The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.
Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of mitochondrial function in this tissue has become more prevalent. Although many technologies and assays exist that measure mitochondrial respiratory pathways in a variety of cells, tissue and species, there is currently a void in the literature in regards to the compilation of these assays using isolated mitochondria from mouse skeletal muscle for use in microplate based technologies. Importantly, the use of microplate based respirometric assays is growing among mitochondrial biologists as it allows for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. Therefore, a collection of microplate based respirometric assays were developed that are able to assess mechanistic changes/adaptations in oxygen consumption in a commonly used animal model. The methods presented herein provide step-by-step instructions to perform these assays with an optimal amount of mitochondrial protein and reagents, and high precision as evidenced by the minimal variance across the dynamic range of each assay.
Den huvudsakliga fysiologiska rollen av skelettmuskel mitokondrier är att producera ATP från oxidativ fosforylering 1. Viktigt, skelettmuskel mitokondrier spelar en särskild roll i fysisk kapacitet 2, åldrande 3, degenerativa sjukdomar 4 och typ II diabetes 5. Som ett åldrande samhälle, och typ II diabetes är den 7: e vanligaste dödsorsaken i USA 6, har behov av metoder som utvärderar mitokondriefunktionen blivit allt vanligare i biomedicinsk forskning 7,8. Specifikt mätning av syreförbrukning har exceptionellt stort nyttovärde i bedömningen av mitokondriell funktion eftersom den representerar en samordnad funktion mellan mitokondriella och nukleära genomen att uttrycka funktionella komponenter av oxidativ fosforylering 9.
Flera tekniker finns som möjliggör mätning av syreförbrukningen i intakta celler och isolerad mitokondrier 7-10. Dessutom har analyser utvecklats för flera celltyper och vävnader, och i en mängd olika arter som gör det möjligt att mäta mitokondriella vägar och andningskontroll 9,11,12. Det finns dock för närvarande ett tomrum i litteraturen när det gäller sammanställningen av alla dessa analyser med hjälp av isolerade mitokondrier från mus skelettmuskulatur för användning i mikro baserad teknik syreförbrukning. Viktigt är användningen av mikrobaserad respirometric analyser ökar bland mitokondriella biologer och möjliggör hög genomströmning mätningar med minimala mängder av isolerade mitokondrier 9. Därför var en samling av mikrobaserad respirometric analyser utvecklats som tillåter precisera var avvikelser och / eller anpassningar kan förekomma i elektrontransportkedjan (ETC). Dessutom har ytterligare två mikrobaserade respirometric analyser utvecklats som gör det möjligt att bedöma samordningen between trikarboxylsyra (TCA) cykel och ETC och mellan ß-oxidation och ETC. Det är viktigt att de presenterade metoderna ger ett klart och koncist sätt att mäta mekaniska förändringar i mitokondriefunktion i en vanligt förekommande djurmodell.
De metoder som presenteras i denna artikel ger steg-för-steg-instruktioner för att utföra en samling av mikrobaserad respirometric analyser som använder mitokondrier isolerade 75-100 mg mus skelettmuskel. Dessa analyser kan utföras med hög precision, vilket framgår av den täta standardavvikelse mellan trippelbrunnar. Det är viktigt att låta dessa respirometric analyser precisera var avvikelser och / eller anpassningar kan förekomma i ETC, TCA-cykeln, β-oxidation vägen, substrat transportörer, etc. i ett vanligt förekommande djurmodell.
Det är viktigt att lyfta fram motiven för att använda olika bränslen och inhibitorer som används i detta protokoll. Pyruvatet / malat och glutamat / malat respirometric analyser gör det möjligt att bedöma Complex I medierad andning, samt bedömningen av deras respektive transportörer, och i fallet av glutamat, den deaminas 15. Alternativt kan kombinationen avsuccinat / rotenon möjligt att bedöma om mitokondriell andnings flödet genom Complex II i ETC eftersom Rotenon hämmar komplex I och succinat ger elektroner till Complex II via en minskning av flavinadenindinukleotid (FADH2) 15. Dessa analyser ger underlag specifik information om kopplingseffektiviteten och maximal andning. Analys elektronflöde är unik i att kombinationen av substrat och hämmare gör det möjligt att bedöma flera komplex under mitokondriell andnings flux 9. Den initiala substratblandning av pyruvat / malat + FCCP möjliggör utvärderingen av maximal andning driven av Complex I, medan insprutningen av rotenon följt av succinat möjliggör bedömningen maximal andning drivs av komplex II. Injektionen av antimycin A, en inhibitor av komplex III, följt av injektion av askorbat / TMPD tillåta för utvärdering av andning driven av Komplex IV eftersom Askorbat / TMPD är enelektrondonator till cytokrom C / Komplex IV. Även om ingen information om kopplingseffektiviteten erhålls, är metoden idealisk för mycket små provstorlekar som hindrar kör flera substrat oberoende. Slutligen, användning av palmitoyl karnitin / malat gör det möjligt att bedöma samordningen mellan β-oxidation och ETC eftersom den reducerande motsvarande producerad från oxidation av palmitinsyra (β-oxidation) matas in i ETC genom elektron överföra flavoprotein 15. Det bör noteras att kopplingen och elektronflöde analyser även skulle kunna användas tillsammans för att identifiera förändringar i mitokondriernas funktion på grund av någon intervention (missbruksbehandling, genmanipulation).
Den höga noggrannhet som uppnås för dessa analyser är i första hand på grund av noggrann blandning av mitokondrierna, om det är före proteinbestämning, eller med substratlösningar. Längs dessa linjer, när mitokondrierna är resuspendend i substrat Solutions, är det viktigt att blanda denna lösning noggrant före laddning av cellodlingsplatta som beskrivs i steg 2,2 med en vidgad öppning pipettspetsen. Underlåtenhet att blanda mitokondrierna noggrant kommer att leda till stor variation inom analysen. Dessutom med en smal öppning pipettspetsen skapar skjuvkrafter under blandning mitokondrierna och ökar möjligheterna att skada mitokondriemembranen och frisättning av cytokrom C. vidhäftning steget (2.7) är också ett viktigt steg i detta protokoll. Underlåtenhet att snurra laddade cellodlingsplatta lång / tillräckligt snabbt kommer att leda till bristande efterlevnad av mitokondrier till brunnen, vilket leder ökad variabilitet mellan brunnar och mätningar.
Den beskrivna protokollet har optimerats för att inkludera: laddar en optimal mängd av mitokondrie protein per brunn, med rätt koncentrationer / framställningsmetoder för att göra lager och substratlösningar, förändra analyskörning för att säkerställa mitokondrie statliga plateaus och lämplig blandning av de mitokondriella lager och mitokondrie / substratblandningar. Innan dessa optimering ansträngningar, författarna mötte fallgropar i analyskörning. Följande diskuterar felsökningsmetoder / ändringar som var till hjälp för att optimera detta protokoll. När det gäller optimal laddning, kommer lastning för lite mitokondrier inte framkalla ett robust svar, medan laddar för mycket mitokondrier kommer att uttömma syret i mikrokammaren och leda till felaktiga mätningar. Rogers et al 9 ger exempel på att bestämma optimala påfyllningsmängd av mitokondrier per brunn för mikrobaserad respirometric analyser. Oftare är för mycket mitokondrier laddades per brunn, vilket framgår av tillståndet 2 hastigheter över 100-200 pmol / min / brunn och tillstånd 3 hastigheter> 1500 pmol / min / brunn. Om över lastningen sker, utför ett experiment med varierande koncentration av mitokondrie protein (t.ex. mellan 1 -. 10 mikrogram) för att framkalla OCRs inom det dynamiska range av mätningsmaskinen syreförbrukning. Förberedelser och med rätt koncentrationer av substrat och aktier är av yttersta vikt. Använd alltid syraformen av substrat / injektioner och justera pH med kaliumhydroxid eller HCl; natrium buffertar / är lösningar rekommenderas inte. Dessutom resuspending substrat / lager i DMSO eller 100% etanol kommer att resultera i mätning fel eller fel. Var noga med att använda 95% etanol var noterat. Det är vanligt att palmitoyl karnitin för utfällning ur 95% etanol efter upptining den frusna lager, vilket orsakar stor variabilitet. Var noga med att värma upp palmitoyl karnitin lager och skaka väl före användning. Dessutom kan en i hög grad variabel pyruvat / malat analysresultatet bero på pyruvat lager varelse> 2 veckor gamla. Var noga med att återskapa frysta portioner av pyruvat var 2 veckor. Analyskörning ändrades till 2-min mätningar för att säkerställa mitokondriella statliga platåer. Om observation av konsumtion av ADP önskas forskaren fårförlänga mättiden under "protokollet" -fliken under "Assay Wizard" forum. Slutligen uppstår stora variationer när mitokondriella lager och mitokondrier plus substratlösningar inte homogeniseras fullständigt före laddning. Om variationen mellan brunnarna är hög efter analyskörning, var noga med att helt blanda substratlösningen före nästa experiment. Virvel aldrig mitokondrierna / substratlösningar, snarare rör, mäsk och försiktigt finfördela med en vidgad öppning pipettspetsen.
Det finns vissa begränsningar av denna teknik som är värt att notera. För det första är antalet brunnar på cellodlingsplatta användes för dessa analyser relativt låg (dvs., 24 brunnar och åtminstone två utsedda för tomma brunnar). Om det är önskvärt att utföra alla fem av dessa analyser på en platta, är en forskare endast kunnat undersöka svaren från en mus i taget. Emellertid bör det noteras att 96 brunnar instrument finns tillgängliga för higher genomströmning. För det andra, det finns inneboende styrkor och svagheter i bedömningen av mitokondriell dysfunktion hos isolerade mitokondrier än i intakta celler 1. Vissa brister bland annat att ha mindre fysiologisk relevans jämfört med intakta celler och inducerar artefakter från isoleringsprocessen. Slutligen är framgången för denna metod beroende av kvaliteten på den mitokondriella isoleringsprocessen.
Även om vissa av dessa analyser har antingen utvecklats i olika system eller har validerats i andra djurmodeller, de metoder som presenteras här är de första att syntetisera alla av de ovan nämnda analyser för optimal användning i en fler väl syreförbrukning mätmaskin med musen skelettmuskel. Viktigt är alla fem av dessa analyser kan utföras med den mängd mitokondrier isolerade från ~ 75 – 100 mg av mus skelettmuskel, vilket ger hög genomströmning med minimal material. Av stor betydelse, förmågan hos flera brunnarsyreförbrukning teknik för att utföra analyser med minimala kvantiteter av mitokondrier, i kombination med en optimerad isoleringsmetod, tillåter forskaren att utföra en mängd andra experiment med återstoden av skelettmuskelvävnad (t.ex.., western blöts, RT-PCR, enzymatiska analyser, etc), vilket ofta är en kamp med denna djurmodell.
Sammanfattningsvis, de metoder som presenteras här ger steg-för-steg-instruktioner för att utföra en samling av mikrobaserad respirometric analyser med användning av minimala mängder av mus skelettmuskulaturen. Det är viktigt att de presenterade metoder kräver minimala mängder av vävnad och mitokondrier. När behärskar, kommer de tekniker som beskrivs häri tillåter forskare att bestämma en potentiell mekanism av en förening eller genprodukt på mitokondriell syreförbrukningen i en vanligen använd djurmodell.
The authors have nothing to disclose.
The Fralin Life Science Research Institute and The Metabolic Phenotyping Core at Virginia Tech supported this work.
Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | Store at room temperature |
D-Mannitol | Sigma Aldrich | 63559 | Store at room temperature |
Potassium phosphate monobasic, minimum 99.0% | Sigma Aldrich | P5379 | Store at room temperature |
Magnesium chloride hexahydrate, ACS reagent, 99.0-102.0% | Sigma Aldrich | M9272 | Store at room temperature |
HEPES minimum 99.5% titration | Sigma Aldrich | H3375 | Store at room temperature |
EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | Store at room temperature |
Essentially Fatty | Sigma Aldrich | A6003 | Store at 4°C |
Acid Free- BSA | |||
Pyruvic Acid, 98% | Sigma Aldrich | 107360 | Store at 4°C |
Succinic Acid | Sigma Aldrich | S9512 | Store at room temperature |
L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥95% | Sigma Aldrich | M6413 | Store at room temperature |
L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | Store at room temperature |
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma Aldrich | T7394 | Store at room temperature |
99%, powder [TMPD] | |||
Palmitoyl L-carnitine chloride | Sigma Aldrich | P1645 | Store at -20°C |
Oligomycin A, ≥ 95% (HPLC) | Sigma Aldrich | 75351 | Store at -20°C |
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) | Sigma Aldrich | C2920 | Store at 2-8°C |
phenylhydrazone | |||
≥98% (TLC), powder [FCCP] | |||
Antimycin A from streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | Store at -20°C |
Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP] | Sigma Aldrich | A5285 | Store at -20°C |
Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | Store at room temperature |
Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | N/A |