL diagnose og tilbakefall par. FR1 regioner ble oppnådd i begge prøvene etter PCR forsterkning. Et stort PCR-produkt med størrelsen omkring 344 bp (målt ved Bioanalyzer) ble oppnådd fra både diagnose og tilbakefall prøvene. Etter sekvensering, leser en total på 0,70 millioner parvise end ble oppnådd for diagnostisering prøven og 0,73 millioner parvise ende leser for tilbakefall prøven, som var innenfor området av antall lesninger oppnådd pr prøven i tidligere studie (0.38- 1.42 million, gjennomsnittlig 0.75 ± 0.26 million) 12. Etter kartlegging parvise end leser mot IMGT database, leser som ikke har treff i alle tre V, ble D og J regioner forkastet. V H DJ H ordningen ble tildelt hver parvise end lese. I alt 0,64 millioner og 0,67 millioner V H DJ H veikryss ble identifisert i diagnostisering og tilbakefall prøver henholdsvis representerer mer enn 90% justering rate. Ved å telle hvor mange ganger hver kombinasjon av V H DJ H ble funnet i enkelte prøver, 808 distinkt V H </ sub> DJ H veikryss ble funnet i diagnostisering prøven og 581 forskjellige V H DJ H veikryss i tilbakefall prøven. Den dominerende V H DJ H knutepunkt i både prøven er IGHV4-34 * 2 * 01 IGHJ2 IGHD5-5 * 01, bekrefter at de er beslektet klonalt. Denne dominerende V H DJ H knutepunkt utgjorde 97% av hele kartlagte V H DJ H knutepunkt leser i både diagnose prøven og tilbakefall prøven.
Å spore klonal utviklingen av denne DLBCL tilbakefall tilfelle ble fylogenetisk analyse av SHM profiler av de store V H DJ H rearrangements mellom dette paret av diagnose og tilbakefall prøver utført. Vi observerte at klonal evolusjon mønster av dette paret ble som følge av "Late-divergerende" sti (figur 4), at subkloner fra diagnose og tilbakefall svulster gruppert sammen på samme gren av fylogenetisk tre, og den dominerendediagnose subklon og de dominerende tilbakefall subkloner delte likt SHM mønster med noen flere mutasjoner oppsto i tilbakefall subklon. Disse resultatene antyder at potensielt var der en subklon i diagnosen svulst som var enten chemo-resistente eller unnslapp fra behandlingen, og så til slutt utviklet seg til tilbakefall tumor.
For ytterligere å karakterisere og visualisere klonal arkitektur av hver prøver og klonal evolusjon mønstre under tilbakefall prosessen, har to nye analyser blitt utviklet. I disse analysene ble hele settet med subkloner av de store VJ omleiring i hver prøve brukes til å beregne den parvise strengen avstanden mellom alle subkloner som er definert ved sine mønstre av SHM. Da ved hjelp av multi-dimensjonale skalering (Figur 5A, 5B), eller ved å bygge en urettet graf (figur 5C, 5D) som beskrevet i Data Analysis, ble plott som representerer fordelingen og heterogenitet av subkloner opprettet. Somillustrert i figur 4, utviser MDS plottet langt mindre sekvens diversitet mellom store subkloner i de sene avvikende tilfeller (figur 5A) enn at i den første divergerende tilfeller (figur 5B). Videre under kloner av diagnosen prøven og sub-kloner av tilbakefall prøven i begynnelsen divergerende tilfellet skille fullstendig fra hverandre, noe som indikerer mangel på likhet mellom SHM mønsteret mellom disse svulstene, selv om de har samme VDJ omleiring . Likeledes urettet grafene i (figur 5C) og (figur 5D) viser at fordelingen av subklon tellinger i slutten av divergerende tilfellet (figur 5C) er forskjellig fra den tidlige divergerende (figur 5D). Sistnevnte har mer fremtredende, men genetisk forskjellige store kloner fra diagnose til tilbakefall. I tillegg er det mangel på kantene og mindre subkloner forbindelser mellom de store diagnose- og tilbakefalls kloner itidlig avvikende tilfelle (figur 5D), viser sekvensen mangfoldet arten av den tidlige divergerende tilbakefall tilfelle.
Figur 1:.. Steg for steg flytdiagram av VDJ-seq tilnærming Den generelle prosedyren for VDJ sekvensering er vist Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representative bilder av VDJ PCR amplikonet produkter. Gel bilder som viser den representative IGVH-FR1 (venstre panel) og IGVH-FR2 (høyre panel) PCR-produkter fra DNA ekstrahert fra lymfom pasientprøver. Et PCR-produkt som ikke kunne oppnås i prøve 5 sannsynligvis på grunn av enten den laveprøve-DNA kvalitet eller SHM på primer nettsteder som svekket PCR reaksjonen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3:. QC av VDJ PCR amplicon og påfølgende sekvense biblioteket ved Bioanalyzer representant Bioanalyzer spor av samme VDJ amplicon før bibliotek konstruksjon (øverst panel) og etter bibliotek konstruksjon (nederst panel). Legg merke til størrelsen skiftet fra 334 bp til 459 bp indikerer tillegg av adapteren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Klonal analyse utviklingen av et par DLBCL diagnose og tilbakefall prøver. Fylogenetisk analyse av et diagnose-tilbakefall DLBCL prøven par som viser "Late-divergent" klonal evolusjon modus. Farge tickere representerer mutasjonsstatus. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Nye grafiske metoder for å visualisere klonal evolusjon mønstre (A, B) Flerdimensjonal skalering tomter integrere SHM profiler og subklone tellinger av prøven pair A viser sen-divergerende tilbakefall modus (A) og prøve par B viser tidlig divergerende tilbakefall modus. (B). Radius av sirklene viser tellingen av subclde som svarer til en bestemt SHM profil og farger svarende til diagnose (blå) prøve eller tilbakefall (rød) prøve. X- og Y-aksen representerer toppen 2 komponenter i MDA. (C, D) urettet grafer av prøven pair A viser sen-divergerende tilbakefall modus (C) og prøve par B viser tidlig divergerende tilbakefall modus (D). Kanter tilsvare to SHM profiler som har en streng avstand på én bokstav separasjon og uteksaminert shading (fargeskala bar) som indikerer hvor stor andel av sekvenser kartlegging til en bestemt SHM profil som svarer til diagnosen (rød) prøve eller tilbakefall (gul) prøve. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grunn av den nesten ubegrenset antall gjentakelser av sekvensinformasjon kodet av VDJ-omleiring og SHM ved IGH locus av humane B-celler, undersøkelse av hele IGH repertoaret av high-throughput deep-sekvensering viste seg å være en effektiv og fullstendig måte å avgrense klonal og sub-klonal B-celle populasjoner. Videre kan denne strategien kan brukes til å studere utviklingen klonal banen for B-celletumorutvikling, remisjon, og tilbakefall ved å sammenligne klonale og sub-klonale arkitekturer av pasientprøver tatt langs forskjellige stadier av sykdommen. Selv om forsterkning av rearrangert VDJ-sekvenser fra primær prøve-DNA er lett å utføre i et laboratorium ved hjelp av kommersielt tilgjengelige primere, er effektiviteten av utvidelsen i stor grad avhengig av kvaliteten av prøve-DNA. Særlig DNA ekstrahert fra FFPE-prøver viser lav forsterkningsvirkningsgrad, og ofte bare små FR3 fragmentet kan være vellykket amplifisert fra disseprøver, noe som gjør dem uegnet for etterfølgende analyse. Etter vår studie beskrevet heri er designet for å forstå klonalitet av B-celle lymfom, som er en klonal sykdom med en eller flere store kloner dominere hele tumoren, vi bare oppsamlet og sekvensert de store VDJ-PCR-produkt. For studier er interessert i å katalogisering av hele B-celle klonal populasjon av, for eksempel, perifert blod, kan en større del av gelen som inneholder flere VDJ-PCR-produktene (flere bånd eller en smøre på gelen) bli skåret ut og sekvensert. Det er imidlertid viktig å påpeke at det ikke er mulig å fange opp hele omar IGH repertoaret fordi viss SHM kan forekomme på hvor primere mål og nedsette forsterkningen av disse VDJs. Videre har nylig en kommersiell analyse direkte kopling IGH rearrangement forsterkning og MiSeq sekvensering er innført. Denne analysen strømlinjeprøveopparbeidelse prosessen. Imidlertid, siden ikke alle tumorprøver ville være i stand til å slekterTE FR1 fragment, anbefaler vi likevel inkludert gelelektroforese skritt å sjekke produktet av PCR-reaksjonen før pooling prøver for sekvensering.
Sekvensering 150 bp fra begge ender av VDJ-fragmentet (totalt 300 bp sekvensinformasjon) har følgende fordeler: 1) 300 bp-sekvensering kan dekke hoveddelen av FR1 og hele FR2-fragmentet, gir god sekvensinformasjon for å identifisere VDJ omordning og somatiske hyper-mutasjoner; 2) Plattformen gir rask sekvense turn-around tid som fullfører hele 300 sykluser av VDJ-sekvensering etter 48 timer; 3) Hver kjøring tillater multiplexing opp til 12 prøver og fortsatt oppnår rundt en million parvise end leser per prøve utgang. Fordi den høye sekvenslikhet mellom kloner som bærer det samme VDJ omleiring, særlig i B-celle lymfom prøver, er det avgjørende å pigge-i 20-50% phix under sekvense løp for å tillate nøyaktig definere basen ringer matrise. Nylig, MiSeqprogramvaren er oppdatert for å løse dette spørsmålet. Det anbefales å bruke så lite som 5% phix spike-in for lav kompleksitet bibliotek sekvensering. Imidlertid har vår sekvense anlegget opplevd inkonsekvent konsentrasjon av phix spike-kontroll DNA gitt av produsenten som ville kompromiss utfallet av lav kompleksitet sekvensering. Derfor, i dagens praksis, vi fortsatt bruke 10-20% phix spike-in for VDJ sekvensering. For sekvensering av hele perifere blod-B-cellerepertoar, som normalt inneholder et stort antall forskjellige VDJ ordninger, er det mulig å redusere mengden av phix pigg inn. Selv om antall kloner og subkloner identifisert for hver prøve er positivt korrelert med antall lesninger sekvensert, halv til en million av parvise ende leser per prøve er tilstrekkelig til å sammenligne klonale strukturer mellom prøvene og utlede klonale evolusjon mønster mellom prøver samlet på forskjellige sykdomsstadier av samme pasient 12. det ermulig at PE 150 bp sekvense ikke kan oppnå tilstrekkelig dekning av de lange FR1 fragmenter (dvs. 350-380 bp). I noen tilfeller kan sekvensinformasjon for D-segmentet ikke samles opp, eller det kanskje ikke nok til sekvensinformasjon ved V-segmentet til å skille subkloner av SHMS. Men med forkant av sekvenseringsteknologi, har det blitt mulig å sekvensere lengre og dekke hele FR1 amplicon.
Ved sekvensering av det IGH repertoar av B-celler var det mulig å spore en utvidelse av de enkelte B-cellekloner og antyde klonal utviklingen i løpet av diagnosen til tilbakefall. Med bruk av analyse på bestander av subkloner generert av SHM mønstre, var vi i stand til å skille to moduser av kreft progresjon til tilbakefall ved å undersøke deres phylogenies. De siste grafiske fremstillinger som bruker flerdimensjonale skalerings plott og urettet grafer basert på Levenshtein stykke lenger allow oss å forstå 1) subclonal sammensetningen av hver svulst, 2) hvordan enkelte subkloner er relatert til hverandre, og 3) hvordan hver subklon utvikler seg i løpet av sykdomsprogresjon. Videre statistisk analyse viste at disse fylogenetiske strukturene var tydelig annerledes og at subclonal populasjonene skilte med hensyn til deres heterogenitet. Endelig kan klonal evolusjon bane oppnådd ved VDJ-sekvensering å være godt korrelert med genetisk evolusjon og kjennetegnes ved enten exome eller målrettet resequencing 12. Derfor, ved å kombinere disse to fremgangsmåter har potensial til å identifisere mutasjoner driver under lymphomagenesis og lymfom tilbakefall
I tillegg til å definere B-cellerepertoar IGH og spor klonal utviklingen av lymfom progresjon, kan VDJ-seq tilnærmingen kan potensielt benyttes som en meget følsom metode for sporing av minimal rest sykdom, overvåking tumor respons på behandling, og eventuelt identifisering av nærværetav resistente kloner. Et tilsvarende opplegg kan også brukes til T-celler for å kartlegge T-celle-reseptor-repertoar, og kan anvendes for å undersøke immunresponsen overvåking av kreft. Videre kan VDJ-seq også utføres i murine modeller som bruker primere tilgjengelige fra Hanna et al. 13 Det er påregnelig at informasjonen som samles inn gjennom denne tilnærmingen i de neste årene kan føre til en bedre forståelse av dynamikken i tumor utvikling samt utvide vår kunnskap om immunsystemet og dets rolle i å forsvare kroppen vår fra tumorinvasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR | 89125-170 | 200 proof, for molecular biology |
| TE buffer | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris·Cl, pH 8.0; 10 mM EDTA |
| Xylenes | VWR | EM-XX0055-6 | 500 ml |
| Proteinase K | Life Technonogies | 25530-015 | 100 mg |
| Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix | Promega | U1515 | 10 mM each nucleotide |
| 10x PCR Buffer | Roche | 11699105001 | Without MgCl2 |
| AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2 | Life Technonogies | 4311806 | 50 µl at 5 U/µl |
| Specimen Control Size Ladder | Invivoscribe Technologies | 2-096-0020 | 33 reactions |
| IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 - Gel Detection | Invivoscribe Technologies | 5-101-0030 | 33 reactions, Mix 2 for IGVHFR1 detection |
| IGH Gene Clonality Assay - Gel Detection | Invivoscribe Technologies | 1-101-0020 | 33 reactions, Tube B for IGVHFR2 detection |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | 20 µl at 5 U/µl |
| 10X Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer | Corning (cellgro) | 46-011-CM | 6x1 L |
| 50x TAE BUFFER | VWR | 101414-298 | 1 L |
| Ethidium bromide solution | Sigma-Aldrich | E1510 | 10 mg/ml |
| 25 bp DNA Ladder | Life Technologies | 10597011 | 1 µg/µl |
| 100 bp DNA Ladder | Life Technologies | 15628-019 | 1 µg/µl |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-500 | 500 g |
| 40% Acrylamide/Bis Solution | Bio-Rad Laboratories | 1610144 | 500 ml |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | 50 columns |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit | Life Technologies | Q32854 | |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| MiSeq | Illumina | ||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32872 | |
| Resuspension buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Ligation mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| DNA adaptor index (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| PCR primer cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Magnetic stand | Life Technologies | 4457858 | |
| Gel imaging system | Bio-Rad Laboratories | 170-8370 |
References
- Nowell, P. C. The clonal evolution of tumor cell populations. Science. 194 (4260), 23-28 (1976).
- Greaves, M., Maley, C. C.
- Ding, L., et al. Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing. Nature. 481 (7382), 506-510 (2012).
- Jiao, W., Vembu, S., Deshwar, A. G., Stein, L., Morris, Q. Inferring clonal evolution of tumors from single nucleotide somatic mutations. BMC bioinformatics. 15, 35 (2014).
- Schatz, D. G., Ji, Y. Recombination centres and the orchestration of V(D)J recombination. Nature reviews immunology. 11 (4), 251-263 (2011).
- Jacob, J., Kelsoe, G., Rajewsky, K., Weiss, U. Intraclonal generation of antibody mutants in germinal centres. Nature. 354 (6352), 389-392 (1991).
- Coiffier, B., et al. CHOP chemotherapy plus rituximab compared with CHOP alone in elderly patients with diffuse large-B-cell lymphoma. N Engl J Med. 346 (4), 235-242 (2002).
- Larouche, J. F., et al. Lymphoma recurrence 5 years or later following diffuse large B-cell lymphoma: clinical characteristics and outcome. J Clin Oncol. 28 (12), 2094-2100 (2010).
- Friedberg, J. W. Relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2011, 498-505 (2011).
- Gisselbrecht, C., et al. Salvage regimens with autologous transplantation for relapsed large B-cell lymphoma in the rituximab era. J Clin Oncol. 28 (27), 4184-4190 (2010).
- Lefranc, M. P. IMGT, the International ImMunoGeneTics Information System for Immunoinformatics : methods for querying IMGT databases, tools, and web resources in the context of immunoinformatics. Molecular biotechnology. 40 (1), 101-111 (2008).
- Jiang, Y., et al. Deep sequencing reveals clonal evolution patterns and mutation events associated with relapse in B-cell lymphomas. Genome biology. 15 (8), 432 (2014).
- Hanna, J., et al. Direct reprogramming of terminally differentiated mature B lymphocytes to pluripotency. Cell. 133 (2), 250-264 (2008).
