The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.
Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of mitochondrial function in this tissue has become more prevalent. Although many technologies and assays exist that measure mitochondrial respiratory pathways in a variety of cells, tissue and species, there is currently a void in the literature in regards to the compilation of these assays using isolated mitochondria from mouse skeletal muscle for use in microplate based technologies. Importantly, the use of microplate based respirometric assays is growing among mitochondrial biologists as it allows for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. Therefore, a collection of microplate based respirometric assays were developed that are able to assess mechanistic changes/adaptations in oxygen consumption in a commonly used animal model. The methods presented herein provide step-by-step instructions to perform these assays with an optimal amount of mitochondrial protein and reagents, and high precision as evidenced by the minimal variance across the dynamic range of each assay.
कंकाल की मांसपेशी माइटोकॉन्ड्रिया के मुख्य शारीरिक भूमिका ऑक्सीडेटिव फास्फोरिलीकरण 1 से एटीपी का उत्पादन होता है। महत्वपूर्ण बात है, कंकाल की मांसपेशी माइटोकॉन्ड्रिया 3, अपक्षयी रोग 4 और प्रकार द्वितीय मधुमेह 5 उम्र बढ़ने, व्यायाम क्षमता 2 में एक विशेष भूमिका निभाते हैं। एक उम्र बढ़ने समाज, और प्रकार द्वितीय मधुमेह यूनाइटेड स्टेट्स 6 में मौत के 7 वें प्रमुख कारण किया जा रहा है के रूप में, माइटोकॉन्ड्रियल समारोह का आकलन है कि तरीकों के लिए जरूरत के जैव चिकित्सा अनुसंधान 7,8 में तेजी से और अधिक प्रचलित हो गया है। यह ऑक्सीडेटिव फास्फोरिलीकरण 9 के कार्यात्मक घटकों को व्यक्त करने के माइटोकॉन्ड्रियल और परमाणु जीनोम के बीच समन्वित समारोह का प्रतिनिधित्व करता है के बाद से विशेष रूप से, ऑक्सीजन की खपत की माप माइटोकॉन्ड्रियल समारोह का आकलन करने में असाधारण उपयोगिता है।
कई प्रौद्योगिकियों कि बरकरार कोशिकाओं में ऑक्सीजन की खपत की माप में सक्षम है और अलग-थलग मौजूदडी माइटोकॉन्ड्रिया 7-10। इसके अलावा, assays के अनेक प्रकार की कोशिकाओं और ऊतकों के लिए विकसित की है, और mitochondrial रास्ते और श्वसन नियंत्रण 9,11,12 की माप के लिए अनुमति देते हैं कि प्रजातियों में से एक किस्म में की गई है। हालांकि, microplate आधारित ऑक्सीजन की खपत प्रौद्योगिकियों में उपयोग के लिए माउस कंकाल की मांसपेशी से पृथक माइटोकॉन्ड्रिया का उपयोग कर इन परीक्षणों की सभी के संकलन के संबंध में साहित्य में एक शून्य वर्तमान में है। महत्वपूर्ण बात है, microplate आधारित respirometric assays के उपयोग माइटोकॉन्ड्रियल जीव के बीच बढ़ रही है और अलग-थलग माइटोकॉन्ड्रिया 9 की न्यूनतम मात्रा का उपयोग करते हुए उच्च throughput मापन के लिए अनुमति देता है। इसलिए, microplate आधारित respirometric assays के एक संग्रह असामान्यताएं और / या रूपांतरों इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला (ईटीसी) में होने वाली हो सकती है, जहां की pinpointing की अनुमति है कि विकसित किए गए। इसके अलावा, दो अतिरिक्त microplate आधारित respirometric assays के समन्वय के आकलन betwee सक्षम है कि विकसित किए गएtricarboxylic एसिड (टीसीए) चक्र और आदि, और एस एस ऑक्सीकरण और आदि के बीच n महत्वपूर्ण बात है, प्रस्तुत तरीकों आमतौर पर इस्तेमाल किया पशु मॉडल में माइटोकॉन्ड्रियल समारोह में यंत्रवत परिवर्तनों को मापने के लिए एक स्पष्ट और संक्षिप्त तरीके से प्रदान करते हैं।
माउस कंकाल की मांसपेशी के 100 मिलीग्राम – इस लेख में प्रस्तुत तरीकों 75 से पृथक माइटोकॉन्ड्रिया का उपयोग कर microplate आधारित respirometric assays के एक संग्रह के प्रदर्शन के लिए कदम-दर-कदम निर्देश प्रदान करते हैं। तीन प्रतियों कुओं के बीच तंग मानक विचलन के सबूत के रूप ये assays उच्च परिशुद्धता के साथ किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात, इन respirometric assays के असामान्यताएं और / या रूपांतरों आमतौर पर इस्तेमाल किया पशु मॉडल में आदि, टीसीए चक्र, β ऑक्सीकरण मार्ग, सब्सट्रेट ट्रांसपोर्टरों, आदि में होने वाली हो सकती है, जहां की pinpointing अनुमति देते हैं।
यह इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त विभिन्न ईंधन और अवरोधकों का उपयोग करने के औचित्य पर प्रकाश डाला करने के लिए महत्वपूर्ण है। पाइरूवेट / Malate और ग्लूटामेट / Malate respirometric assays के परिसर मैं मध्यस्थता श्वसन के आकलन, साथ ही उनके संबंधित ट्रांसपोर्टरों के आकलन के लिए अनुमति देते हैं, और ग्लूटामेट के मामले deaminase 15 में। वैकल्पिक रूप से, का संयोजनrotenone जटिल मैं रोकता है और succinate एडिनाइन डाईन्यूक्लियोटाइड पीला रंग की कमी के माध्यम से परिसर द्वितीय इलेक्ट्रॉनों प्रदान करता है के बाद से succinate / rotenone (FADH 2) 15 आदि के परिसर द्वितीय के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन प्रवाह का आकलन अनुमति देता है। ये assays युग्मन दक्षता और अधिक से अधिक श्वसन के रूप में सब्सट्रेट विशेष जानकारी प्रदान करते हैं। इलेक्ट्रॉन प्रवाह परख substrates और अवरोधकों के संयोजन माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन प्रवाह 9 के दौरान कई परिसरों के आकलन के लिए अनुमति देता है कि आप में अनूठा है। succinate द्वारा पीछा rotenone के इंजेक्शन परिसर द्वितीय द्वारा संचालित आकलन अधिक से अधिक श्वसन के लिए अनुमति देता है, जबकि पाइरूवेट / Malate + FCCP की प्रारंभिक सब्सट्रेट मिश्रण, परिसर मैं द्वारा संचालित अधिक से अधिक श्वसन के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है। एस्कॉर्बेट का इंजेक्शन द्वारा पीछा Antimycin ए का इंजेक्शन, परिसर III के एक अवरोध, / TMPD एस्कोर्बेट के बाद से परिसर चतुर्थ द्वारा संचालित श्वसन के मूल्यांकन के लिए अनुमति / TMPD एक हैसाइटोक्रोम सी / जटिल चतुर्थ करने के लिए इलेक्ट्रॉन दाता। युग्मन दक्षता पर कोई जानकारी प्राप्त की है, वहीं विधि स्वतंत्र रूप से कई substrates चल रोकता है कि बहुत छोटा सा नमूना आकार के लिए आदर्श है। अंत में, palmitoyl carnitine / Malate के उपयोग β ऑक्सीकरण और पामिटिक अम्ल (β ऑक्सीकरण) के ऑक्सीकरण से उत्पादन को कम करने के लिए बराबर के बाद से आदि के बीच समन्वय के आकलन के लिए अनुमति देता है flavoprotein 15 स्थानांतरित इलेक्ट्रॉन के माध्यम से आदि में फ़ीड। यह युग्मन और इलेक्ट्रॉन प्रवाह assays के कारण भी कुछ हस्तक्षेप (नशीली दवाओं के उपचार, आनुवंशिक हेरफेर) को mitochondrial समारोह में परिवर्तन की पहचान करने के लिए मिलकर में इस्तेमाल किया जा सकता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए।
इन assays के लिए प्राप्त उच्च परिशुद्धता यह प्रोटीन निर्धारण करने के लिए, या सब्सट्रेट समाधान के साथ पहले है, चाहे वह माइटोकॉन्ड्रिया की पूरी तरह से मिश्रण करने के लिए मुख्य कारण है। इन पंक्तियों के साथ, माइटोकॉन्ड्रिया एक बार सब्सट्रेट समाधान में resuspendend हैएनएस, यह एक चौड़ी छिद्र विंदुक टिप के साथ 2.2 चरण में वर्णित के रूप में सेल कल्चर प्लेट लोड करने के लिए अच्छी तरह से पहले इस समाधान का मिश्रण करने के लिए महत्वपूर्ण है। माइटोकॉन्ड्रिया मिश्रण करने में विफलता को अच्छी तरह से परख के भीतर बड़े बदलाव के लिए नेतृत्व करेंगे। इसके अलावा, माइटोकॉन्ड्रिया मिश्रण और जब तक बाल काटना बलों पैदा करेगा एक संकीर्ण छिद्र विंदुक टिप का उपयोग पालन कदम (2.7) भी इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली और साइटोक्रोम सी की रिहाई को नुकसान करने की क्षमता बढ़ जाती है। लंबे / काफी तेजी से भरी हुई सेल कल्चर प्लेट स्पिन करने में विफलता इस प्रकार कुओं और माप के बीच वृद्धि की परिवर्तनशीलता अग्रणी है, अच्छी तरह से करने के लिए माइटोकॉन्ड्रिया की अधूरी पालन में परिणाम होगा।
शेयर और सब्सट्रेट समाधान बनाने के लिए सही सांद्रता / तैयारी तरीकों का उपयोग कर, अच्छी तरह से प्रति माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन की एक अधिकतम राशि लोड हो रहा है, परख रन फेरबदल माइटोकॉन्ड्रियल राज्य पीएलए सुनिश्चित करने के लिए: वर्णित प्रोटोकॉल शामिल करने के लिए अनुकूलित किया गया हैteaus, और mitochondrial शेयर और माइटोकॉन्ड्रियल / सब्सट्रेट घोला जा सकता है की उचित मिश्रण। इन अनुकूलन के प्रयासों से पहले, लेखकों परख समय में नुकसान का सामना करना पड़ा। निम्न समस्या निवारण विधियों / इस प्रोटोकॉल के अनुकूलन में मददगार थे कि संशोधनों पर चर्चा। Microchamber के भीतर ऑक्सीजन निकास और गलत माप को बढ़ावा मिलेगा बहुत ज्यादा माइटोकॉन्ड्रिया लोड करने के दौरान इष्टतम लोड करने के लिए सम्मान के साथ, लोडिंग बहुत कम माइटोकॉन्ड्रिया, एक मजबूत प्रतिक्रिया नहीं देंगे। रोजर्स एट अल 9 microplate आधारित respirometric assays के लिए अच्छी तरह से प्रति माइटोकॉन्ड्रिया का इष्टतम लोड हो रहा है मात्रा का निर्धारण करने के उदाहरण प्रदान करता है। अधिक से अधिक बार बहुत ज्यादा माइटोकॉन्ड्रिया प्रति लोड और साथ ही राज्य से सबूत के 2 दरों 100-200 pmol / मिनट से अधिक / अच्छी तरह से और राज्य 3 दरों> 1500 pmol / मिनट / अच्छी तरह से किया जाता है। (। – 10 माइक्रोग्राम जैसे, 1 के बीच) गतिशील आर भीतर OCRs बटोर ओवर लोडिंग होती है, यदि माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन की एकाग्रता के साथ अलग एक प्रयोगऑक्सीजन की खपत माप मशीन की Ange। तैयारी और substrates और शेयरों की सही सांद्रता का उपयोग अत्यंत महत्व का है। हमेशा substrates / इंजेक्शन के एसिड फार्म का उपयोग करें और पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड या एचसीएल के साथ पीएच को समायोजित; सोडियम बफ़र्स / समाधान की सिफारिश नहीं कर रहे हैं। इसके अलावा, resuspending substrates / DMSO या 100% इथेनॉल में शेयरों माप विफलता या त्रुटि का परिणाम देगा। का उल्लेख किया है, जहां 95% इथेनॉल का उपयोग सुनिश्चित करें। यह palmitoyl carnitine इस प्रकार बड़े परिवर्तनशीलता के कारण जमे हुए शेयर विगलन के बाद 95% इथेनॉल से बाहर वेग के लिए आम बात है। उपयोग करने के लिए अच्छी तरह से पूर्व palmitoyl carnitine शेयर और भंवर गर्म करने के लिए सुनिश्चित करें। इसके अलावा, एक उच्च चर पाइरूवेट / Malate परख परिणाम की वजह से दो सप्ताह पुराना पाइरूवेट शेयर किया जा रहा है> करने के लिए हो सकता है। पाइरूवेट के जमे हुए aliquots हर 2 सप्ताह के रीमेक के लिए सुनिश्चित करें। परख रन माइटोकॉन्ड्रियल राज्य पठारों सुनिश्चित करने के लिए 2 मिनट माप करने के लिए संशोधित किया गया था। एडीपी की थकावट के अवलोकन के वांछित है, शोधकर्ता हो सकता"परख जादूगर" मंच के तहत "प्रोटोकॉल" टैब के तहत माप समय का विस्तार। अंत में, बड़े परिवर्तनशीलता माइटोकॉन्ड्रियल शेयर और माइटोकॉन्ड्रिया प्लस सब्सट्रेट समाधान लोड करने के लिए पूरी तरह से पहले homogenized नहीं कर रहे हैं, जब होता है। कुओं के बीच परिवर्तनशीलता परख चलाने के बाद अधिक है, पूरी तरह से पहले अगले प्रयोग करने के लिए सब्सट्रेट समाधान मिश्रण करने के लिए सुनिश्चित करें। कभी माइटोकॉन्ड्रिया / सब्सट्रेट समाधान भंवर, बल्कि, मुहब्बत हलचल, और धीरे से एक चौड़ी छिद्र विंदुक टिप के साथ triturate।
ध्यान देने योग्य हैं कि इस तकनीक के कुछ सीमाएं हैं। सबसे पहले, इन assays के लिए इस्तेमाल सेल कल्चर प्लेट पर कुओं की संख्या अपेक्षाकृत कम है (यानी।, 24 कुओं और खाली कुओं के लिए नामित कम से कम 2)। यह एक थाली पर इन assays के सभी 5 प्रदर्शन करने के लिए वांछित है, शोधकर्ता एक बार में केवल एक माउस से प्रतिक्रियाओं की जांच करने में सक्षम है। हालांकि, यह 96 के साधन highe के लिए उपलब्ध हैं कि ध्यान दिया जाना चाहिएआर थ्रूपुट। दूसरे, अक्षत कोशिकाओं 1 में की तुलना में अलग-थलग पड़ माइटोकॉन्ड्रिया में mitochondrial रोग का आकलन करने में निहित शक्तियों और कमजोरियों देखते हैं। कुछ कमजोरियों बरकरार कोशिकाओं और अलगाव की प्रक्रिया से उत्प्रेरण कलाकृतियों की तुलना में कम शारीरिक प्रासंगिकता वाले शामिल हैं। अंत में, इस विधि की सफलता माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव की प्रक्रिया की गुणवत्ता पर आकस्मिक है।
इन assays के कुछ या तो विभिन्न प्रणालियों में विकसित किया गया है या अन्य पशु मॉडल में मान्य किया गया है, इस के साथ साथ प्रस्तुत तरीकों के लिए एक बहु अच्छी तरह से ऑक्सीजन की खपत माप मशीन का उपयोग माउस में इष्टतम उपयोग के लिए ऊपर उल्लिखित assays के सभी के संश्लेषण के लिए पहली बार कर रहे कंकाल की मांसपेशी। इस प्रकार कम से कम सामग्री के साथ उच्च throughput प्रदान करने, माउस कंकाल की मांसपेशी के 100 मिलीग्राम – महत्वपूर्ण बात, इन परीक्षणों की सभी 5 ~ 75 से पृथक माइटोकॉन्ड्रिया की राशि के साथ किया जा सकता है। बहुत महत्व है, बहु अच्छी तरह से की क्षमता की वजह सेऑक्सीजन की खपत प्रौद्योगिकियों एक अनुकूलित अलगाव विधि के साथ संयुक्त माइटोकॉन्ड्रिया की न्यूनतम मात्रा के साथ assays के प्रदर्शन करने के लिए, शोधकर्ता कंकाल मांसपेशियों के ऊतकों के शेष के साथ अन्य प्रयोगों (जैसे।, पश्चिमी blots की एक भीड़ प्रदर्शन करने की अनुमति देता है, आरटी पीसीआर, एंजाइमी assays, अक्सर इस पशु मॉडल के साथ एक संघर्ष है, जो आदि),।
अंत में, इस के साथ साथ प्रस्तुत तरीकों माउस कंकाल की मांसपेशी के कम से कम मात्रा में प्रयोग microplate आधारित respirometric assays के एक संग्रह के प्रदर्शन के लिए कदम-दर-कदम निर्देश प्रदान करते हैं। महत्वपूर्ण बात है, प्रस्तुत तरीकों ऊतक और माइटोकॉन्ड्रिया की न्यूनतम मात्रा में आवश्यकता होती है। में महारत हासिल करने के बाद, यहाँ बताया तकनीक शोधकर्ताओं आमतौर पर इस्तेमाल किया पशु मॉडल में माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन की खपत पर एक परिसर या जीन उत्पाद का एक संभावित तंत्र निर्धारित करने के लिए अनुमति देगा।
The authors have nothing to disclose.
The Fralin Life Science Research Institute and The Metabolic Phenotyping Core at Virginia Tech supported this work.
Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | Store at room temperature |
D-Mannitol | Sigma Aldrich | 63559 | Store at room temperature |
Potassium phosphate monobasic, minimum 99.0% | Sigma Aldrich | P5379 | Store at room temperature |
Magnesium chloride hexahydrate, ACS reagent, 99.0-102.0% | Sigma Aldrich | M9272 | Store at room temperature |
HEPES minimum 99.5% titration | Sigma Aldrich | H3375 | Store at room temperature |
EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | Store at room temperature |
Essentially Fatty | Sigma Aldrich | A6003 | Store at 4°C |
Acid Free- BSA | |||
Pyruvic Acid, 98% | Sigma Aldrich | 107360 | Store at 4°C |
Succinic Acid | Sigma Aldrich | S9512 | Store at room temperature |
L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥95% | Sigma Aldrich | M6413 | Store at room temperature |
L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | Store at room temperature |
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma Aldrich | T7394 | Store at room temperature |
99%, powder [TMPD] | |||
Palmitoyl L-carnitine chloride | Sigma Aldrich | P1645 | Store at -20°C |
Oligomycin A, ≥ 95% (HPLC) | Sigma Aldrich | 75351 | Store at -20°C |
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) | Sigma Aldrich | C2920 | Store at 2-8°C |
phenylhydrazone | |||
≥98% (TLC), powder [FCCP] | |||
Antimycin A from streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | Store at -20°C |
Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP] | Sigma Aldrich | A5285 | Store at -20°C |
Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | Store at room temperature |
Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | N/A |