Abstract
Forståelse tumor klonalitet er afgørende for forståelsen af de mekanismer, der er involveret i tumorigenese og sygdomsprogression. Desuden kan forstå de klonale sammensætning forandringer, der sker inden for en tumor i respons på visse mikromiljø eller behandlinger føre til udformning af mere sofistikerede og effektive metoder til at udrydde tumorceller. Imidlertid har sporing tumor klonale subpopulationer været en udfordring på grund af manglende skelnelige markører. For at løse dette problem blev en VDJ-seq protokol skabt til at spore klonale evolution mønstre af diffust storcellet B-celle lymfom (DLBCL) tilbagefald ved at udnytte VDJ rekombination og somatisk hypermutation (SHM), to unikke funktioner af B-celle lymfomer.
I denne protokol, blev biblioteker næste generations sekventering (NGS) med indeksering potentiale konstrueret af forstærket omlejrede immunglobulin tung kæde (IgH) VDJ region fra par af primær diagnose og tilbagefald DLBCL SAMPles. I blev opnået i gennemsnit mere end halvdelen million VDJ sekvenser pr prøve efter sekventering, som indeholder både VDJ omlejring og SHM oplysninger. Desuden blev tilpassede bioinformatik rørledninger udviklet til fuldt ud at udnytte sekvensinformation til karakterisering af IgH-VDJ repertoire inden for disse prøver. Desuden rørledningen tillader genopbygning og sammenligning af klonal arkitektur af individuelle tumorer, som gør det muligt undersøgelsen af klonal heterogenitet inden for de diagnose tumorer og fradrag af klonale evolution mønstre mellem diagnose og tilbagefald tumor par. Ved anvendelse af denne analyse til flere diagnose-tilbagefald par, vi afdækket centrale beviser for, at flere karakteristiske tumor evolutionære mønstre kunne føre til DLBCL tilbagefald. Derudover kan denne tilgang udvides til andre kliniske aspekter, såsom identifikation af minimal residual sygdom, overvågning tilbagefald fremskridt og behandlingsrespons, og undersøgelse af immun repertoires i ikke-lymfom sammenhænge.
Introduction
Kræft er en klonal sygdom. Siden tredive år siden, da Peter C. Nowell foreslog kræft klonal evolution model 1, har mange undersøgelser forsøgt at dissekere klonpopulationer inden tumorprøver og rekonstruere klonal ekspansion og evolution mønstre, der ligger til grund for tumorgenese processen 2. For nylig har hel-genom sekventering aktiveret efterforskere til at tage en dyb kig på klonal heterogenitet og evolution 3,4. Men på grund af manglen på medgørlige markører i mange celletyper, er det vanskeligt at udlede den præcise klonal arkitektur og evolutionære vej. Heldigvis er der en naturlig klonalitet markør i modne B-celler, hvorfra mange lymfoide maligne sygdomme, herunder DLBCL har oprindelse. Som reaktion på antigen stimulering, kan hver B-celle danner en enkelt produktiv IgH VDJ sekvens ved at deltage i en VH (variable), en D (diversitet) og et JH (sammenføjning) segment sammen fra en stor pulje af disse segmenter. Under denne process, kan små dele af den oprindelige sekvens slettes og yderligere ikke-template nukleotider kan tilsættes for at skabe et unikt VDJ omlejring. Denne specifikke VDJ omlejring kan nedarves i alle afkom af dette B-celle, derfor tagging individuel moden B-celle og dens afkom 5. Desuden optræder SHM på rekombinerede VDJ sekvenser i efterfølgende germinale center (GC) reaktion at indføre yderligere mutationer til udvidelse af antistoffet pool og styrkelse af antistofaffinitet 6. Derfor, ved at sammenligne og kontrasterende VDJ og SHM mønstre af lymfom prøver, der har gennemgået disse processer, intra-tumor heterogenitet kunne afgrænses og klonal evolution sti af sygdommen kan udledes.
Tidligere kunne VDJ omlejring og SHM identificeres ved PCR amplifikation af rekombinerede regioner, kloning af PCR-produkterne, og efterfølgende Sanger-sekventering for at opnå sekvensinformation. Denne tilgang ilow-throughput og lavt udbytte, hente kun en meget lille del af hele rekombineret VDJ repertoire, og hindrer karakterisering af den samlede gengivelse af klonal population inden for en given prøve. En modificeret tilgang blev skabt ved at generere NGS indekseret sekventering biblioteker fra VDJ PCR-produkter og udføre PE 2x150 bp sekventering til at få mere end en halv million rekombinerede VDJ sekvenser pr prøve. Desuden blev en brugerdefineret pipeline udviklet til at udføre kvalitetskontrol (QC), justere filter VDJ sekventering læser at identificere omlejringer og SHMS af hver læse- og udføre fylogenetisk analyse på den klonale arkitektur hver prøve. Desuden er der etableret en ny tilgang til yderligere at karakterisere de klonale evolution mønstre for prøver indsamlet på forskellige stadier sygdom.
Vi har anvendt denne teknik til DLBCL patientprøver. DLBCL er en aggressiv form for non-Hodgkin lymfom med hyppige tilbagefald i op til en thIRD af patienterne 7. DLBCL tilbagefald normalt forekomme tidligt, inden for 2 til 3 år efter den oprindelige diagnose, selv om nogle opstår efter 5 år 8. Prognose for tilbagefald patienter er dårlig, med kun 10% at opnå tre år progressionsfri overlevelse på grund af begrænsede behandlingsmuligheder. Dette er grundlaget for det presserende behov for nye tilgange til behandling af DLBCL tilbagefald 9,10. Men molekylære mekanismer forbundet med DLBCL tilbagefald er stadig stort set ukendt. Især rolle klonal heterogenitet ved diagnose og klonal evolution under DLBCL tilbagefald udvikling er i øjeblikket karakteriseret, hvilket gør det vanskeligt at definere en nøjagtig og nyttig biomarkør at forudsige tilbagefald. For at løse disse spørgsmål, anvendte vi vores VDJ-sekventering tilgang på flere par matchede primær diagnose-tilbagefald DLBCL prøvepar. To forskellige klonale evolutionære scenarier for tilbagefald fremgik af sammenligningen af de klonale arkitekturer mellem diagnose og tilbagefald SAMPles der tyder flere molekylære mekanismer kan være involveret i DLBCL tilbagefald.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. VDJ Amplification
1.1) DNA Udsugning fra tumorprøver
- Uddrag DNA fra tynde sektioner (10-20 um) af frosne OLT indlejret normale eller maligne væv.
- Fordøje 10-30 tynde snit af indlejrede væv skæres af en kryostat mikrotom i 4 ml Nucleic Lysis Buffer (0,0075 M Tris-HCI, pH 8,2; 0,3 M NaCl; 0,002 M Na2EDTA) med proteinase K (0,5 mg / ml, slutkoncentration ) og 0,625% SDS i en 15 ml centrifugerør i et 37 ° C vandbad natten over.
- Tilsæt 1 ml mættet NaCl (5 M) til fordøjelsen blandingen og rystes kraftigt i 15 sekunder.
- Centrifuger ved 1.100 xg i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Supernatanten overføres til et nyt 15 ml centrifugerør og tilføj to volumener 100% ethanol.
- Bland ved at vende røret 6-8 gange. Der centrifugeres ved 5.000 xg i 60 minutter ved 4 ° C for at opsamle det udfældede DNA.
- Vask DNA pellet to gange med 70% ethanol. Centrifuge ved 5000 xg i 15 minutter hver gang at samle pelleten.
- Opløs DNA i 100-400 pi TE-buffer ved stuetemperatur på en ryster natten over. DNA Udbyttet er 5 til 200 ug (slutkoncentration mellem 50-500 ng / pl) afhængigt af størrelsen af vævet
- Uddrag DNA fra tynde sektioner (10-20 um) af formalin-fikseret, paraffin- indlejret (FFPE) normal eller ondartet væv.
- Inkuber paraffinsnit i 1 ml xylen to gange ved stuetemperatur i 10 minutter hver gang i et 1,5 ml mikrocentrifugerør til de-paraffinize. Indsamle vævssnit ved centrifugering ved 13.000 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Inkuber sektioner i 1 ml 100% ethanol to gange ved stuetemperatur, 10 min hver gang for at fjerne rester xylener. Indsamle vævssnit ved centrifugering ved 13.000 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Paraffinen er helt opløst på dette tidspunkt, og kun vævssnittet er tilbage.
- Air-tørre sektioner på værelset temperature i 10-15 min.
- Foretag en 0,5 mg / ml proteinase K-opløsning med 1x PCR-buffer (fortyndet fra 10 x PCR-puffer med nuclease-frit vand). Tilsæt proteinase K-opløsning til prøverne i et slutvolumen på 50-100 pi og inkuberes natten over ved 37 ° C.
- Varm prøverne ved 95 ° C i 10 minutter for at inaktivere proteinase K.
Bemærk: I dette trin, er prøve-DNA opløst i PCR-buffer og kan anvendes i trin 1.2 og 1.3 direkte. DNA Udbyttet er 0,5 til 20 ug (slutkoncentration mellem 10-200 ng / pl) afhængigt af størrelsen af vævet.
1.2) DNA Quality Assessment
- Bland 0,25 pi Taq DNA polymerase med 45 pi store blanding fra det kommercielle stigen kit i en PCR-rør.
- Tilsæt 5 pi DNA fremstillet ud fra 1.1.1.7 eller 1.1.2.5 i PCR-rør og bland godt ved pipettering op og ned i mindst 5 gange.
- Brug følgende betingelser for at forstærke DNA: 95 ° C i7 min; efterfulgt af 35 cykler af 45 sekunder ved 95 ° C, 45 sekunder ved 60 ° C og 90 sekunder ved 72 ° C; derefter 72 ° C i 10 minutter og hold ved 15 ° C.
- En 2% agarose gel i TBE (Tris / Borat / EDTA).
- Bland 20 pi PCR-reaktion med 4 pi 6x loading dye og indlæse på en 2% agarosegel.
- Farv agarosegelen med 0,5 ug / ml ethidiumbromid-opløsning og påvise PCR-produkter med en gel forestille system. Bemærk: prøverne, der giver 5 PCR-produkter på størrelser på 100, 200, 300, 400 og 600 bp vil blive videreført til at generere VDJ amplikoner.
ADVARSEL: Ethidiumbromid er en potent mutagen. Venligst behandles med største forsigtighed ved at bære beskyttende redskaber, dvs. handsker, og bortskaffes i specifikke containere om institutionens retningslinjer.
1.3) VDJ PCR
1.3.1) Forstærk rekombineret IgH VDJ Segment fra Framework Region 1 (IgVHFR1)
- Bland 45 pi mester mix fra røret mærketed som "Mix 2" af en kommerciel somatisk IGH Hypermutation Assay for Gel Detection kit, 0,25 pi Taq DNA polymerase og 5 pi prøve-DNA fremstillet ud fra 1.1.1.7 eller 1.1.2.5 i et PCR-rør.
- Brug følgende betingelser for at amplificere DNA: 95 ° C i 7 min; efterfulgt af 35 cykler af 45 sekunder ved 95 ° C, 45 sekunder ved 60 ° C og 90 sekunder ved 72 ° C; derefter 72 ° C i 10 minutter og hold ved 15 ° C.
- Løse hele PCR-produkt i en 2% agarosegel ved elektroforese.
- Farv agarosegelen med 0,5 ug / ml ethidiumbromid-opløsning og påvise PCR-produkter med en gel imaging system. Et monoklonalt amplikon forventet med størrelsesområdet 310-380 bp.
- Udskære geldelen indeholdende det monoklonale amplikon mellem 310-380 bp.
- Oprensning af DNA fra udskårne under anvendelse af en standard Gel Extraction Kit ifølge producentens protokol. Bemærk: for prøver, FR1-fragmenter kunne opnås, er det ikke nødvendigt at rigeligt IgVHFR2 og IgVHFR3.
1.3.2) Forstærk rekombineret IgH VDJ Segment fra Framework Region 2 (IgVHFR2)
- Bland 45 pi mastermix fra rør mærket som "Tube B" af en kommerciel IGH Gene Klonalitet Assay for kit Gel Detection, 0,25 pi Taq DNA polymerase og 5 pi prøve-DNA fremstillet ud fra 1.1.1.7 eller 1.1.2.5 i et PCR-rør .
- Brug følgende betingelser for at amplificere DNA: 95 ° C i 7 min; efterfulgt af 35 cykler af 45 sekunder ved 95 ° C, 45 sekunder ved 60 ° C og 90 sekunder ved 72 ° C; derefter 72 ° C i 10 minutter og henstår ved 15 ° C.
- Løse hele PCR-produkt i en 2% agarosegel ved elektroforese.
- Visualisere PCR-produkt (er) med 0,5 ug / ml ethidiumbromidfarvning. Et monoklonalt amplicon kan observeres inden for størrelsesområdet 250-295 bp.
- Udskære geldelen indeholdende det monoklonale amplikon mellem 250-295 bp.
- Oprensning af DNA fra udskårne under anvendelse af en standard Gel Extraction Kit ifølge producentens protokol.
1.4) Optimer VDJ PCR
- Brug følgende modificerede PCR-betingelser til amplifikation IgVHFR1 og IgVHFR2 hjælp suboptimal DNA: 95 ° C i 7 min, 40 cyklusser af 95 ° C i 60 sek, 60 ° C i 60 sek og 72 ° C i 90 sek, endelig forlængelse ved 72 ° C i 10 min.
2. VDJ Amplikon Bibliotek Forberedelse og sekventering
2.1) Fremstilling Bibliotek
2.1.1) End-reparation
- Overfør VDJ PCR-produkt fra 1,3 til et PCR-rør og tilsæt resuspensionsbuffer fra DNA Prøveforberedelse Kit til at bringe op for lydstyrken til 60 pi.
- Tilføj 40 pi End Repair Mix fra DNA Sample Preparation Kit og bland grundigt.
- Inkuber reaktionen ved 30 ° C i 30 minutter i en forvarmet thermocycler (30 ° C) med en forvarmet låg ved 100 ° C.
- Bland 136 pi magnetiske perler og 24 pi PCR grade vand først i et 1,5 ml rør, derefter overføre hele End-reparation reaktion fra 2.1.1.3 i 1,5 ml rør og bland godt med perler opløsning.
- Rørene anbringes på et magnetisk stativ i 2 minutter for at tillade separation af perlerne fra opløsningen. Aspirer supernatanten og vask perlerne med 80% frisk tilberedt EtOH to gange mens røret er på magnetiske stativ.
- Aspirer ethanolopløsning fuldstændigt og give perlerne til at lufttørre i 15 minutter ved stuetemperatur i 15 min.
- Tag rør fra de magnetiske stå og resuspender perler i 17,5 pi resuspensionsbuffer.
- Rørene anbringes tilbage på den magnetiske stå i 2 minutter for at adskille perler fra resuspenderingsbufferen. Fjern resuspenderingsbufferen (End-reparation produkt resuspenderes i resuspenderingsbufferen nu) i et rent PCR-rør.
2.1.2) A-tailing
- Tilføj 12,5 pi A-hale blandes ind i PCR-rør indeholdende End-reparation produkt og bland grundigt. Inkubér PCR-rør ved 37 ° C i 30 minutter i en forvarmet thermocycler (37 ° C) med en forvarmet låg ved 100 ° C.
2.1.3) Adaptor Ligation
- Tilføj 2.5 pi resuspensionsbuffer, 2,5 pi ligeringsblandingen, og 2,5 pi DNA Adaptor Index i A-tailing reaktion.
- Inkuber reaktionen ved 30 ° C i 30 minl i en forvarmet thermocycler (30 ° C) med en forvarmet låg ved 100 ° C.
- Tilsæt 5 pi Stop ligeringsbuffer ind hver reaktion og bland grundigt.
- Bland 42,5 pi godt blandet magnetiske perler reaktionen følge trin 2.1.1.5 til 2.1.1.8 at rengøre. Der tilsættes 50 pi genopslæmningspuffer til eluering af adaptorligerede produkt.
- Rengør adaptorligerede produkt til en anden gang ved anvendelse af 50 pi godt blandede AMPure XP perler, og eluering af produktet i 25 pi genopslæmningspuffer i et rent PCR-rør.
2.1.4) Forstærk DNA-fragmenter
- Tilsæt 5 pi PCR Primer Cocktail og 25 pi PCR Master Mix til PCR-rør indeholdende adapter-ligeret produkt og bland grundigt.
- Udfør forstærkning i en forprogrammeret termocyklusapparat med følgende betingelser: 98 ° C i 30 sek; 10 cykler af 98 ° C i 10 sek, 60 ° C i 30 sek og 72 ° C i 30 sek; derefter 72 ° C i 5 min og hold ved 10 ° C.
- Rense reaktionen ved anvendelse af 50 pi godt blandede magnetiske kugler, og der elueres slutproduktet i 30 pi resuspensionsbuffer.
2.1.5) Bibliotek Validering
- Kvantificere det endelige produkt med et fluorometer ved hjælp producentens protokol. Slutkoncentration biblioteket er mellem 2,5 til 20 ng / pl.
- Vurdere kvaliteten af det endelige produkt ved hjælp af et analytisk instrument med høj følsomhed DNA-chip ifølge producentens protokol. Forvent et enkelt bånd med den forventede størrelse for enten IGVHFR1, IGVHFR2 eller IGVHFR3. Eorventet størrelse af biblioteket produkt svarer til størrelsen af den oprindelige VDJ amplicon plus størrelsen af adaptere (~ 125 bp).
2.2) VDJ-PCR Library Pooling og sekventering
- Beregn molariteten af hvert bibliotek fraktion ved hjælp af følgende formel: = nM [(ng / 1.000) / bp * 660] x 10 9, hvor ng er koncentrationen af VDJ-PCR-bibliotek blev målt i trin 2.1.5.1 og BP er peak størrelsen af VDJ-PCR-bibliotek målt i trin 2.1.5.2.
- Fortynd biblioteket til 2 nM (10 pi i alt) med DNase-frit vand.
- Kombiner de 10 pi af fortyndet 2 nm biblioteker sammen i et 1,5 ml rør.
- Tilføj et lige så stort volumen PhiX spike-kontrol i 1,5 ml rør.
- Indlæs poolen på 7:00 koncentration på en flow-cellen.
- Sekventere biblioteker ved anvendelse af en parret udgang 150 cyklus sequencer ifølge producentens protokol.
3. Data Analysis
Bemærk: En sommær af bioinformatik scripts, der anvendes i dette afsnit kan findes som en supplerende kodeks fil.
3.1) Justering og QC
- Kort parret ende sekventering læser mod en menneskelig indvendige gearnav V, D og J-regionen database downloades fra IMGT hjemmeside 11 ved hjælp af en tilpasset nukleotid blast algoritme baseret på 'BLASTN' tilgængelig fra NCBI med mellemrum åben straf på 2, gap extension penalty på 1, ordlængde på 7, og e-værdi tærskel på 10 -4. Kassér read-parret ikke kort til både en indvendige gearnav V og en J-region.
- Tæl de resterende læst-par, der har IGH V og J kortlægninger at opnå de frekvenser af matchende VJ kombinationer på tværs af alle læste par opnået fra sekventering køre på prøven. Tæl en read-par, hvis den er knyttet til både en indvendige gearnav V og J gen, og derefter tilføje sit allel til det tilsvarende optælling for den pågældende VJ kombination.
- Rangordne tæller for hver rekombineret VDJ region opnås fra 3.1.2 fra det højeest til det laveste. VDJ region har den højeste læser tæller defineres som væsentlig omlejring kombination.
- Kassér opstillede sekvenser, der dækker mindre end 35% af domænet større omlægning identificeret i 3.1.3.
3.2) SHM Profil Identifikation
- Tæl alle SHM mønstre på tværs af læser fra trin 3.1.3. Definer hver SHM mønster som en subklon.
- Tæl antallet af subklonerne, der svarer til forskellige unikke SHM mønstre, og antallet af læser, der er knyttet til individuelle subkloner.
3.3) Grafisk repræsentation af resultater
- Udfør den fylogenetisk analyse på subkloner ved hjælp af deres tilsvarende SHM mønstre ved hjælp et kvarter sammenføjning metode fra R-pakke "abe" ifølge producentens protokol. Beregne en afstand matrix fra de enkelte forskellige alignments at genskabe subklon fylogeni forankret til germliniesekvensen for VJ kombination pågældende for hver parrede prøvesæt.
- Brug nukleotidsekvensen af hver subklon som vektor karakter og beregne omtrentlige streng afstanden mellem alle subkloner i de store VJ omlejring til både diagnose og tilsvarende tilbagefald prøver under anvendelse af en Levenshtein afstandsmål, hvor matematisk afstanden mellem to alignments er givet ved d x, y (i, j) hvor d x, y (i, j) = 1, hvis jeg ≠ j, og ellers 0, og derefter opsummere denne funktion over længden af strengen svarende til nukleotidsekvenser i og j.
- Grafisk vise den resulterende matrix af subklon afstande og deres tilsvarende subklon tæller i de følgende to måder:
- Brug R pakke "masse" i overensstemmelse med producentens protokol kan anvendes multidimensional skalering til subklon afstand matrix og generere et todimensionalt princip koordinater kort, som afbildes derefter sammen med logaritmentællinger subclonal som radius af cirklen.
- Konstruere en ikke-orienteret graf baseret på den Levenshtein afstand, hvor de hjørner svarer til hvert enkelt subklon følge af store VJ omlejring.
Bemærk: Hvis afstanden mellem to forskellige kloner er lig med en så der findes en kant mellem disse to knudepunkter. Hvis afstanden er større end en, så er der ingen kant forbinder dem. - Plot grafen for 3.3.3.2 hjælp af tkplot funktion i "iGraph" R pakke med Kamada Kawai layout ifølge producentens protokol. Radius af toppunkterne er proportional med tredje rod af det samlede antal kloner mappet til det og skygge bruger en rød og blå område til at betegne den del af kloner, som enten tilhører diagnosen (blå) eller tilbagefald (rød) prøver .
3.4) Heterogenitet (Entropi) Måling
- Undersøg tal og subklon tællinger af denindividuelle mønstre af somatisk hypermutation forekommer i store VJ omlejring For hver sammenkoblet sæt af prøver.
- Beregn den empiriske entropi og resterende empirisk entropi korrigeret for antallet af forskellige kloner i hver prøve ved anvendelse af standard histogram baseret entropi estimation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den samlede procedure for VDJ sekventering (VDJ-seq), herunder DNA-ekstraktion, rekombineret VDJ region amplifikation og rensning, sekventering bibliotek konstruktion, læser forarbejdning og fylogenetisk analyse, er vist i figur 1 Rutinemæssigt kan hentes 5-200 ug DNA fra. frosset fast vævssnit eller 0,5-20 ug DNA fra formalin-fikserede paraffin-indlejrede vævssnit. Afhængigt af kvaliteten, omlejring mønster og SHM grad af individuelle prøver, kunne en række VDJ PCR-produkter fra forskellige prøver opnås (figur 2), herunder IGVHFR1 (310-380 bp), FR2 (250-295 bp), og FR3 (70-120 bp). Prøver, hvorfra kun FR3 fragment kan opnås fra VDJ PCR blev udelukket fra den resterende undersøgelsen på grund af den korte produkt, der ikke giver tilstrækkelig mængde sekvens information til downstream dataanalyse formål. Kun prøver, hvoraf en stor FR1 eller FR2 PCR-produkt kan visualiseres på the agarosegel behandles for at generere sekventering biblioteker. Udbyttet af det store PCR-produkt efter geloprensning spænder fra 10 til 50 ng i alt.
Hele oprensede PCR-produkt blev anvendt til den efterfølgende bibliotekskonstruktion til sekventering bibliotek. Efter adapter ligation, hver prøve opnår sin egen unikke indeks. Under bibliotek amplifikation blev 10 cykler af PCR udført som kunne give mere end 30 ng som endelige biblioteksprodukter. Biblioteket kvalitet blev åbnet af en Bioanalyzer. Som vist i figur 3, der er et enkelt produkt i biblioteket prøve med en størrelse forskydning af ~ 125 bp danne den oprindelige VDJ PCR-amplikon produkt med angivelse af yderligere tilpasningsdele. For hver sekventering løb, blev 5-10 biblioteker poolet sammen ved 7 uM. Desuden, på grund af den høje sekvenslighed mellem VDJ PCR-produkter blev biblioteket pool blandet med 50% PhiX spike-in for at sikre kompleksiteten af kørslen og korrekt identifikation af baseyderligere efter hver sekventering cyklus. Bibliotek DNA-fragmenter blev sekventeret for 150 bp på begge ender, som gør det muligt at hente tilstrækkelig mængde sekvensinformation spænder VD og DJ kryds for FR1 fragmenter og SHM mutation mønstre for fylogenetisk analyse.
Tidligere udførte vi VDJ sekventering på 32 DLBCL prøver indsamlet ved diagnose og tilbagefald fra 14 patienter (flere patienter havde flere prøver indsamlet på enten diagnose eller tilbagefald fase) ved hjælp af tilstanden er beskrevet ovenfor 12. Ved at udføre det fylogenetiske analyse af SHM profiler af de store VHDJH omlejringer mellem de parrede prøver, en "tidlig-divergent" og en "sen-divergent" mode for klonal evolution forbundet med DLBCL tilbagefald blev identificeret 12. Heri blev den samme fremgangsmåde anvendes på et nyligt opsamlet DLBCL diagnose og tilbagefald par. FR1 regioner blev opnået i begge prøver efter PCR-amplifikation. En stor PCR-produkt med størrelsen ca. 344 bp (målt ved Bioanalyzer) blev opnået fra både diagnose og tilbagefald prøver. Efter sekventering læser alt 0,70 mio parret udgang blev opnået til diagnosticering prøven og 0,73 millioner parret udgang læser for tilbagefald stikprøven, der inden for området af antallet af læser opnået per prøve i den tidligere undersøgelse (0.38- 1.420.000, gennemsnitlig 0,75 ± 0260000) 12. Efter kortlægning parret ende læser mod IMGT database, læser, der ikke har hits i alle tre V, blev D og J-regioner kasseres. VHDJH ordning blev tildelt hver parret ende læse. Blev identificeret i alt 0,64 millioner og 0,67 millioner VHDJH vejkryds i diagnosticering og tilbagefald prøver, altså mere end 90% justering sats. Ved at tælle hvor mange gange blev fundet hver kombination af VHDJH i individuelle prøver, 808 særskilte VH </ sub> DJH kryds blev fundet i diagnosen prøven og 581 forskellige VHDJH kryds i tilbagefald prøven. Den dominerende VHDJH krydset i både prøven er IGHV4-34 * 2 IGHD5-5 * 01 * 01 IGHJ2, bekræfter, at de er klonbeslægtede. Denne dominerende VHDJH junction udgjorde 97% af den samlede kortlagt VHDJH junction læser i både diagnosen prøven og tilbagefald prøven.
At spore den klonale udviklingen af denne DLBCL tilbagefald tilfælde blev fylogenetisk analyse af SHM profiler af de store VHDJH omlejringer mellem dette par diagnose- og tilbagefald prøver udført. Vi observerede, at den klonale evolution mønster af dette par var efter "Late-divergent" vej (figur 4), at subklonerne fra diagnose og tilbagefald tumorer grupperet sammen på samme gren af fylogenetisk træ, og den dominerendediagnose underklon og de dominerende tilbagefald subkloner delte lignende SHM mønster med et par yderligere mutationer forekom i tilbagefald subklonen. Disse resultater antyder, at der var potentielt en subklon i diagnosticering svulst, der var enten kemo-resistente eller undsluppet fra behandling, og så til sidst udviklede sig til tilbagefald tumor.
For yderligere at karakterisere og visualisere klonal arkitektur af hver prøver og klonal evolution mønstre under tilbagefald proces er blevet udviklet to nye analyser. I disse analyser blev det samlede sæt af subkloner af den store VJ omlejring i hver prøve anvendes til at beregne den parvise streng afstanden mellem alle subkloner som defineret i deres mønstre af SHM. Så ved hjælp af multi-dimensional skalering (figur 5A, 5B) eller ved at bygge en ikke-orienteret graf (figur 5C, 5D) som beskrevet i Data Analysis, blev parceller, der repræsenterer distribution og heterogenitet subkloner oprettet. I takt medvist i figur 4, MDS plot udviser langt mindre sekvens forskelle mellem store subkloner i slutningen af divergerende tilfælde (figur 5A) end i begyndelsen af divergerende tilfælde (figur 5B). Desuden sub-kloner af diagnosen prøven og sub-kloner af tilbagefald prøven i den tidlige divergerende tilfælde adskilt fuldstændigt fra hinanden, hvilket indikerer den manglende lighed mellem de SHM mønstrene mellem disse tumorer, selvom de har samme VDJ omlejring . Ligeledes styrede grafer i (figur 5C) og (figur 5D) viser, at fordelingen af subklon tæller i slutningen af divergerende tilfælde (figur 5C) adskiller sig fra den tidlige divergerende (figur 5D). Sidstnævnte har mere fremtrædende, men genetisk forskellige store kloner fra diagnose til tilbagefald. Hertil kommer, at manglen på kanterne og mindre subkloner forbindelser mellem de store diagnose og tilbagefald kloner itidligt divergerende tilfælde (figur 5D), viser sekvensen mangfoldighed arten af den tidlige divergerende tilbagefald sag.
Figur 1:.. Trin for trin flowdiagram af VDJ-seq tilgang Den overordnede procedure for VDJ sekventering vises Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentative billeder af VDJ PCR amplicon produkter. Gel billeder, der viser repræsentant IGVH-FR1 (venstre panel) og IGVH-FR2 (højre panel) PCR-produkter fra DNA ekstraheret fra lymfom patientprøver. Et PCR-produkt kunne ikke opnås i prøve 5 sandsynligvis på grund af enten den laveprøve-DNA kvalitet eller SHM på primer sites, der værdiforringet PCR-reaktionen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. QC af VDJ PCR-amplikon og efterfølgende sekventering bibliotek ved Bioanalyzer repræsentant Bioanalyzer spor af den samme VDJ amplicon før bibliotekskonstruktion (øverste panel) og efter bibliotekskonstruktion (nederste panel). Bemærk størrelsen skift fra 334 bp til 459 bp angiver tilsætning af adapteren. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Klonal evolution analyse af et par DLBCL diagnose og tilbagefald prøver. Fylogenetisk analyse af en diagnose-tilbagefald DLBCL prøven par viser "Late-divergent" klonal evolution mode. Farven tickers repræsenterer mutationen status. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Nye grafiske metoder til at visualisere klonale evolution mønstre (A, B) Multidimensional skalering plots integrerer SHM profiler og subklon tællinger af prøven par A viser den sene-divergent tilbagefald (A) og prøve par B viser tidlig divergent tilbagefald tilstand. (B). Radius af cirklerne angiver optælling af subcldem, der svarer til en bestemt SHM profil og farver svarende til diagnosen (blå) prøve eller tilbagefald (rød) prøve. X- og y-akserne repræsenterer de øverste 2 komponenter af MDA. (C, D) Ikke-styrede grafer af prøven par A viser den sene-divergent tilbagefald tilstand (C) og prøve B viser pair tidlig divergent tilbagefald tilstand (D). Kanter svarer til to SHM profiler der har en streng afstand på et bogstav adskillelse og dimitterede skygge (farve skala bar), der angiver andelen af sekvenser kortlægning til en bestemt SHM profil svarende til diagnosen (rød) prøve eller tilbagefald (gul) prøve. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund af den næsten ubegrænset antal iterationer af sekvensinformation kodet af VDJ omlejring og SHM på IGH locus af humane B-celler, undersøgelse af hele IGH repertoire af high-throughput dybe sekventering viste sig at være en effektiv og omfattende måde at afgrænse klonal og sub-klonede B-celle populationer. Desuden kan denne strategi bruges til at studere klonal evolution vej B-celle tumor udvikling, remission, og tilbagefald ved at sammenligne de klonale og sub-klonede arkitekturer af patientprøver indsamlet langs forskellige stadier af sygdommen. Selvom amplifikation af rearrangerede VDJ sekvenser fra delprøve DNA let udføres i et laboratorium indstilling anvendelse af kommercielt tilgængelige primere, amplificeringseffektiviteten afhænger i høj grad af kvaliteten af DNA-prøven. Især DNA ekstraheret fra FFPE prøver udviser lav virkningsgrad for forstærkningen, og ofte kun den lille FR3 fragment kan med held amplificeret fra disseprøver, hvilket gør dem uegnede til den efterfølgende analyse. Da vores undersøgelse beskrevet heri designet til at forstå klonaliteten af B-celle lymfom, som er en klonal sygdom med en eller flere store kloner dominerer hele tumoren, vi kun opsamlet og sekventeret den store VDJ-PCR-produkt. Til undersøgelser interesseret i katalogisering hele B-celle klonal population af for eksempel, perifert blod, kan en større del af gelen, der indeholder flere VDJ-PCR-produkter (multiple bånd eller en udstrygning på gelen) udskæres og sekventeres. Det er imidlertid vigtigt at påpege, at det ikke er muligt at fange hele omlejrede IGH repertoire, fordi visse SHM kan forekomme på, hvor primere målet og forringe amplifikation af disse VDJs. Desuden er der indført for nylig, en kommerciel assay direkte kobling indvendige gearnav omlejring forstærkning og MiSeq sekventering. Denne analyse strømliner prøve forberedelsesprocessen. Men da ikke alle tumorprøver ville kunne slægterte FR1 fragment, anbefaler vi stadig herunder gelelektroforese trin til at kontrollere produktet af PCR-reaktionen før samle prøver til sekventering.
Sekventering 150 bp af begge ender af VDJ fragment (i alt 300 bp sekvensinformation) har følgende fordele: 1) 300 bp-sekventering kan dække størstedelen af FR1 og hele FR2 fragment, giver rigelig sekvensinformation til identifikation VDJ omlejring og somatiske hyper-mutationer; 2) Platformen giver hurtig sekventering turn-around tid, der fuldender hele 300 cykler af VDJ-sekventering under 48 timer; 3) Hver kørsel tillader multiplexing op til 12 prøver og stadig opnår omkring en million parret ende læser per prøve udgang. Fordi den høje sekvenslighed mellem kloner, der bærer den samme VDJ omlejring, specielt i B cellelymfom prøver, er det vigtigt at spike-i 20-50% PhiX under sekventering løb for at tillade nøjagtigt definerer basen ringer matrix. For nylig, MiSeqsoftware er blevet opdateret til at tage fat på dette spørgsmål. Det anbefales at bruge så lidt som 5% PhiX spike-in for lav kompleksitet bibliotek sekventering. Imidlertid har vores sekventering facilitet oplevet inkonsekvent koncentration af PhiX spike-i kontrol-DNA fra producenten, der ville kompromittere resultatet af lav kompleksitet sekventering. Derfor, i den nuværende praksis, vi stadig bruge 10-20% PhiX spike-in til VDJ sekventering. Til sekventering af hele perifere blod B-celle-repertoire, som normalt indeholder et stort antal forskellige arrangementer VDJ, er det muligt at reducere mængden af PhiX spike-in. Selv om antallet af kloner og subkloner identificeret af hver prøve er positivt korreleret med antallet af læser sekventeret, halvdelen til en million af parret udgang læser per prøve er tilstrækkeligt at sammenligne klonale strukturer mellem prøverne og udlede klonale evolution mønstre mellem prøver indsamlet på forskellige sygdom faser af den samme patient 12. Det ermuligt, at PE 150 bp sekventering måske ikke opnå tilstrækkelig dækning af de lange FR1 fragmenter (dvs. 350-380 bp). I nogle tilfælde kan sekvensinformation af D-segmentet ikke indsamles eller der kan ikke være nok sekvensinformation om V-segment at differentiere subkloner af SHMS. Men med forud for sekventering teknologier, er det blevet muligt at sekventere længere og dække hele FR1 amplikon.
Gennem sekventering af IGH repertoire af B-celler var det muligt at spore en udvidelse af individuelle B-cellekloner og udlede klonal evolution løbet fra diagnose til tilbagefald. Med brugen af analyse på bestandene af subkloner genereret af SHM mønstre, var vi i stand til at skelne to former for kræft progression til tilbagefald ved at undersøge deres phylogenies. De seneste grafiske fremstillinger hjælp multidimensionelle skalering plots og ikke-styrede grafer baseret på Levenshtein afstanden yderligere allow os at forstå 1) den subclonal sammensætning af hver tumor, 2) hvordan de enkelte subkloner er relateret til hinanden, og 3) hvordan hver subklon udvikler sig i løbet af sygdomsprogression. Desuden statistisk analyse viste, at disse fylogenetiske strukturer var klart forskellige, og at de subclonal befolkninger afveg med hensyn til deres forskelligartethed. Endelig kan den klonale evolution bane opnået ved VDJ-sekventering være godt korreleret med genetiske evolution og er kendetegnet ved enten exome eller målrettet resekventering 12. Derfor kombinerer disse to fremgangsmåder har potentiale til at identificere driver mutationer under lymphomagenesis og lymfom tilbagefald
Ud over at definere B-celle-IGH repertoire og spore klonal udvikling lymfom progression, kan VDJ-seq tilgang potentielt anvendes som en yderst følsom metode til sporing minimal rest sygdom, overvågning tumorrespons på terapier, og potentielt identificere tilstedeværelsenaf lægemiddelresistente kloner. En lignende fremgangsmåde kan også anvendes til T-celler til kort T-cellereceptor repertoire, og kan anvendes til at probe immunovervågning reaktion på kræft. Desuden kan VDJ-seq også udføres i murine modeller ved hjælp af primere til rådighed fra Hanna et al. 13 Det kan forudses, at oplysninger, der indsamles gennem denne tilgang i de næste par år kan resultere i en bedre forståelse af dynamikken i tumor udvikling samt udvide vores viden om immunsystemet og dets roller i at forsvare vores krop fra tumorinvasion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR | 89125-170 | 200 proof, for molecular biology |
| TE buffer | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris·Cl, pH 8.0; 10 mM EDTA |
| Xylenes | VWR | EM-XX0055-6 | 500 ml |
| Proteinase K | Life Technonogies | 25530-015 | 100 mg |
| Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix | Promega | U1515 | 10 mM each nucleotide |
| 10x PCR Buffer | Roche | 11699105001 | Without MgCl2 |
| AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2 | Life Technonogies | 4311806 | 50 µl at 5 U/µl |
| Specimen Control Size Ladder | Invivoscribe Technologies | 2-096-0020 | 33 reactions |
| IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 - Gel Detection | Invivoscribe Technologies | 5-101-0030 | 33 reactions, Mix 2 for IGVHFR1 detection |
| IGH Gene Clonality Assay - Gel Detection | Invivoscribe Technologies | 1-101-0020 | 33 reactions, Tube B for IGVHFR2 detection |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | 20 µl at 5 U/µl |
| 10X Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer | Corning (cellgro) | 46-011-CM | 6x1 L |
| 50x TAE BUFFER | VWR | 101414-298 | 1 L |
| Ethidium bromide solution | Sigma-Aldrich | E1510 | 10 mg/ml |
| 25 bp DNA Ladder | Life Technologies | 10597011 | 1 µg/µl |
| 100 bp DNA Ladder | Life Technologies | 15628-019 | 1 µg/µl |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-500 | 500 g |
| 40% Acrylamide/Bis Solution | Bio-Rad Laboratories | 1610144 | 500 ml |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | 50 columns |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit | Life Technologies | Q32854 | |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| MiSeq | Illumina | ||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32872 | |
| Resuspension buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Ligation mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| DNA adaptor index (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| PCR primer cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Magnetic stand | Life Technologies | 4457858 | |
| Gel imaging system | Bio-Rad Laboratories | 170-8370 |
References
- Nowell, P. C. The clonal evolution of tumor cell populations. Science. 194 (4260), 23-28 (1976).
- Greaves, M., Maley, C. C.
- Ding, L., et al. Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing. Nature. 481 (7382), 506-510 (2012).
- Jiao, W., Vembu, S., Deshwar, A. G., Stein, L., Morris, Q. Inferring clonal evolution of tumors from single nucleotide somatic mutations. BMC bioinformatics. 15, 35 (2014).
- Schatz, D. G., Ji, Y. Recombination centres and the orchestration of V(D)J recombination. Nature reviews immunology. 11 (4), 251-263 (2011).
- Jacob, J., Kelsoe, G., Rajewsky, K., Weiss, U. Intraclonal generation of antibody mutants in germinal centres. Nature. 354 (6352), 389-392 (1991).
- Coiffier, B., et al. CHOP chemotherapy plus rituximab compared with CHOP alone in elderly patients with diffuse large-B-cell lymphoma. N Engl J Med. 346 (4), 235-242 (2002).
- Larouche, J. F., et al. Lymphoma recurrence 5 years or later following diffuse large B-cell lymphoma: clinical characteristics and outcome. J Clin Oncol. 28 (12), 2094-2100 (2010).
- Friedberg, J. W. Relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2011, 498-505 (2011).
- Gisselbrecht, C., et al. Salvage regimens with autologous transplantation for relapsed large B-cell lymphoma in the rituximab era. J Clin Oncol. 28 (27), 4184-4190 (2010).
- Lefranc, M. P. IMGT, the International ImMunoGeneTics Information System for Immunoinformatics : methods for querying IMGT databases, tools, and web resources in the context of immunoinformatics. Molecular biotechnology. 40 (1), 101-111 (2008).
- Jiang, Y., et al. Deep sequencing reveals clonal evolution patterns and mutation events associated with relapse in B-cell lymphomas. Genome biology. 15 (8), 432 (2014).
- Hanna, J., et al. Direct reprogramming of terminally differentiated mature B lymphocytes to pluripotency. Cell. 133 (2), 250-264 (2008).
