The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.
Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of mitochondrial function in this tissue has become more prevalent. Although many technologies and assays exist that measure mitochondrial respiratory pathways in a variety of cells, tissue and species, there is currently a void in the literature in regards to the compilation of these assays using isolated mitochondria from mouse skeletal muscle for use in microplate based technologies. Importantly, the use of microplate based respirometric assays is growing among mitochondrial biologists as it allows for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. Therefore, a collection of microplate based respirometric assays were developed that are able to assess mechanistic changes/adaptations in oxygen consumption in a commonly used animal model. The methods presented herein provide step-by-step instructions to perform these assays with an optimal amount of mitochondrial protein and reagents, and high precision as evidenced by the minimal variance across the dynamic range of each assay.
Il ruolo fisiologico principale mitocondri muscolari scheletriche è produrre ATP da fosforilazione ossidativa 1. È importante sottolineare che i mitocondri dei muscoli scheletrici svolgono un ruolo specifico nella capacità di esercizio 2, 3 invecchiamento, malattia degenerativa 4 e diabete di tipo II 5. Come una società che invecchia, e diabete di tipo II è il 7 ° causa di morte negli Stati Uniti 6, la necessità di metodi che valutano la funzione mitocondriale è diventato sempre più prevalente nella ricerca biomedica 7,8. In particolare, la misurazione del consumo di ossigeno ha utilità eccezionale per la valutazione della funzione mitocondriale in quanto rappresenta la funzione coordinata tra genomi mitocondriali e nucleari per esprimere i componenti funzionali di fosforilazione ossidativa 9.
Esistono diverse tecnologie che consentono la misurazione del consumo di ossigeno in cellule intatte e isolared mitocondri 7-10. Inoltre, i saggi sono stati sviluppati per più tipi di cellule e tessuti, e in una varietà di specie che consentono la misurazione di percorsi mitocondriali e controllo respiratorio 9,11,12. Tuttavia, non esiste attualmente un vuoto nella letteratura per quanto riguarda la raccolta di tutti questi saggi utilizzando mitocondri isolati da topo muscoli scheletrici per uso in tecnologie di consumo di ossigeno su micropiastra. È importante sottolineare che l'uso di micropiastra saggi respirometrici sta crescendo tra i biologi mitocondriali e consente misurazioni di throughput elevati con quantità minime di mitocondri isolati 9. Pertanto, una raccolta di saggi su micropiastra respirometrici sono stati sviluppati che permettono di individuare dove anomalie e / o adattamenti possono essere presenti nella catena di trasporto degli elettroni (ETC). Inoltre, due saggi respirometriche su micropiastra supplementare sono stati sviluppati che permettono la valutazione del coordinamento between l'acido (TCA) Ciclo tricarbossilici e l'ETC, e tra i ß-ossidazione e la ETC. È importante sottolineare che i metodi presentati forniscono un modo chiaro e conciso per misurare i cambiamenti meccanicistici nella funzione mitocondriale in un modello animale di uso comune.
I metodi presentati in questo articolo forniscono le istruzioni passo-passo per l'esecuzione di una raccolta di saggi su micropiastra respirometrici utilizzando mitocondri isolati 75-100 mg di topo muscoli scheletrici. Questi saggi possono essere eseguite con alta precisione come evidenziato dalla deviazione standard stretto tra i pozzetti in triplicato. È importante sottolineare che questi test permettono di individuare respirometriche di dove anomalie e / o adattamenti possono essere presenti nel ETC, ciclo TCA, β-ossidazione percorso, trasportatori substrato, ecc in un modello animale di uso comune.
E 'importante sottolineare il razionale per l'utilizzo di diversi combustibili e inibitori utilizzati in questo protocollo. Il piruvato / malato e glutammato / malate saggi respirometrici permettono la valutazione del complesso I respirazione mediata, nonché la valutazione dei rispettivi trasportatori, e nel caso di glutammato, deaminasi 15. In alternativa, la combinazione disuccinato / rotenone permette di valutare il flusso respiratoria mitocondriale attraverso Complesso II della ETC da rotenone inibisce complesso I e succinato fornisce elettroni Complesso II attraverso la riduzione della flavina adenina dinucleotide (FADH 2) 15. Questi test forniscono informazioni specifiche substrato da efficienza di accoppiamento e la respirazione massima. Il test di flusso di elettroni è unico in quanto la combinazione di substrati e inibitori permette di valutare più complessi durante flusso respiratoria mitocondriale 9. Il mix substrato iniziale di piruvato / malato + FCCP permette la valutazione della respirazione massima guidato da complesso I, mentre l'iniezione di rotenone seguita da succinato consente la respirazione valutazione massima spinto da Complesso II. L'iniezione di Antimicina A, un inibitore del complesso III, seguito dall'iniezione di ascorbato / TMPD consentono per la valutazione della respirazione guidata da Complesso IV poiché l'ascorbato / TMPD è undonatore di elettroni di citocromo C / Complesso IV. Mentre si ottiene nessuna informazione sulla efficienza di accoppiamento, il metodo è ideale per molto campioni di piccole dimensioni che precludono l'esecuzione di più supporti in modo indipendente. Infine, l'uso di palmitoil carnitina / malato consente la valutazione del coordinamento tra β-ossidazione e l'ETC in quanto l'equivalente riducendo prodotta dalla ossidazione di acido palmitico (β-ossidazione) alimentato nel ETC attraverso l'elettrone trasferimento flavoproteina 15. Va notato che i saggi di flusso di accoppiamento e di elettroni possono essere usati anche in tandem per identificare cambiamenti nella funzione mitocondriale causa di qualche intervento (trattamento farmacologico, manipolazione genetica).
L'elevata precisione conseguito per questi test è dovuto principalmente alla completa miscelazione dei mitocondri, sia prima della determinazione della proteina, o con le soluzioni del substrato. Lungo queste linee, una volta che i mitocondri è resuspendend nel solutio substratons, è fondamentale mescolare questa soluzione accuratamente prima di caricare la piastra di coltura cellulare come descritto al punto 2.2, con una punta foro pipetta allargata. La mancata mescolare i mitocondri accuratamente porterà a grande variazione nel dosaggio. Inoltre, utilizzando un sottile puntale orifizio creerà forze di taglio durante la miscelazione mitocondri e aumenta il potenziale di danneggiare le membrane mitocondriali e il rilascio di citocromo C. La fase aderenza (2.7) è anche un passo fondamentale in questo protocollo. La mancata girare la piastra di coltura cellulare carico lungo / abbastanza veloce si tradurrà in aderenza incompleta dei mitocondri al pozzo, determinando in tal modo una maggiore variabilità tra i pozzi e le misurazioni.
Il protocollo descritto è stato ottimizzato per includere: il caricamento di una quantità ottimale di proteine mitocondriali per pozzetto, utilizzando le corrette concentrazioni / metodi di preparazione per fare azionari e substrato soluzioni, alterando la sessione d'analisi per garantire mitocondriale pla statoteaus, e adeguata miscelazione dei mitocondriali azionari e mitocondriale / substrato mix. Prima di questi sforzi di ottimizzazione, gli autori incontrano insidie nella corsa dosaggio. Di seguito si illustrano i metodi di risoluzione dei problemi / modifiche che erano utile per ottimizzare questo protocollo. Per quanto riguarda il carico ottimale, carico troppo poco mitocondri non suscitare una risposta forte, durante il caricamento di troppo mitocondri, si esaurirà la dell'ossigeno all'interno della microcamera e portare a misurazioni imprecise. Rogers et al 9 fornisce esempi di determinazione ottimale quantità di carico dei mitocondri per pozzetto per micropiastra saggi respirometrici. Più spesso, troppo mitocondri viene caricato per bene come evidenziato dallo stato 2 quote sopra 100-200 pmol / min / bene e stato 3 quote> 1500 pmol / min / bene. Se si verifica sopra caricamento, eseguire un esperimento con diverse concentrazioni di proteina mitocondriale (per esempio tra 1 -. 10 mg) per sollecitare OCRs all'interno r dinamicaange della macchina di misura del consumo di ossigeno. Operazioni preliminari e la corretta concentrazione di substrati e degli stock è della massima importanza. Usare sempre la forma di substrati / iniezioni e regolare il pH con idrossido di potassio o HCl; tamponi di sodio / soluzioni non sono raccomandati. Inoltre, i substrati risospendendo / scorte in DMSO o etanolo al 100% si tradurrà in un fallimento o un errore di misura. Assicurarsi di utilizzare il 95% di etanolo dove indicato. E 'comune per palmitoil carnitina per precipitare fuori dalla etanolo al 95% dopo lo scongelamento dello stock congelato, causando grande variabilità. Assicurarsi di scaldare il brodo palmitoil carnitina e vortice bene prima dell'uso. Inoltre, un piruvato / malato risultato saggio altamente variabile può essere dovuto all'essere piruvato magazzino> 2 settimane di vita. Assicurati di rifare aliquote congelate di piruvato ogni 2 settimane. La sessione d'analisi è stato modificato per 2 min misure per garantire altipiani statali mitocondriali. Se si desidera l'osservazione di esaurimento della ADP, il ricercatore puòestendere il tempo di misura nella scheda "Protocollo" sotto il forum "Assay Wizard". Infine, grande variabilità si verifica quando il azionari mitocondriale e mitocondri più substrato soluzioni non sono omogeneizzati completamente prima del carico. Se la variabilità tra i pozzi è alta dopo la sessione d'analisi, assicuratevi di mescolare completamente la soluzione di substrato prima del prossimo esperimento. Mai vortice le soluzioni mitocondri / substrato, piuttosto mescolare, mash, e triturare delicatamente con la punta della pipetta foro allargato.
Ci sono alcuni limiti di questa tecnica che sono degni di nota. In primo luogo, il numero di pozzetti sulla piastra di coltura cellulare utilizzato per questi test è relativamente bassa (cioè., 24 pozzetti e almeno 2 designata per pozzetti di bianco). Se si desidera eseguire tutti 5 di questi saggi su una piastra, il ricercatore è solo in grado di esaminare le risposte da un mouse alla volta. Tuttavia, va notato che gli strumenti 96 e sono disponibili per higheil throughput r. In secondo luogo, ci sono punti di forza e di debolezza insiti nella valutazione disfunzione mitocondriale nei mitocondri isolati rispetto al cellule intatte 1. Alcune debolezze includono avente rilevanza fisiologica meno rispetto alle cellule intatte e che inducono artefatti dal processo di isolamento. Infine, il successo di questo metodo è subordinato alla qualità del processo di isolamento mitocondriale.
Sebbene alcuni di questi saggi sono stati sia sviluppate in sistemi differenti o sono stati convalidati in altri modelli animali, i metodi qui presentati sono i primi di sintetizzare tutte le saggi suddetti per l'utilizzo ottimale in un multi-well macchina di misura del consumo di ossigeno usando il mouse muscolo scheletrico. È importante sottolineare che tutti e 5 di queste analisi può essere eseguita con la quantità di mitocondri isolati da ~ 75 – 100 mg di topo muscoli scheletrici, fornendo in tal modo un elevato throughput con il materiale minimo. Di grande importanza, la capacità di multi-welltecnologie consumo di ossigeno per eseguire saggi con quantità minime di mitocondri, combinate con un metodo di isolamento ottimizzato, permette al ricercatore di eseguire una moltitudine di altri esperimenti con il resto del tessuto muscolare scheletrico (ad es., western blot, RT-PCR, saggi enzimatici, ecc), che è spesso una lotta con questo modello animale.
In conclusione, i metodi qui presentati forniscono istruzioni passo-passo per l'esecuzione di una raccolta di saggi su micropiastra respirometrici utilizzando quantità minime di topo muscoli scheletrici. Soprattutto, i metodi presentati richiedono minime quantità di tessuto e mitocondri. Una volta masterizzato, le tecniche qui descritte consentiranno ai ricercatori di determinare un potenziale meccanismo di un prodotto composto o gene sul consumo di ossigeno mitocondriale in un modello animale comunemente utilizzato.
The authors have nothing to disclose.
The Fralin Life Science Research Institute and The Metabolic Phenotyping Core at Virginia Tech supported this work.
Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | Store at room temperature |
D-Mannitol | Sigma Aldrich | 63559 | Store at room temperature |
Potassium phosphate monobasic, minimum 99.0% | Sigma Aldrich | P5379 | Store at room temperature |
Magnesium chloride hexahydrate, ACS reagent, 99.0-102.0% | Sigma Aldrich | M9272 | Store at room temperature |
HEPES minimum 99.5% titration | Sigma Aldrich | H3375 | Store at room temperature |
EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | Store at room temperature |
Essentially Fatty | Sigma Aldrich | A6003 | Store at 4°C |
Acid Free- BSA | |||
Pyruvic Acid, 98% | Sigma Aldrich | 107360 | Store at 4°C |
Succinic Acid | Sigma Aldrich | S9512 | Store at room temperature |
L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥95% | Sigma Aldrich | M6413 | Store at room temperature |
L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | Store at room temperature |
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma Aldrich | T7394 | Store at room temperature |
99%, powder [TMPD] | |||
Palmitoyl L-carnitine chloride | Sigma Aldrich | P1645 | Store at -20°C |
Oligomycin A, ≥ 95% (HPLC) | Sigma Aldrich | 75351 | Store at -20°C |
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) | Sigma Aldrich | C2920 | Store at 2-8°C |
phenylhydrazone | |||
≥98% (TLC), powder [FCCP] | |||
Antimycin A from streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | Store at -20°C |
Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP] | Sigma Aldrich | A5285 | Store at -20°C |
Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | Store at room temperature |
Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | N/A |