Abstract
לאחרונה, iPSCs משך תשומת לב כמקור חדש של תאים עבור טיפולי משובי. למרות שהשיטה הראשונית לiPSCs יצירה הסתמכה על fibroblasts עורי מתקבל על ידי ביופסיה פולשנית והחדרה הגנומי retroviral של transgenes, היו מאמצים רבים כדי להימנע מחסרונות אלה. תאי T היקפיים אנושיים הם מקור תא ייחודי ליצירת iPSCs. iPSCs שמקורם בתאי T לכלול ארגון מחדש של הקולטן תא T (TCR) גנים והם מקור של תאי T אנטיגן ספציפי. בנוסף, סידור מחדש קולט תא T בגנום יש הפוטנציאל לתייג שורות תאים בודדות ולהבחין בין תאים מושתלים ותורם. ליישום קליני בטוח של iPSCs, חשוב כדי למזער את הסיכון של חשיפת iPSCs חדש שנוצר לגורמים מזיקים. למרות שתאים בסרום ומזין שור עובריים היו חיוניים לתרבות תאי גזע pluripotent, עדיף להסיר אותם ממערכת התרבות כדי להפחית את הסיכוןשל פתוגניות בלתי צפויה. כדי לטפל בזה, הקמנו פרוטוקול להפקת iPSCs מתאי T היקפיים אנושיים באמצעות וירוס סנדאי כדי להפחית את הסיכון של חשיפת iPSCs לפתוגנים לא מוגדרים. למרות שהטיפול בוירוס סנדאי דורש ציוד עם רמת הבטיחות הביולוגית המתאימה, נגיף מדביק סנדאי מופעל תאי T ללא החדרת הגנום, עדיין עם יעילות גבוהה. בפרוטוקול זה, אנחנו מדגימים את הדור של iPSCs מתאי T היקפיים אנושיים בתנאים ללא מזין באמצעות שילוב של תרבית תאי T מופעלת ווירוס סנדאי.
Introduction
iPSCs משך תשומת לב רבה כמקור פורץ של תאים לרפואת רגנרטיבית 1-3. נכון להיום, שיטות מגוונות ליצירת iPSCs דווחו 4,5. בין אלה, iPSCs שנוצר מתאי T האנושיים היה עניין מיוחד בשל השיטה פחות פולשנית של תא דגימה 6-8. בנוסף, iPSCs שמקורם בתאי T לכלול ארגון מחדש של גן קולט תא T (TCR) ולכן הם מקור לתאי T אנטיגן ספציפי 9,10. לכן, יצירת iPSCs תא נגזר T שימושי להתקדמות רפואת רגנרטיבית בבטחה.
שיטה זו מבוססת על הרעיון של הפחתת הסיכון לפתוגניות בלתי צפויה. ליישום קליני בטוח של iPSCs חשוב כדי להפחית את הסיכון של חשיפה לפתוגנים 11. בעבר במערכות תרבות רבות של תאי גזע pluripotent, תאי סרום ומזין שור עובריים שימשו כמגיב חיוניזה 12. עם זאת, ההסרה של שני חומרים כימיים אלה ממערכת התרבות עדיפה לדור iPSC כדי להפחית את הסיכון של פתוגניות בלתי צפויה.
בנוסף, בשיטה זו יש את היתרון של הימנעות דגימת תאים פולשניים מחולים והכנה מייגע של תאים מזינים. בגלל iPSCs נגזר תא T כבר השתמש בהצלחה במחקר המחלה 13,14, שיטה זו היא גם ישימה ושימושית ליצירת iPSCs הספציפית למחלה של חולים.
בין שיטות תכנות מחדש של תאי T, באמצעות וקטור וירוס סנדאי (שב) ככלי גן הוא שיטה שיכול ליצור iPSCs עם יעילות גבוהה 7,16. בנוסף, בגלל sev הוא וירוס RNA חד-גדילים ולא צריך שלב DNA לשכפול, השימוש בו בדור iPSC ימנע שבירת הגנום מארח 17-19. לכן, הקמנו פרוטוקולים ליצירת iPSCs מתאי T היקפיים אדם בסרום-frוקטורי EE וללא תנאי מזין באמצעות שילוב של matrigel, בינוני mTeSR, ושב.
Protocol
1. הכינו תאי T האדם הופעל
- לאסוף 10 מיליליטר heparinized כל דם מתורם על ידי venipuncture.
- קבלת הסכמה מדעת של תורמים מראש של venipuncture. Venipuncture חייב להיעשות על ידי טכנאי מוסמך ומיומן.
- ידית דגימות דם שהושגו עם ציוד סטרילי והנחיות בטיחות ביולוגית מתאימות הבאות.
- לדלל 10 מיליליטר heparinized כל דם עם 10 מיליליטר D-PBS (-).
- שים 15 מיליליטר פתרון Ficoll (PREMIUM Ficoll-Paque) לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל חדש.
- שכבת פתרון דם 20 מ"ל מוכן בשלב 1.2 על פתרון Ficoll בשלב 1.3. באמצעות פיפטה חשמלית, בואו פתרון דם מוכן בשלב 1.2 לרוץ לאט לאורך הקיר הפנימי של צינור. היזהר שלא לערבב את פתרון הדם ופתרון Ficoll.
- צנטריפוגה ב g × 400 למשך 30 דקות ב RT. קבע את מהירות האטת צנטריפוגלי ל" איטי ".
הערה: לאחר צנטריפוגה, לבן דקשכבה עולה בין שכבה עליונה חלבית פלזמה ושכבה תחתונה Ficoll ברור. שכבה דקה לבנה זה מכילה תאי mononuclear. - מעבירים את שכבת תא mononuclear לצינור חרוטי 50 מ"ל חדש עם טפטפת 1 מ"ל. היזהר שלא כולל פתרון Ficoll.
- להוסיף D-PBS (-) לתאי mononuclear להיקף כולל של 10 מיליליטר, ו צנטריפוגות ב 200 × גרם במשך 5 דקות על RT.
- בטל supernatant. להוסיף 10 מיליליטר של D-PBS (-) לתאי mononuclear, וצנטריפוגות ב 200 × גרם במשך 5 דקות ב RT.
- בטל supernatant, להוסיף 1 מיליליטר של מדיום KBM502 לתאי mononuclear שנאספו, ולספור את התאים באמצעות hemocytometer. ניתן להשיג ב -5 × 10 6 תאי mononuclear מ -10 מיליליטר heparinized כל דם עם הפרדה מתאימה באמצעות Ficoll.
- הכן פתרון נוגדן CD3 אנטי אנושי בריכוז של 10 מיקרוגרם / מיליליטר בD-PBS (-). מוסיף את פתרון נוגדן CD3 אנטי האנושי לצלחת 6-היטב, להשרות את הגלישהאס של כל טוב, ודגירת הצלחת על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2 באינקובטור במשך לפחות 30 דקות.
- הסר את פתרון נוגדן CD3 אנטי אנושי מכל טוב ולשטוף פעם אחת עם D-PBS (-) רק לפני זריעת התאים.
- תאי mononuclear הזרע שהוכנו בשלב 1.9 בצפיפות של 2.5 × 10 5 תאים / 2 סנטימטר על 6 הצלחות גם מצופי נוגדן CD3 אנטי אנושי במדיום KBM502. לדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממת 5% -CO 2 ל3-7 ימים ללא שינוי בינוני עד שתאי T להגיע confluency. תאי T בתקופה זו הם גם תאים מושעים ודבקות.
2. תאי T להדביק אדם עם וקטורי sev
- אחרי תרבות 3-7 ימים, לאסוף את תאי T מופעלים עם קיים בינוני על ידי pipetting. העבר אותם לצינור חרוטי 15 מ"ל ו צנטריפוגות ב 200 × גרם במשך 5 דקות על RT.
- הסר את supernatant ולהוסיף 1 מיליליטר בינוני KBM502 טרי. ספירת התאים וצלחת 1.5 × 10 6 תאים (2 מיליליטר בינוני KBM502 טרי) לבאר כל צלחת 6-היטב מצופה נוגדן אנטי CD3.
- להפשיר את פתרונות sev של OCT3 / 4-sev / TSΔF, Sox2-sev / TSΔF, KLF4-sev / TSΔF, וc-myc (HNL) -SeV / TS15ΔF על קרח.
- הוסף את פתרונות sev מכילים OCT3 / 4-sev / TSΔF, Sox2-sev / TSΔF, KLF4-sev / TSΔF, וc-myc (HNL) -SeV / TS15ΔF בנפרד לבארות, כל אחד בריבוי של זיהום (משרד הפנים) 10. לדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממת 5% -CO 2 לשעה 24 נוספת.
3. הסר את וקטורי sev מתאי T האדם
- 24 שעות לאחר ההדבקה, לאסוף את התאים הנגועים עם טפטפת. אם יש תאי דבקות, הם יכולים בקלות להיות מנותקים pipetting שוב ושוב למעלה ולמטה. העבר אותם לצינור 15 מ"ל חרוטי, וצנטריפוגות ב 200 × גרם במשך 5 דקות על RT.
- הסר את supernatant המכיל וקטורי sev, ולהוסיף 2 מיליליטר בינוני KBM502 טרי. תאי Replate בEACשעות של הבארות. לדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממת 5% -CO 2 ל24 שעות נוספות.
4. תאי reseed על שכבת Matrigel
- הכן פתרון מטריצת קרום במרתף על ידי ג'ל מטריצת הפשרה (עיין ברשימת חומרים למותג הספציפי ששמש במחקר זה) על 4 מעלות צלזיוס והמסת 0.2 מיליליטר ב 10 מיליליטר של מדיום / F12 DMEM.
הערה: מטריקס ג'ל (עיין ברשימת חומרים למותג הספציפי ששמש במחקר זה) צריכה להפשיר O / N ב 4 ° C להיות מופשרים לחלוטין. שמור את זה על קרח עד ממש לפני השימוש. - צלחת פתרון 5 מיליליטר מטריצת קרום במרתף לכל צלחת למאכלי 100 מ"מ ולהשאיר על RT לפחות 30 דקות לפני זריעת תאים. לפחות שתי מנות של 100 מ"מ יש צורך בניסוי אחד.
- איסוף תאים נגועים sev ידי pipetting, להעביר אותם לצינור 15 מ"ל חרוטי, וצנטריפוגות ב 200 × גרם במשך 5 דקות ב RT.
- הסר את supernatant ולהוסיף 1 מיליליטר בינוני KBM502 טרי. לספור את מספר לספירהLLS באמצעות hemocytometer, להסיר את פתרון מטריצת קרום במרתף ממנות 100 מ"מ מוכנים בשלב 4.2 וצלחת 1 × 10 5 ו 1 × 10 6 תאים (10 מיליליטר בינוני mTeSR טרי) על קרום במרתף 100 מ"מ מטריצה מצופה מנות. לבסוף, השתמש בצלחת שבמושבות בקלות הרימו.
- דגירה הצלחת על 37 מעלות צלזיוס ב5% -CO 2 O חממה / N.
- לשנות הבינוני עד 10 מיליליטר בשר בינוני mTeSR בכל יום אחר.
הערה: כ 20-30 ימים לאחר הדבקה, מושבות שדומות מאוד לתאי גזע עובריים (ESCs) יופיע.
5. להרחיב iPSCs תאים שמקורם T
- הכן פתרון מטריצת קרום במרתף על ידי ג'ל מטריצת הפשרה (עיין ברשימת חומרים למותג הספציפי ששמש במחקר זה) על 4 מעלות צלזיוס והמסת 0.2 מיליליטר ב 10 מיליליטר של מדיום / F12 DMEM.
- צלחת 1 מיליליטר של פתרון מטריצת קרום במרתף בכל טוב בצלחת 6 היטב ולהשאיר על RT בלפחות 30 דקות לפני בחירת מושבות.
- מלא את צלחת 96-היטב עם 20 μl של מדיום mTeSR בכל טוב.
- בחר מושבות שדומות ESCs תחת סטראו בעזרת פיפטה 20 μl.
הערה: המושבות של ESCs וiPSCs עגולות ושטוחות, כפי שמוצגים באיור 1. - מושבות העברה נבחרו ל96-גם הצלחת מלאה בינוני mTeSR בשלב 5.3.
- הוסף 200 μl של מדיום mTeSR היטב כל אחד ובזהירות פיפטה למעלה ולמטה כדי לשבור את המושבה לגושים קטנים תחת סטראו בעזרת פיפטה 200 μl. הסר את פתרון מטריצת קרום במרתף ממוכן היטב ב5.2 ואת כל מושבה ולאחת מצלחת 6-היטב מצופה מטריצת הקרום במרתף עם 2 מיליליטר של מדיום mTeSR בכל טוב.
- לשנות הבינוני עד 2 מיליליטר בשר בינוני mTeSR בכל יום אחר.
6. שמרו על iPSCs תאים שמקורם T
יכול להישמר iPSCs התאים שמקורם Tומאוחסן באמצעות אותן טכניקות כמו לiPSCs האנושי וESCs אדם. ברגע שמושבות iPSC לגדול, להרחיב אותם לכלים גדולים יותר על ידי חזרה על אותו התהליך.
- לשנות את מדיום mTeSR כל 1-2 ימים.
- כאשר המושבות הפכו מחוברות כל 5-7 ימים, מעבר התאים באמצעות פתרון ניתוק לiPSCs האנושי וESCs אדם על פי הוראות היצרן.
Representative Results
שימוש בפרוטוקול זה, משתמשים יכולים ליצור iPSCs מתאי T היקפיים אנושיים ביציבות. דור iPSC מתאי T עם sev וmatrigel הראה כ 0.002% -. 0.005% מיעילות של תכנות מחדש של תאים בכמה מקרים בין תורם ושב לא התגלו לאחר כמה קטעים 16 איור 1A מראה סכמטי של הפרוטוקול להפקת T תא נגזר iPSCs בתנאים ללא מזין באמצעות matrigel ובינוני mTeSR. סביב 20-30 ימים לאחר הדבקה עם sev, מושבות iPSC מוכרות על ידי המורפולוגיה כמו המושבה-ESC (איור 1). מכתים immunofluorescence חשף ביטוי של סמני תא pluripotent טיפוסיים (NANOG, OCT3 / 4, SSEA4, TRA-1-60, וTRA-1-81) בiPSCs תאים שמקורם T שנוצרו בתנאים ללא מזין (איור 1 ג).
"= רוחב" 700 "/>
איור 1. (א): סכמטי של הפרוטוקול לתאי T תכנות מחדש בתנאים ללא מזין במחקר זה. (ב): מושבה iPSC כמו ESC טיפוסי ביום 27 אחרי דגימת דם בתנאים ללא מזין. (ג): צביעת ALP ומכתים immunofluorescence עבור סמני pluripotency ומשטח (NANOG, OCT3 / 4, SSEA4, TRA-1-60, וTRA-1-81) בiPSCs תאים שמקורם T שנוצרו בתנאים ללא מזין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Disclosures
יש הסופרים לא מתחרים או סותר אינטרסים לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים יושיקו מיאקי, סאיאקה Kanaami, צ'יהאנה Fujita, Miho ימגוצ'י, נאטסוקו Henmi, וריי אונו מבית הספר לרפואה של אוניברסיטת קיו לקבלת סיוע טכני. עבודה זו מומנה בחלקו על ידי תכנית מו"פ מערכות תמיכה כדי להאיץ את השימוש המעשי של תוצאות מחקר בריאות, ותכנית לכביש למימוש רפואת רגנרטיבית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PREMIUM | GE Healthcare | 17-5442-02 | |
| Purified NA/LE mouse anti-human CD3 | BD Pharmingen | 555336 | |
| Bovine albumin fraction V solution | Gibco | 15260-037 | |
| mTeSR1 medium kit | STEM CELL | 5850 | Warm at room temperature before use |
| Dissociation Solution | ReproCELL | RCHETP002 | |
| D-PBS(–) | Wako | 045-29795 | |
| SeV Vector kit CytoTune-iPS ver.1.0 | DNAVEC | DV-0303c | Thaw on ice before use |
| 100-mm tissue culture dish | Falcon | 353003 | |
| 96-well tissue culture plate | Falcon | 353078 | |
| 6-well tissue culture plate | Falcon | 353046 | |
| 15 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| 50 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 227261 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Hayes, M., Zavazava, N. Strategies to generate induced pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 1029, 77-92 (2013).
- Gonzalez, F., Boue, S., Izpisua Belmonte, J. C. Methods for making induced pluripotent stem cells: reprogramming a la carte. Nat Rev Genet. 12, 231-242 (2011).
- Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
- Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
- Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 114-126 (2013).
- Vizcardo, R., et al. Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cells from iPSCs Derived from Mature CD8 T Cells. Cell Stem Cell. 12, 31-36 (2013).
- Sampsell-Barron, T. Xeno-free adaptation and culture of human pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 1001, 81-97 (2013).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Minegishi, Y., et al. Enhanced optineurin E50K-TBK1 interaction evokes protein insolubility and initiates familial primary open-angle glaucoma. Hum Mol Genet. 22, 3559-353367 (2013).
- Tanaka, A., et al. Endothelin-1 induces myofibrillar disarray and contractile vector variability in hypertrophic cardiomyopathy-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Am Heart Assoc. 3, e001263 (2014).
- Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24, 185-187 (2006).
- Kishino, Y., et al. Derivation of transgene-free human induced pluripotent stem cells from human peripheral T cells in defined culture conditions. PLoS One. 9, e97397 (2014).
- Masaki, I., et al. Recombinant Sendai virus-mediated gene transfer to vasculature: a new class of efficient gene transfer vector to the vascular system. FASEB J. 15, 1294-1296 (2001).
- Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. J Virol. 74, 6564-6569 (2000).
- Ikeda, Y., et al. Recombinant Sendai virus-mediated gene transfer into adult rat retinal tissue: efficient gene transfer by brief exposure. Exp Eye Res. 75, 39-48 (2002).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).
- Macarthur, C. C., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions. Stem cells Int. , 564612 (2012).
- Iida, A. Sendai virus vector: vector development and its application to health care and biotechnology. Uirusu. 57, 29-36 (2007).
- Yoshida, K., et al. In vivo repopulation of cytoplasmically gene transferred hematopoietic cells by temperature-sensitive mutant of recombinant Sendai viral vector. Biochem Biophys Res Comm. 361, 811-816 (2007).
- Bitzer, M., Armeanu, S., Lauer, U. M., Neubert, W. J. Sendai virus vectors as an emerging negative-strand RNA viral vector system. J Gene Med. 5, 543-553 (2003).
- Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus. Nat Protoc. 7, 718-728 (2012).
- Okano, S., et al. Recombinant Sendai virus vectors for activated T lymphocytes. Gene Ther. 10, 1381-1391 (2003).
- Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31 (3), 458-466 (2013).
- Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genom Proteom Bioinform. 11 (5), 264-274 (2013).
- Su, R. J., Neises, A., Zhang, X. B. Generation of iPS Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors. Methods Mol Biol. , (2014).
